谈谈高中“多聚酶链式反应扩增DNA片段”实验

２００７年第４２卷第１期　生物学通报　３１　谈谈高中“多聚酶链式反应扩增ＤＮＡ片段”实验　黄群声　（华南师范大学生命科学学院　广东广卅Ｉ　５１０６３１）　目前高中生物课标教材已经陆续在全国实验区　开始实验了。为了使广东省的高中生物学教师尽快进　入课改角色，我院针对人教版《普通高中课程标准实　验教科书生物》的选修模块之一：“生物技术实践”中　的实验内容举办了多次培训．因此笔者有机会对高中　程的比色杯只需１．５　ｍＬ溶液就能达到一定要求的液　面高度，从而节省不少的样品材料和开支。　３　ＰＣＲ产物检测手段　ＰＣＲ产物的检测有很多种方法。对于中学来说，考　虑到学校的经费和学生的认知水平、心理特点等原因，　生物学新课标实验教科书有所了解和接触。现就该书　中“多聚酶链式反应扩增ＤＮＡ片段”实验谈谈自己的　一些看法，以供同行参考和商榷。　１　关于ＤＮＡ含量计算公式　新课标实验教科书选修模块关于“多聚酶链式反应　扩增ＤＮＡ片段”实验，教材显示，ＤＮＡ含量计算公式为：　ＤＮＡ含Ｉ（Ｉｘｇ）－５０￣（２６０　ｎｍ的读数１×稀释倍数。笔者认　为此公式存在不太严谨的漏洞，首先ＤＮＡ含量单位ｆ或　称浓度单位）应更正为“Ｉ￣ｇ／ｍＬ”，其次是此公式应改为：　“ＤＮＡ浓度（　ｇ／ｍＬ）＝５０×（２６０　ｎｍ的读数）×稀释倍数／Ｌ”　比较规范和灵活。我们知道公式中的“５０”为测定标准品　ＤＮＡ浓度的一个经验值，定义为：ｌ　Ｉｘｇ／ｍＬ的ＤＮＡ钠盐　在光程为ｌ　ｃｍ比色杯中的吸光值（Ａ　为０．０２，据此得　到当Ａ蛳　＝ｌ时，ＤＮＡ浓度为５０￣ｇ／ｍＬ。式中的“Ｌ，，代表　比色杯的光程（泛指比色杯的厚度），当测定样品太少，不　能用光程１　ｃｍ比色杯进行测定时，就要考虑用光程　０．５　ｃｍ的比色杯．此时如果照搬教材中的公式计算ＰｃＲ　产物的浓度势必造成很大的误差。　２　比色杯的使用　值得注意，用紫外分光光度法检测ＰＣＲ产物时，要　使用石英比色杯．因为石英比色杯不吸收紫外线，而一　般的比色杯含有吸收紫外线的杂质。另外还要注意样　品加入比色杯的液层高度一般要达到杯的２／３高度为　好（由仪器构造决定），倘若比色杯中液面太低，光束　就有可能从部分液层中（吸收池）透过，甚至全部从空　气层透过。这样光电管接受到的光信号是失真的，因此　检测器显示出来的吸光值不能代表真实值。在此还建　议在进行ＰＣＲ产物的检测时，用规馅为０．５　ｃｍ的石　英比色杯作为吸收池（因一般常用的紫外可见光分光　光度计，所配给的比色杯规格有０．５　ｃｍ和ｌ　ｃｍ），因为　通常分子生物学实验所得到的ＤＮＡ样品都是较少　的，如，ＰＣＲ反应每一反应管的总体积通常为５０　Ｌ，　按实验教科书上的指导将ＰＣＲ产物稀释５０倍后进行　检测，亦只有２．５　ｍＬ溶液，而光程为１　ｅｍ的石英比　色杯，达到２／３的液层高度约要３　ｍＬ溶液，０．５　ｃｍ光　笔者认为除新实验教科书中介绍的用紫外分光光度　法检测ＰＣＲ产物外，更好的检测方法是教师用书中介　绍的琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，此法既简单、直　观又能说明问题。其优点是：可视性强。通过设置阴性　对照和与ＤＮＡ标准分子量比较可直接观察到ＰＣＲ扩　增结果，成败与否一目了然。而用紫外分光光度法检测　ＰＣＲ产物有一定局限性，只能感知ＤＮＡ含量的增加，　但是否为特异性产物或非特异性产物无法知道。另外　从经济角度看，买一台经济型的紫外／可见光分光光度　计的价钱就足以购买一台适用于蛋白质和核酸检测　的电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。当然，对资金状况较　好的学校能对２种检测手段都尝试，收到的教学效果　肯定会更好。　４　ＰＣＲ反应试剂　笔者认为教师用书中的“多聚酶链式反应扩增ＤＮＡ　片段”实验案例对一般中学来说，有一定的实施难度。　如果是单纯以验证实验的目的出发，建议采用一种由　ＴａＫａＲａ公司生产的ＰＣＲ试剂盒（货号：ＤＲ０１１，价格：５００　元．网址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏｒｎ．ｃｎ）．此试剂盒包含ＰＣＲ　反应所需的全部试剂：ＤＮＡ模板、４种ｄＮＴＰ、引物３　条、ＰＣＲ缓冲液、Ｔａｑ聚合酶和ＤＮＡ标准分子量等。以　５０　Ｌ为反应总体积，此试剂盒为２００次用量。我们的　经验是，在学生实验前。将各试剂按一定比例用灭菌双　蒸水ｆ或市售纯净水）稀释（如稀释ｌＯ倍），可减少量液误　差和分装时带来的损失。此试剂盒含有支配反应的　ｋＤＮＡ模板以及扩增ｋＤＮＡ的５００　ｂｐ和６　０１２　ｂｐ目的　片段的引物．而５００　ｂｐ的片段扩增所耗的时问较少，特　别适合作为验证性实验用，以及因陋就简用水浴锅代　替ＰＣＲ扩增仪时使用。另外值得一提的是，为了安全起　见，核酸染料可用ＥＢ替代产品，如ｇｏｌｄｖｉｅｗ等。　主要参考文献　１　许秀珍．梁山．生物化学与分子生物学实验指导．广州：暨南大学　出版社．２００３：４Ｏ一４１．　（Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｑｓ４２＠１２６．ｔｏｍ）　ｆＢＺ）