在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，我们必须充分地重视。
1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。
3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。
4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。
1、 注意各溶剂间的互溶性。
2、 2、对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）。
3、 3、注意梯度变化时系统压力的变化，防止超出限度。
4、 4、梯度结束后，用初始流动相冲洗，使柱子平衡一段时间（再生），使系统回复到初始状态。（梯度周期）
5、 5、低压梯度要注意脱气，混合后容易产生气泡。
6、 6、容易出现鬼峰，应作空白试验。
7、 7、梯度选择时尽量几相之间相变化要小,否则不易平衡。
8、 8、梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。
9、 9、要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出
要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这样出峰时间的重现性较好；
最后有机相的比例不是越高越好，这个比例要摸索，只要你要的样品峰能满足你的要求即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间就长啦 ；
如果是低压混合，流速很慢，如做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡时间比较长（除非你要侧很多成分，比如中药指纹图谱），如果非要跑，一定要尽量减小死体积。
1,梯度淋洗对于低压混合必须有脱气机,高压混合可不必有,但最好要有备压,
2,初始平衡时间尽量长点,第一针最好不要,每走完一针后的平衡时间一定一致,每针保证出干净的条件下时间要一致,(很重要)
3注意你的柱子耐水性如何,如果水相过高,很难做重现
4,注意你的波长,如果接近截止波长,请选用梯度级试剂,
5,尽量降低溶样的强度,这样会减少麻烦,
6,梯度选择时尽量几相之间相变化要小,越小越好
1、管路及柱子做梯度前要彻底的冲洗干净，防止空白中过多鬼峰的出现。
2、溶剂最好都用色谱纯的，特别是最好用高纯水或双蒸水，防止梯度分析中基 线过大的漂移。
3、要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。
4、梯度分析中有机相的陡度不要太大。
经过初步分离，一般可能得到3种分离色谱图：
① 前半部峰重叠，后半部峰分离度过大，保留时间太长；
可选择线形梯度，或凹形梯度。
② 前半部分离良好，后半部峰重叠；
可选择凸形梯度。
③ 前后两部分分离良好，中间部分峰重叠。
可选择折线梯度。
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