1.样品提取－以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂
解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
2.转膜－小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
3.电泳－电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；如果蛋白跑出胶外，那下次一定就要更换，如果没有的话还能用一两次．注意的是加样不足十孔时，两侧加同体积上样缓冲液 。加相同蛋白量体积不同时用上样缓冲液补齐，保证相同上样体积
4.显影－转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Lammli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典),这是SDS-PAGE(不连续系统)的首次成功应用,现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,其实任何技术都不是平白无故的提出并实践的, Lammli提出的方法也不例外.早在1964年,Ornstein和Davis在Annals of the New York Academy of Sciences上各自发表了一篇关于圆盘电泳(Disc electrophoresis)的paper,这两篇paper首次提出了不连续的Native PAGE系统;而在1967年,Shapiro在Biochemical and biophysical research communications上的一篇paper中首次进行了连续的SDS-PAGE,以磷酸钠为缓冲体系(pH7.0),内含0.1%SDS,在样品溶解液中加入了1%SDS及!%巯基乙醇,37℃保温3h然后上样电泳.正是这两篇paper的指引下(当然还有其它的参考文献),Lammli总结了前人的智慧结晶下提出并成功运用了不连续的SDS-PAGE系统. 说了半天似乎没有回到大侠们的问题上来啊,呵呵,问题的解释已经显露出来,最初样品进行变性处理的时候Shapiro用的是37℃保温3h(之后的文献就是用这样的加热方法),而在Lammli的报道中用的是沸水浴中1.5分钟,而在另外的文献中有用60-70℃30分钟,95℃4分钟等等.我们知道蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇(二硫苏糖醇,DTT也可),SDS主要通过疏水作用与蛋白结合,一定的SDS单体浓度下,大约结合比例为1.4g SDS/1g蛋白(引自PNAS,1970,66,1002-1007,作者是Reynolds),而巯基乙醇（或DTT）使蛋白二硫键还原,有利于蛋白质与SDS的结合,蛋白样品被加热变性能使SDS与蛋白充分结合.其实加热不是问题的关键,比如上述的Reynolds等人制备SDS-protein样品的方法是用先用盐酸胍处理,以得到蛋白多肽的无规卷曲构象(random coil conformation)然后用含SDS与巯基乙醇的缓冲液进行透析,文中还指出,若是省去盐酸胍这一处理步骤,直接将蛋白用含SDS与巯基乙醇的缓冲液进行透析能得到一样的结合率(约1.4g/1g),同样在Reynolds的另一篇文献中(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1970,245,5161-5165,说明一下,正是这篇研究阐述了SDS与蛋白的结合比例约为1.4g/1g)有这样的一段话:
所以处理的方法不管用37度保温3h,还是100度1.5min一般来说效果(形成SDS-protein复合物从而完全掩盖蛋白自身的电荷差别而使泳动率只是分子量的函数)差不多,其实可以做做这方面的实验,看哪种参数下的SDS-PAGE效果最好:)
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