一种食用菌菌丝快速PCR方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105200139 A (43)申请公布日 2015.12.30

(21)申请号 2015101076.7(22)申请日 2015.09.30

(71)申请人上海市农业科学院

地址201106 上海市闵行区北翟路2901号(72)发明人汪虹 陈明杰 赵妍 冯爱萍

辛苗苗(74)专利代理机构上海泰能知识产权代理事务

所 31233

代理人黄志达(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12R 1/5(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页序列表2页 附图1页

()发明名称

一种食用菌菌丝快速PCR方法(57)摘要

本发明涉及一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：(1)制备PCR反应模板；(2)PCR反应；(3)电泳检测。本发明所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。

C N 1 0 5 2 0 0 1 3 9 A CN 105200139 A

权 利 要 求 书

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1.一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：

(1)用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用灭菌牙签挑取预先培养的食用菌菌丝置于裂解液中离心，振荡，再离心；

(2)以上述得到的菌丝裂解液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH2O 11μL；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，(引物Tm值-5)℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；

(3)取上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于缓冲液中电泳，电泳结束后，用EB染色，然后拍照，即可。

2.根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤(1)中的裂解液占PCR管体积的1/10。

3.根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增产物与加样缓冲液的体积比为5:1。

4.根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶浓度为1.5％。

5.根据权利要求1所述的一种食用菌菌丝快速PCR方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电泳电压为5V/cm。

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说 明 书

一种食用菌菌丝快速PCR方法

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技术领域

[0001]

本发明属于快速PCR领域，特别涉及一种食用菌菌丝快速PCR方法。

背景技术

聚合酶链式反应简称PCR反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，在分子生物学中有广泛的应用。

[0003] 通常PCR反应之前首先需要提取基因组DNA作为扩增模板，食用菌菌丝基因组DNA提取方法常用CTAB法，需要的菌丝量大，耗时。尽管近年来不断有公司开发出快速PCR试剂盒，但主要针对植物和动物样品，用于食用菌菌丝直接扩增时，经常出现扩增不出特异性条带或对照也扩出条带等问题，无法应用于食用菌菌丝快速PCR扩增。

[0002]

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种食用菌菌丝快速PCR方法，该方法所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。

[0005] 本发明的一种食用菌菌丝快速PCR方法，包括：[0006] (1)用移液器吸取裂解液置于PCR管中，用灭菌牙签挑取预先培养的食用菌菌丝置于裂解液中离心，振荡，再离心；

[0007] (2)以上述得到的菌丝裂解液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH2O 11μL；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，(引物Tm值-5)℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；[0008] (3)取上述PCR扩增产物与加样缓冲液混匀，点样于琼脂糖凝胶上，于缓冲液中电泳，电泳结束后，用EB染色，然后拍照，即可。

[0009] 所述步骤(1)中的裂解液占PCR管体积的1/10。

[0010] 所述步骤(3)中的PCR扩增产物与加样缓冲液的体积比为5:1。[0011] 所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶浓度为1.5％。[0012] 所述步骤(3)中的电泳电压为5V/cm。[0013] 本发明不需要提取食用菌基因组DNA，筛选获得裂解液简单快速处理少量菌丝样品作为模板，利用筛选获得的PCR扩增试剂盒即可进行PCR扩增反应，获得所需的目的DNA片段。

[0014] 有益效果

[0015] 本发明所需菌丝量少，无需耗时进行基因组DNA提取，具有操作简便，检测时间短，准确性高，稳定性和重复性好的优点；可以利用少量菌丝进行PCR扩增，获得所需的目的DNA片段，缩短试验进程，适用于大批量样品的PCR扩增。

[0004]

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说 明 书

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附图说明

图1为草菇菌株交配型基因特异条带扩增图；其中，M为Marker；1为草菇菌株V23；2为对照。

[0017] 图2为香菇菌株微管蛋白基因特异条带扩增图；其中，M为Marker；1为香菇菌株135；2为对照。

[0016]

具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0019] 实施例1

[0020] (1)菌丝培养：

[0021] 草菇菌株V23接种PDA试管，适宜温度培养。[0022] (2)PCR反应模板制备：

[0023] 移液器吸取50μL裂解液置于0.5mL PCR管中，用灭菌竹制牙签挑取少量菌丝置于裂解液中，短暂离心，混匀器上振荡1分钟，短暂离心，以该裂解液为模板。[0024] (3)PCR反应体系及条件[0025] 扩增反应体系(25μL)：12.5扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH2O 11μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，55℃30second，72℃1min，35个循环；72℃10min。[0026] (4)电泳检测

[0027] 取上述PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

[0028] 利用该方法，采用草菇V23菌株交配型基因的特异性引物对(F:GTGGTTGGGATGGAAGGTTGTGA，R:CTGTGAGGGTTTGTGGTGGGATA)，裂解液快速处理少量草菇V23菌株菌丝后进行PCR扩增反应，草菇V23菌株能扩增出一条特异性条带，对照不能扩增出条带，如图1所示。[0029] 实施例2

[0030] (1)菌丝培养：

[0031] 香菇菌株135接种PDA试管，适宜温度培养。[0032] (2)PCR反应模板制备：

[0033] 移液器吸取50μL裂解液置于0.5mL PCR管中，用灭菌竹制牙签挑取少量菌丝置于裂解液中，短暂离心，混匀器上振荡1分钟，短暂离心，以该裂解液为模板。[0034] (3)PCR反应体系及条件

扩增反应体系(25μL)：12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各

0.5μL，菌丝裂解液0.5μL，ddH2O 11μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，50℃30second，72℃1min，35个循环；72℃10min。

[0035]

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说 明 书

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(4)电泳检测

[0037] 取上述PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

[0038] 利用该方法，采用香菇微管蛋白基因特异性引物对(TUB1F:GAAGGTTAGCCGCAGCAT,TUB1R:CTCAAGGGCAGCCAAGTC)，裂解液快速处理少量香菇菌株135菌丝后进行PCR扩增反应，香菇菌丝能扩增出特异性条带，对照不能扩增出条带，如图2所示。

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序 列 表

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序 列 表

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说 明 书 附 图

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图1

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