医学微生物学实验论文
PCR方法快速检验HBV
作者：刘晓林 王远贺 王瑞静 指导老师：张文卿 于红
2006年12月29日
PCR方法快速检验HBV
[日期：2006-12-29 ] 作者： 刘晓林 王远贺 王瑞静 青岛大学医学院04级六班
【摘要】
乙型肝炎的预防、检测和治疗变的尤为重要。
①模板DNA的变性：②模板DNA与引物的退火(复性)：③引物的延伸： 标准的PCR反应体系：本次实验的PCR反应体系：本次实验的PCR反应循环参数： 标号“7”的阳性标本一份。标号“8”“9”的待测标本各一份（由老师提供的待检人员的血清DNA提取液）。标号“—”的阴性标本一份
在实验中，一大部分的工作是微量试剂的滴加，这要求我们有过硬的动手能力。
【关键词】 PCR HBV 乙型肝炎 快速检测
一、前言
乙型肝炎病毒（HBV）是乙型肝炎的病原体，主要经输血、注射、性行为和母婴传播。本病起病缓慢，部分患者可转为慢性，少数可导致肝硬化和肝癌。据估计全世界HBsAg携带者约3.5亿，其中我国约1.2亿人，包括中国在内的东南亚、非洲等国际为HBV感染的高流行区。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。但是由于PCR技术的高度灵敏性，使得实验中易出现假阳性的情况，影响了PCR应用的可信度。
对乙型肝炎进行实验室诊断，最常采用血清学方法检测患者血清HBV标志物，而血清HBV DNA是HBV感染、复制、血液有传染性的直接标志，所以近年常采用PCR技术对乙型肝炎进行研究和诊断。
二、实验目的和意义
乙型肝炎级大的威胁着现代人的饿生命，影响着人们的生活质量，已经成为全世界人们的公敌。所以乙型肝炎的预防、检测和治疗变的尤为重要。
本次实验，我们应用技术方面比较成熟、易操作的PCR技术，通过扩赠HBV DNA来检测HBV的存在性，从而检测待测血清中是否含有HBV，待测人员是否为乙肝患者或乙型肝炎的携带者。
通过这次实验，我们应该清楚当前HBV检测的常用方法，着重掌握PCR技术在检验乙肝病毒中的应用。
通过实验，加强自身对乙肝的认识，正确对待乙肝患者和携带者，做好自身
的预防工作。
三、实验原理
【PCR技术的基本原理】
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
【标准的PCR反应体系】： 10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul
本次实验的PCR反应体系： 试剂名称 10xbuffer 3.0μl 试剂量 终浓度 1xbuffer 10xdNTP 3.0μl 25mM MgCl2 1.8μl Primer1 0.6μl Primer2 0.6μl DNA template 2.0μl Taq DNA polymerase 0.3μl Pure ddH2O 18.7μl 合计 30.0μl
本次实验的PCR反应循环参数： 94℃ 5min
94℃ 1min
3℃ 1min 30个循环 72℃ 1min
72℃ 10min
0.2μM 1.5mM 0.5μM 0.5μM 1.0ng 1.5U 四、实验准备
【实验材料】
引物：5`—TGACAAGAATCCTCACAATA—3` 5`—AGCCCTACGAACCACTGAAC—3
PureddH2O 10xbuffer 10xdNTP 25mMMgCl2 TaqDNA聚合酶 溴酚蓝 溴化乙锭 TBE缓冲液 琼脂糖
标号“7”的阳性标本一份 标号“8”“9”的待测标本各一份（由老师提供的待检人员的血清DNA提取液）
标号“—”的阴性标本一份
【实验仪器】
PCR扩赠仪 水平式电泳槽 紫外透射仪 凝胶成像分析仪 微量加样器等
五、实验步骤
1、取一支Eppendorf管，按如下顺序和计量，依次加入。
Pure ddH2O 112.2μl 10xbuffer 18μl 10xdNTP 18μl 25mM MgCl2 10.8μl primer1 3.6μl primer2 3.6μl Taq DNA聚合酶 1.8μl
2、另取5支Eppendorf管，分别表识“7” “8” “9” “一” “水”。从1
号管中依次取出28.0μl的混合液，分别加入五个管中。
然后按下表顺序，向5管依次加入：
7号标本（阳性） 2ul 8号标本（待测） 2ul 9号标本（待测） 2ul “一”对照标本 2ul H2O（空白对照） 2ul
3、 将5支Eppendorf管放入PCR扩增仪中进行扩增
4、 配制1.2%的琼脂糖凝胶，注入水平式电泳槽中，冷却成胶。
5、依次从五个Eppendorf管中取出扩增后的液体，以5：1的比例与溴酚蓝
混合，依次加入凝胶孔中。 另一孔中加入Mark
6、近凝胶孔侧接“—”极，对侧接“+”极，电压80V,电泳30分钟.
7、取出凝胶,在紫外灯下观察结果.
六、实验结果
【图像】
从右到左，结果如下 7号管 8号管 9号管 9号管 阴性对阴性对空白对Mark （阳性） （待测） （待测） （待测） 照 照 照 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 【结果分析】
8、9号标本为阳性标本。标本提供者为乙型肝炎患者或携带者。
七、实验总结
【实验内容总结】
1、PCR的灵敏度极高，在操作中应尽量避免。尤其实在向Eppendorf管
加试剂时，更应格外小心，防止污染。
2、当向每支Eppendorf管中加的试剂量十分少时，为避免误差，可各管
中相同的材料加在一起，在等份分开。
3、溴乙锭有毒，应戴手套，实验中注意保护自己。
4、由于是第一次的独立实验，实验中对许多先进的仪器不了解，如紫外
投射仪、凝胶成像分析仪，给实验结果的记录带来了麻烦。
【实验整体总结】 1、实验准备不足
虽然我们在实验前以为自己的准备工作已经做的相当充分了，在实验
过程中仍出了各种问题，对一些必要步骤的不清楚。
2、动手能力仍需加强
在实验中，一大部分的工作是微量试剂的滴加，这要求我们有过硬的
动手能力。但我们还是出现了滴加不完美的情况，只能有重复滴加做弥补。
3、自信心得到加强
这是我们大学期间的第一次的自主实验，从查资料、确立实验方法到
实验的具体实施，均由我们自己完成，最后实验成功结束，我们对自己的能力有了更客观的认识，今后的实验中，更自信了！
参考文献：
1、彭易红.乙型肝炎病毒.医学微生物学.2005,8
2、刘丽华，董克瑞，邓爱忠，等.乙型肝炎病毒血清标志物与HBV-DNA的比较分析.中华医学杂志，1999，79:193.
3、张永新，杜绍财，陈苹，等.肝炎恢复期乙型肝炎表面抗体阳性者血清中的乙型肝炎病毒DNA.中华内科杂志，1992，31:629-632.
4、PCR技术概论.生物秀网站
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