一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1071778 A(43)申请公布日 2017.09.19

(21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26

(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司

地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路

88号(72)发明人 王冶陶　吴忠福　彭昉　刘慧显　

王俊俊　俞英豪　(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司

11332

代理人 巩克栋(51)Int.Cl.

C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书2页 说明书6页 附图2页

A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)

()发明名称

一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要

具体涉及一本发明涉及细胞免疫治疗领域，

种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

CN 1071778 ACN 1071778 A

权　利　要　求　书

1/2页

1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD8的比例为(1-5):(0.5-3):1，优选为(1-3):(0.8-2):1，进一步优选为2:2:1；

优选地，所述混合物的添加量为10-1000pM，优选为100-800pM，进一步优选为300-500pM。

3.根据权利要求1或2所述的培养体系，其特征在于，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80为表达在宿主细胞中，优选共表达在同一个宿主细胞中；

优选地，所述白细胞介素12为由白细胞介素12A和白细胞介素12B组成；优选地，所述宿主细胞为K562细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养体系还包括白细胞介素2；

优选地，所述白细胞介素2的添加量为50-400U/mL，优选为80-200U/mL；优选地，所述培养体系还包括培养液；优选地，所述培养液为RPMI10和1-10％人血清或RPMI10和1-10％胎牛血清。5.根据权利要求1-4中任一项所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括培养液、K562细胞和白细胞介素2；

其中，所述培养液为RPMI10和1-10％人血清或RPMI10和1-10％胎牛血清，所述K562细胞包括白细胞介素21、白细胞介素12A、白细胞介素12B和CD80。

6.一种淋巴细胞的扩增方法，其特征在于，利用权利要求1-5中任一项所述的培养体系，以淋巴细胞为原料，进行培养5-10天，补加培养体系，再培养5-10天；

优选地，所述补加培养体系的次数为1-5次，优选为2-3次；优选地，所述培养的条件为37℃，5％CO2。7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，所述淋巴细胞为纯化的或未纯化的包含淋巴细胞的细胞组合，优选为外周血单核细胞和/或纯化的NK细胞；

优选地，所述培养体系中的K562工程细胞与所述淋巴细胞的比例为1:(0.25-5)，优选为1:(1-4)，进一步优选为1:(3-4)。

8.一种淋巴细胞的体内扩增方法，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述的培养体系中的白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物输入体内或将培养体系中的K562细胞输入体内；

优选地，所述K562细胞中包括白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的组合；优选地，所述输入的剂量为0.1-800pM，优选为0.5-500pM。

9.一种如权利要求6-8中任一项所述的扩增方法扩增的淋巴细胞用于制备治疗肿瘤性疾病和/或传染性疾病的药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤性疾病为急性髓细胞性白血病、胶质细胞瘤、前列腺肿瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌或肝癌中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述传染性疾病为细菌、病毒、真菌或寄生虫感染中任意一种或至少两种组合感染的疾病；

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CN 1071778 A

权　利　要　求　书

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优选地，所述传染性疾病为乙型肝炎、丙型肝炎或艾滋病中的任意一种或至少两种的组合。

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说　明　书

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一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用

技术领域

[0001]本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。

背景技术

[0002]NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)又称为大颗粒性淋巴细胞。和γδT细胞，NKT细胞在形式和功能上行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。[0003]在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D,AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。

[0004]目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞来治疗肿瘤也对NK细胞数量有很高要求。所以寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。[0005]近年，人工抗原提呈细胞(使用基因工程技术制作的滋养层细胞)越来越多的用于NK细胞的体外扩增。比如把膜结合IL15和4-1BBL导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞在21天平均扩增277倍。把MICA和4-1BBL导入K562细胞，并加以IL15刺激NK细胞可在24天平均扩增550倍.把mIL21，4-1BBL，CD，CD86，tCD19导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞3周平均扩增一万倍以上。[0006]CN 103484429A公开了一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。该发明将NCR3LG1和m IL-15同时转染到K562细胞，m IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3-CD56+NK细胞的比例超过70％。

[0007]但目前的扩增方法都不能满足临床对NK细胞的大量需求，提供一种快速扩增NK细胞的方法是一个亟待解决的问题。

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CN 1071778 A

说　明　书

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发明内容

[0008]本发明的目的在于提供一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用，所述培养体系和方法在提高临床应用安全性同时，有效提升NK细胞培养增殖效率，扩大NK细胞的应用。

[0009]为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：[0010]第一方面，本发明提供一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素12(IL-12)和CD80的混合物。[0011]本发明中，采用白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物来共培养淋巴细胞，使得淋巴细胞中的NK细胞快速增长，能获得高纯度的NK细胞，NK细胞的扩增数量也比使用转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的方法效率提高5.5倍。[0012]优选地，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD8的比例为(1-5):(0.5-3):1，例如可以是1:0.5:1、1:0.8:1、1:1:1、1:1.5:1、1:2:1、1:2.5:1、1:3:1、2:0.5:1、2:0.8:1、2:1:1、2:1.5:1、2:2:1、2:2.5:1、2:3:1、3:0.5:1、3:0.8:1、3:1:1、3:1.5:1、3:2:1、3:2.5:1、3:3:1、4:0.5:1、4:0.8:1、4:1:1、4:1.5:1、4:2:1、4:2.5:1、4:3:1、5:0.5:1、5:0.8:1、5:1:1、5:1.5:1、5:2:1、5:2.5:1或5:3:1，优选为(1-3):(0.8-2):1，进一步优选为2:2:1。[0013]优选地，所述混合物的添加量为10-1000pmol，例如可以是10pmol、20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、150pmol、200pmol、250pmol、300pmol、350pmol、400pmol、450pmol、500pmol、550pmol、600pmol、650pmol、700pmol、750pmol、800pmol、850pmol、900pmol、950pmol或1000pmol，优选为100-800pmol，进一步优选为300-500pmol。[0014]优选地，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80为共表达在宿主细胞中，优选为共表达在同一个宿主细胞中。[0015]本发明中，发明人发现将白细胞介素21、白细胞介素12和CD80分别表达在不同的宿主中可以刺激淋巴细胞的扩增，将白细胞介素21、白细胞介素12和CD80共表达在同一个宿主细胞中，可以进一步刺激淋巴细胞的扩增，淋巴细胞扩增的数量相比于表达在不同宿主中时增多。

[0016]优选地，所述白细胞介素12为由白细胞介素12A和白细胞介素12B的组成，所述白细胞介素12A和白细胞介素12B表达出来的蛋白会直接结合形成白细胞介素12。[0017]本发明中，所述白细胞介素21、白细胞介素12和CD80是通过将含有白细胞介素21的基因、白细胞介素12A的基因、白细胞介素12B的基因和CD80基因的不同载体质粒导入宿主细胞得到的。

[0018]本发明中，所述白细胞介素21的基因、白细胞介素12A的基因、白细胞介素12B的基因和CD80基因中的一个氨基酸或多个氨基酸的改变，若不影响蛋白质的性能，都在本申请的保护范围之内。[0019]本发明中，K562细胞为跨膜白介素21、白介素IL12和CD80的载体。所述载体包括但不仅仅限于金属、玻璃、塑料、聚合物、脂质体、磷脂双分子层、细胞膜和类似物。重要的是载体表面能够粘附上述蛋白质，并且不影响蛋白质的生物活性。[0020]优选地，所述白细胞介素21与跨膜蛋白的跨膜区和胞外区相连，共表达为一个融

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说　明　书

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合蛋白；所述白细胞介素12A和/或白细胞介素12B与跨膜蛋白的跨膜区和胞外区相连，共表达为一个融合蛋白，优选为白细胞介素12B与跨膜蛋白的跨膜区和胞外区相连，共表达为一个融合蛋白；所述CD80与跨膜蛋白的跨膜区和胞外区相连，共表达为一个融合蛋白；优选的所述跨膜蛋白为CD4跨膜蛋白。[0021]本发明中，可以从高表达跨膜白介素21、白介素IL12A、跨膜白介素12B和CD80的细胞株里分离纯化出蛋白，所述纯化技术包括但不限于以下方法：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素法，所述高效液相色谱法(HPLC)可作最后的纯化步骤进一步纯化蛋白质。[0022]优选地，所述宿主细胞为K562细胞。

[0023]本发明K562细胞通过基因工程技术表达跨膜IL-21、IL-12、CD80，改造为刺激型工程细胞，使得IL-21、IL-12、CD80在细胞生物膜上正常表达，体外刺激淋巴细胞生长。[0024]优选地，所述培养体系还包括白细胞介素2，所述白细胞介素2的添加量为50-400U/mL，例如可以是50U/mL、55U/mL、60U/mL、65U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、110U/mL、120U/mL、130U/mL、150U/mL、160U/mL、180U/mL、200U/mL、210U/mL、220U/mL、230U/mL、250U/mL、260U/mL、280U/mL、300U/mL、320U/mL、330U/mL、350U/mL、360U/mL、380U/mL或400U/mL，优选为80-200U/mL。[0025]优选地，所述培养体系还包括培养液，所述培养液为RPMI10和1-10％人血清或RPMI10和1-10％胎牛血清。[0026]优选地，所述培养体系包括培养液、K562细胞和白细胞介素2，其中，所述培养液为RPMI10和1-10％人血清或RPMI10和1-10％胎牛血清，所述K562细胞包括白细胞介素21、白细胞介素12A、白细胞介素12B和CD80。[0027]第二方面，本发明提供一种淋巴细胞的扩增方法，利用如第一方面所述的培养体系，以淋巴细胞为原料，进行培养5-10天，补加培养体系，再培养5-10天。[0028]优选地，所述补加培养体系的次数为1-5次，例如可以是1次、2次、3次、4次或5次，优选为2-3次。[0029]优选地，所述的培养的条件为37℃，5％CO2。[0030]优选地，所述淋巴细胞为纯化的或未纯化的包含淋巴细胞的细胞组合，优选为外周血单核细胞和/或纯化的NK细胞。[0031]本发明中，所述K562工程细胞通过辐照等方法，去除K562细胞活性后，再加入扩增NK细胞培养体系。[0032]优选地，所述K562工程细胞与所述单核细胞的比例为1:(0.25-5)，例如可以是1:0.25、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.5、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.5、1:4.8或1:5，优选为1:(1-4)，进一步优选为1:(3-4)。[0033]作为优选技术方案，所述的NK细胞的扩增方法包括以下步骤：[0034](1)培养：采集纯化的或未纯化的包含淋巴细胞的细胞组合，优选为外周血单核细胞和/或纯化的NK细胞；[0035](2)培养体系制备：将所述K562细胞进行采用剂量为100-500Gy辐照灭活，再加入培养液中，再向培养液中加入50-400U/mL的白细胞介素2；

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说　明　书

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(3)扩增：将步骤(1)得到的细胞加入步骤(2)所述的培养液中，所述K562工程细胞

与所述单核细胞的比例为1:(0.25-5)，培养5-10天，离心获得单核细胞，再次补加培养体系，再培养5-10天；[0037](4)收获：培养结束后离心收集获得的淋巴细胞。[0038]第三方面，本发明提供一种淋巴细胞的体内扩增方法，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述的培养体系中的白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物输入体内或将培养体系中的K562细胞输入体内。[0039]优选地，所述K562细胞中包括白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的组合。[0040]优选地，所述输入的剂量为0.1-800pM，例如可以是0.1pM、0.2pM、0.3pM、0.5pM、0.8pM、1pM、2pM、3pM、5pM、8pM、10pM、20pM、30pM、50pM、80pM、100pM、150pM、200pM、250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、600pM、650pM、700pM、750pM或800pM，优选为0.5-500pM。[0041]第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的扩增方法扩增的淋巴细胞。[0042]本发明中，所述淋巴细胞可以用来进行自体移植和异体移植，捐助人被激活和扩增的淋巴细胞可以通过静脉滴注等方式注入到被捐助人的血管中。[0043]第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的扩增方法扩增的淋巴细胞用于制备治疗肿瘤性疾病和/或传染性疾病的药物。[0044]优选地，所述肿瘤性疾病选自但不限于急性髓细胞性白血病、胶质细胞瘤、前列腺肿瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌或肝癌中的任意一种或至少两种的组合；

[0045]优选地，所述传染性疾病为细菌、病毒、真菌或寄生虫感染中任意一种或至少两种组合感染的疾病；所述传染性疾病选自但不限于乙型肝炎、丙型肝炎或艾滋病中的任意一种或至少两种的组合。[0046]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0047](1)本发明培养体系培养，批次获得NK细胞质量均一、稳定，适合规模化平行放大，解决了高纯度NK细胞体外培养快速规模扩增技术问题；[0048](2)本发明培养体系扩增的NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，体外培养第14天NK细胞可扩增约9100倍，获得具有高活性的NK细胞，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；[0049](3)本发明培养体系扩增的淋巴细胞，达到各种临床应用NK细胞适合治疗病症对NK细胞的数量，活性和安全性的要求，有效降低淋巴细胞的应用成本，为淋巴细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

附图说明

[0050]图1是本发明中宿主细胞同时表达跨膜白介素21、白介素IL12A、跨膜白介素12B和CD80的结构示意图；

[0051]图2为体外PBMC与所述K562工程细胞共培养所得到的淋巴细胞数量的线性图；[0052]图3为体外PBMC与所述K562工程细胞共培养14天后，对所得淋巴细胞进行流式分析，检测NK细胞(CD3-CD56+)的比例；

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CN 1071778 A[0053]

说　明　书

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图4为体外PBMC与所述K562工程细胞共培养所得NK细胞与Hela细胞混合(使用

iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪)得到的实时无标记细胞功能分析数据。，其中，control为对照组，是将PBMC细胞与转染了跨膜白介素21，CD137L的K562细胞共培养14天得到NK细胞，然后将此NK细胞与Hela细胞混合。

具体实施方式

[00]为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。[0055]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0056]实施例1基因工程细胞的制备

[0057]基因工程细胞的制备方法如下：首先构建能稳定表达跨膜白介素21,白介素IL12A,跨膜白介素12B和CD80的载体。载体上有选择标记基因。跨膜白介素21或跨膜白介素12B是通过CD4的跨膜部分连接到细胞膜上，白介素IL12A和CD80为跨膜蛋白。将这些载体转染K562细胞，用抗生素和流式细胞仪选择高表达的细胞克隆。[0058]实施例2淋巴细胞扩增培养体系的配制

[0059]将实施例1制备的基因工程细胞用于淋巴细胞的扩增，包括以下步骤：[0060](1)灭活基因工程细胞：通过100Gy放射线照射30分钟，获得灭活的K562工程细胞；[0061](2)配制培养基：取淋巴细胞培养液RPMI10和10％胎牛血清，再向混合培养基加入步骤(1)灭活的K562工程细胞，添加量为1×106/mL，再添加IL-2，IL-2的添加量为50U/mL。

[0062]实施例3健康志愿者淋巴细胞的扩增[0063](1)培养：采集新鲜健康志愿者血液，经离心收集血清储存，经淋巴分离液分离获得人外周血单个核细胞(PBMC)，接种密度为1×106/mL(根据所述K562工程细胞与所述单核细胞的比例为1:1)，接种到体外扩增淋巴细胞的培养体系中；[00](2)扩增：37℃，5％CO2条件下培养7天，再加入上述培养体系，再培养7天；[0065](3)收获：培养结束后离心收集获得NK细胞。[0066]采用转染跨膜白细胞介素21、CD137L的K562细胞与PBMC细胞共培养得到的NK细胞作为对照；

[0067]采用自动细胞计数仪对扩增的NK细胞进行计数，并绘制曲线，生长曲线如图2所示，可以看出，NK细胞在转染跨膜白介素21，CD137L的K562滋养细胞和低剂量白介素2的共同作用下，数量显著增加，NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天时约增长1600倍。[0068]转染跨膜白介素21，白介素IL12A，跨膜白介素12B和CD80的K562滋养细胞对于促进外周血淋巴细胞中NK细胞生长的作用明显强于转染跨膜白介素2和CD137的K562滋养细胞，白介素21，白介素IL12A，白介素12B和CD80和低剂量白介素2扩增激活NK细胞的方法比用仅转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞激活扩增NK细胞的方法，扩增的效率高5.5倍，两个星期后，细胞的数量增加到9100倍。[0069]从图3可以看出，第14天时90％以上的淋巴细胞为CD3-CD56+NK细胞。

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CN 1071778 A[0070]

说　明　书

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实施例4健康志愿者淋巴细胞的扩增

[0071]培养与扩增方法同实施例3，采集健康新鲜血液经离心收集血清储存，接种密度为2×106/ml，进行培养。

[0072]其培养结果类似实施例3，后续试验采用实施例3培养的淋巴细胞。[0073]实施例5健康志愿者淋巴细胞的扩增[0074]培养与扩增方法同实施例3，采集健康新鲜血液经离心收集血清储存，接种密度为3×106/ml，进行培养。

[0075]其培养结果类似实施例3，后续试验采用实施例3培养的淋巴细胞。[0076]实施例6扩增后的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

[0077]采用实施例3扩增的淋巴细胞与人宫颈癌细胞Hela细胞进行裂解测试，人宫颈癌细胞Hela细胞作为裂解测试的靶细胞，在裂解实验的前一天将Hela细胞铺在iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪的细胞检测板上。第二天将扩增的NK细胞和靶细胞按照适当的比例共同培养，使用实时无标记细胞功能分析仪(美国艾森iCELLigence)得到实时的细胞指数曲线；

[0078]裂解测试对照组中，使用了转染跨膜白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的淋巴细胞。

[0079]结果如图4所示，与对照组相比，本申请扩增的淋巴细胞对Hela细胞的裂解作用显著增强。

[0080]综上所述，采用本发明培养体系扩增的淋巴细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍。达到各种临床应用NK细胞适合治疗病症对NK细胞的数量，活性和安全性的要求，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。[0081]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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