时间分辨荧光免疫分析仪器测量时间精度的提高

Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ＆Ｓａｆｅｔｙ　ｆ质控与安全　时间分辨荧光免疫分析仪器测量时间精度的提　潘德辉，陈斌，金鹏，张文超　（辽宁石油化工大学信息与控制工程学院，辽宁抚顺１１３００１）　［摘要】　介绍了时间分辨荧光免疫分析（Ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｎｕｏｍｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＴＲＦＩＡ）的基本工作原理，分析了影响测量　时间（ｔｃ）精度的主要因素，针对这些影响因素，采用了ＴＸ２１０８温度补偿晶体振荡器和双游标法提高测量时间精度的　措施。最终．在保证同样测量精度的前提下．将所需测量次数由１　０００次减少到１２０次　ｆ关键词】时间分辨；荧光免疫分析；测时精度；游标　【中图分类号】ＴＨ７７６　【文献标志码】Ｂ　【文章编号】１００３—８８６８（２００８）０７—０１０９—０３　Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｉｍｅ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ　Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ＰＡＮ　Ｄｅ—ｈｕｉ，ＣＨＥＮ　Ｂｉｎ，ＪＩＮ　Ｐｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ—ｃｈａｏ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｓｈｕｎ　１１３００１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　Ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ　Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＴＲＦＩＡ）ｉｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｗａｙｉｎｇ　ｔｉｍｅ（ｔｃ）ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ａｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　Ｔｉｍｅ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｉｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＴＣＸＯ（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｓ）ａｎｄ”ｄｏｕｂｌｅ　ｖｅｒｎｉｅｒ”ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｔｉｍｅｓ　ａｒｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｆｏｒｍ　１　０００　ｔｏ　１２０．［Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，２９（７）：１０９－１１１】　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ；ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ｔｉｍｅ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ；ｖｅｒｎｉｅｒ　时间分辨荧光分析技术是一种以镧系元素螯合物（Ｅｕ　）　在激发后的２００～６００　Ｓ区间的某一时刻ｔ　（例如ｔｃ＝４００　ｓ）来　为标记物．测量其发射荧光的超灵敏无放射性污染的免疫标　测量Ｅｕ３＋的荧光值．就可以避免本底荧光的干扰．并推算出　记分析技术，在生物、生化分析和生命科学仪器中得到了广　激发时刻被测生物或生化样品中的特异荧光值　进一步可得　泛的应用　到被测生物或生化样品中的信息（如目标ＤＮＡ的含量）。　采用含有紫光或紫外光的高能谱光脉冲激发含有镧系　可见，如果每次的ｔ　不精确，则测量的荧光信号值就不　荧光素（Ｅｕ　）作为标记物的生物或生化样品．以激发那一时　准确　由于含有Ｅｕ　的生物或生化样品性能稳定．所以可以　刻为时间基点．利用镧系元素螯合物荧光衰变时间长的特　反复激发。目前业内，几乎都是采用在１　Ｓ内多次（１　０００次）　点，延时一段时间ｔ　（如图１）后再去测量被激发的荧光信号，　测量后取平均值的方式来弥补测量时间ｔ　的漂移　这显然增　以有效躲开激发光和本底荧光噪声对测量的影响．从而大大　加了全部样品的测量时间，在大样品量（大“通量”）测量时就　提高了测量灵敏度　显得尤为突出　影响ＴＲＦＩＡ仪器测量精度的因素很多．其中　延后测量时间ｔ，的精确控制是其中的一个主要因　、　素，就影响时间测量精度的主要因素进行了分析．　＼　脉冲激发光　、　采用游标法提高了测量时间ｔ　的定时精度．从而　本底荧光　可在此时间段　、　／　、＿　　＼　、　提高了整个仪器的测量精度　＜　标记物荧光　内的ｔ／　测量待分析物　　时刻来　＼　嚼　的荧光强度。　＇、＾ｌ＼　１　ＴＲＦｌＡ基本原理ｐ】　＼ｔｃ　＿＿、Ｉ＼、　如图１所示．由脉冲氙灯发出的１　ｋＨｚ的全　、　１－＇　－＿　～～—　光谱脉冲激发光．经聚光和滤光后．形成频率　＼　ｆ－　～＿　｜　｛　１　ｋＨｚ、中心波长为３４０　ｎｍ及带宽为＋６０　ｎｍ的激　延迟时间Ｉ　测定时间　恢复时间　ｔ／ｐ　发光束。此脉冲激发光束照射到生物或生化样品　）　２００“　６《　）０　１（　ｌ０ｏ　上，同时激发出本底荧光和激发样品中的Ｅ　３＋发　出中心波长为６１３　ｎｍ的特异标记物荧光　图１时间分辨荧光测定原理图　因本底荧光衰减很快，而Ｅｕ　的荧光衰减较慢．这样我们　可见，如果能够保持每次的ｔ　值基本不变（很精确），则　每次测量值偏离平均值的离散程度就小得多．故可用较少次　收稿日期：２００８－０１—０２修回日期：２００８—０２—２０　作者简介：潘德辉（１９８２一），男，辽宁大连人．硕士，主要从事生命科学　数求平均值即可。　方面的研究　２影响测量时间ｔ　精度的主要因素分析　医疗卫生装备‘２００８年７月第２９卷第７期１　ｎＱ　ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｌｃａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｊｏｕｍａｌ・ｖｏＩ２９ＮＯ．７　Ｊｕｌｙ２Ｏ０８　Ｉ　Ｕ√　维普资讯 http://www.cqvip.com 质控与安全｛Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ＆Ｓａｆｅｔｙ　要想提高ｔ。的控制精度就要提高ｔ。的测量精度。如图２　控晶体振荡器（ＶＣＸＯ）、温补晶体振荡器（ＴＣＸＯ）、恒温晶体　振荡器（ＯＣＸＯ），以及数字补偿晶体振荡器（ＤＣＸＯ）。　就准确度而言．ＸＯ的频率准确度为１０　．ＴＣＸＯ和　ＶＣＸＯ的频率准确度为ｌ０　．ＯＣＸＯ和ＤＣＸＯ的频率准确度　可达１０　１Ｏ　所示，一般是在ｔ。时刻发出激发光的同时开始对时基信号脉　冲　（　）计数，例　如采用１　ＭＨｚ的　时基信号．脉冲　一～一　周期为　１　ｓ．若　除准确度外．稳定性也是晶振的主要性能指标　对于频　率稳定度要求＋２０　ｐｐｍ或以上的应用．可使用ＸＯ　对于介于　（＋＿１２０～＋２０）ｐｐｍ的稳定度．应该考虑ＴＣＸＯ　对于低于±１　ｐｐｍ的稳定度．应该考虑ＯＣＸＯ和ＤＣＸＯ　：　ＪＡｔ　　“　Ａｔ　？：　想得到ｔｃ＝４００　ｓ．　则需在计数器由　初值０加ｌ计数　图２计数器量化误差示意图　到４００时ｆ或采　ＯＣＸＯ和ＤＣＸＯ性能最好但价格贵．ＸＯ的准确度和稳　定性都较差　故选择ＴＣＸＯ．采用ＴＸ２１０８温补晶体振荡器可　满足要求．其指标如下表１　用减１计数器．　由初值４００减１计数到０时）发出测量荧光信号的测量脉冲　（计数值Ⅳ＝　ｚ　）。理想情　表１　ＴＸ２１０８主要性能指标　况下．确实可　以通过控制　计数器的计　数值Ⅳ来控　制测量时间ｔ　。但实际上存在计时误差，主要因素有：量化误　差、触发误差、时基信号误差　（１）量化误差。如图２，由于计数值Ⅳ为整数，时基脉冲　和　必然产生“截断误差”，该误差即为“量化误差”，也称为　“±１误差”。　采用ＴＣＸＯ后，频率准确度提高了一个数量级（从１０－５　提高到１０　）．频率稳定性从±２Ｏ　ｐｐｍ提高到±８　ｐｐｍ（实测　值）。对仪器整机测量精度的提高程度，见讨论与结论部分　３＿２减小触发误差的措施　激发光的产生和荧光信号的测量都需要软硬件配合在ｔ　和ｔ　时刻准确地触发执行　量化误差并非由于计数值Ⅳ的不准确造成．而是由于计　数闸门开启和关闭的时间与时基信号不同步引起（亦即开门　和关门时刻与时基信号出现的时刻是随机的）．使得在闸门　开始和结束时刻有一部分时间“零头”没有被计算在内而造　成的测量误差　图２中０和ｂ表示不同计数起始时刻．则对　在硬件上．单片机采用ＲＩＳＣ结构的高速单片机．外围硬　件采用性能较好的７４ＨＣ系列的ＨＣＭＯＳ型器件　３．３减小量化误差的措施　减少量化误差的方法很多．如：多周期同步测量、模拟内　同一时基信号．在相同的闸门时间内．计数结果就不同　由图　２可见．　（Ⅳ＿１）　≤ｔｏ＋Ａｔｉ—Ａｔ２≤（Ⅳ＋１）　插法、平均法和游标法　其中周期同步测量和模拟内插法步　骤繁杂且需要较为复杂的硬件系统．特别是模拟内插法需要　利用模拟电路的充放电来实现时间的扩展，电路复杂并且需　要模数转换电路　平均法是对同一时间进行ｎ次测量后取平　或Ⅳ－一１≤（ｔｏ＋Ａ　广Ａｔ２）／　≤Ⅳ＋１　（１）　因此．量化误差的影响相当于计数值Ⅳ的“±１”个字　（２）触发误差。有３个方面：一是触发计数器对时基信号　计数产生的误差；二是在ｔ　时刻产生激发光时的误差；二三是在　均，根据测量理论，其误差仅是单次测量的１／、／　。但ｎ次　测量将占用宝贵的机时．影响测量速度．特别是在大通量的　生化试验或实验中对测量速度的影响尤为显著　所以我们选　ｔ　时刻发出测量指令的误差　在单片机为核心的电子系统中，３　个误差与软硬件均有关。ｔ　的误差还与量化误差有关　用了精度较高且较为容易实现的游标方法进行测量时间ｔ　的控制。　３．３．１　游标法的原理［５１　（３）时基信号误差　主要由时基信号频率＾和稳定度决　定。ｒＮ是测量时间ｔ　基准，可用单片机本身时钟信号，也可用　经过稳频的晶体振荡器作为时基信号　因此，其准确度和测　量时间之内的短期稳定度将直接影响测量结果。　通常．要求时基信号频率误差小于测量误差的一个数量　级且具有较高稳定性。　３提高测量时间ｔ　精度的措施　数字式游标法实现的原理和游标卡尺的原理相似．是利　用相差很微小的２个量．对其量化单位以下的差值进行多次　的叠加．直到叠加的值达到一个量化单位为止．通过相关的　计算便可以获得较精确的差值　设主时钟频率　，＝１／Ｔｏ　和游标时钟　＝１／　，　。　（Ｔｏ。＜　），且　。和　非常接近，即差值△　＝Ｔ￣－Ｔｏ。很小。例　如，Ｔｏ。＝１０　ｎｓ，　＝１ｌ　ｎｓ，则△Ｔｏ＝　。：１　ｎｓ。为进一步提　量化误差是主要影响因素．先简要介绍时基信号误差和　触发误差减小方法．再重点论述减小量化误差的措施　３．１减小时基信号误差的方法　高精度我们采用双游标法．其工作原理如图３　设开门与关门时的２个“零头时间”为　、　，开门后同时　时基信号源一般都采用石英晶体振荡器．但晶振频率易　受温度影响　有５种类型的晶体振荡器　：普通晶振（ｘｏ）、压　肩动主计数器和游标脉冲１计数，由于　＞Ｔｏ　，设经过Ⅳ　个　计数值后．游标脉冲与主脉冲重合（图中符合点１）。此时：　１　１　ｎ医疗卫生装备・２００８年７月第２９卷第７期　ｌ　ｌ　Ｖ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＭｅｄｉｃａＩ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　ＪｏｕｒｎａＩ・Ｖｏｌ　２９　Ｎｏ　７　Ｊｕｌｙ　２００８　维普资讯 http://www.cqvip.com

Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ＆Ｓａｆｅｔｙ　Ｉ质控与安全　启动脉冲　计时脉冲　—　——停止脉冲　５、６中的纵轴是归　一化后的数值　图４为传统的　１．０５　ｌ　　开门脉冲Ｑ，　—一　————　　Ｊ符合点：　！　撼鞣２００　４００　６ｏｏ　　８００　ｌ　０００　采用普通晶振（ＸＯ）　且不采用提高测时　精度措施的情况．　亦即业内目前流行　的测量１　０００次取　平均值的方法．均　值为０．９９８　８　开门脉冲Ｑ２　０．９５　一　主时钟　游标脉冲　游标脉冲　！　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｉ２　Ｉ　３１　４｜５　１６　１　７１｝ｉ　９　ＩＩ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｌ。１４　ｉ５　节—　』０７　０　　Ｎ２＝６　图４传统方法需要测量１　０００次　』皿　ｊ一　　符　点ｌＩ　ｌ●　Ｉ：Ｉ　３Ｉｌ　ｌ　５ｌ＿　　＿　，　１．０５　ｌ　图３双游标法测时的原理　ｒ１＋　Ｔｏ１＝Ｎ１　图５为仅采用　温度补偿晶体振荡　器（ＴＣＸＯ）但不采　用双游标法时的情　况．测量次数减少　到５１０次．均值为　０．９９９　６。　０．９５　誊壤　器　ｌ００　２ｏｏ　３ｏｏ　４００　５ｏｏ　；　０　即：　ｒＩ＝Ｎ１（　一Ｔｏ１）＝Ｎ１△Ｔｏ　图５仅采用ＴＣＸＯ时测量次数减少到５１０次　。　同样．在关门时（主时钟计数停止）启动游标脉冲２开始　计数，由于　＞　，设经过　个计数值后，游标脉冲与主脉冲　重合（图中符合点２）。此时，有：　ｒ：＝　（　一　）＝Ｎ２△Ｔｏ　则．被测时间间隔为：　ｒ　＝７　＋　ｒ１一　ｒ２＝　Ｔｏ１＋（Ｎ１一　）△　・．　：　．，　＂　，１．０５　’・　．．　ｔ＂　ｙｙ３　ｖｓ．ｔ　图６为既采用　ｌ　・　．．　：　一・；一．０　‘　温度补偿晶体振荡　器（ＴＣＸＯ）又采用　０　９５　●　●　＋　一　：　・二　．　ｌ　０　２０　４０　６０　８０　１００　１２Ｏ　定义扩展系数Ｋ为：　Ｋ＝：Ｔｏ　／△ＴＯ＝Ｔｏ　／（　一　）　双游标法时的情　况．测量次数减少　图６采用ＴＣＸ０和游标法测时时仅需１２Ｏ次　则游标时钟周期用Ｋ可表示为：　＝到１２０次，均值为０．９９９　８。　可见．在保证同样测量精度情况下．采用温度补偿晶体　振荡器（ＴＣＸＯ）措施和采用双游标法测时措施，可以大大减　少测量次数。从另一方面看，还是测量１　０００次，可以在较大　（１＋１　）　而△Ｔｏ＝　一Ｔｏ　＝Ｔｏ　／Ｋ。　于是．被测时间间隔可写成：　ｒ　＝　Ｔｏ　＋（Ｎ广Ｎ２）Ｔｏ　／Ｋ＝（　＋（　一　）　）　＝程度上提高测量精度。　（Ⅳ　＋Ⅳｒ＿　）　可见，数字游标法将测时分辨力由　频得到１　ＭＨｚ的时标信号作为主时钟　提高到了　。　【参考文献】　【１］周伟玲，赵启仁．时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用【Ｊ】．　国际放射医学核医学杂志，２００６．３０（２）：１０３—１０６．　在仪器中选用１０　ＭＨｚ的ｒｒ）（２１０８温补晶振经过１０分　采用双游标法后，主时钟频率ｆｏ１＝１ＭＨｚ，△　＝ｌｎｓ数字　游标法将测时分辨力由ｌｘｌＯ￣ｓ提高到了ｌｘｌ０＊Ｓ　ｏ　４讨论和结论　［２］杭建峰，吴英松，李明．时问分辨荧光免疫分析的研究进展及应　用【Ｊ】．热带医学杂志，２００４，４（３）：３０４，３４０—３４３．　【３］　田振，朱延彬，郭周义．一种灵敏的时间分辨荧光免疫分析仪【Ｊ】．　光电子激光，２００６，１７（９）：１　１４６—１　１４９．　采用温度补偿晶体振荡器（ＴＣＸＯ）和采用双游标法后．　仪器整体性能提高的程度．若进行理论分析是一件较难也很　费篇幅的事情。我们利用比对方法．采用同样的标准试样．在　保证同样测量精度条件下，对采用温度补偿晶体振荡器（　）　和采用采用双游标法前后，所需测量次数进行了比较。图４、　【４１　Ｂｉｌｌ　Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ．晶振的选￣［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｓｐａｃｅ．ｅｄｎｃｈｉｎａ．ｔｏｍ／　Ｕｐｌｏａｄ／晶振的选择．Ｄｄｆ．　【５］宣湘，潘必卿，施昌彦．现代计量学概论【Ｍ］．北京：中国计量出　版社．２００３：４３５—４６１。　《现代医用电子仪器原理与维修》一书出版发行　该书由多年从事医用电子仪器教学与维修工作的专家编写．　原理清楚，机型先进，内容丰富，具有先进、系统、实用的特点　既可　以作为大专院校生物医学工程专业的教材．也可作为医学工程技　术人员的技术培训教材及参考用书　该书由电子工业出版社出版．采用国际标准大ｌ６开本．共计　３２８页，售价４５元（含包装挂号邮寄费），欲购者请与本社发行部联　系，地址：天津市河东区万东路１０６号，邮编：３００１６１，电话：（０２２）　８４６５６８２５　医疗卫生装备・２００８年７月第２９卷第７期１　１　１　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＭｅｄｌｃａＩ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｊｏｕｍａ卜Ｖｏ１．２９　ＮＯ　７　Ｊｕｌｙ　２００８　Ｉ　Ｉ　Ｉ