稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

帕金森病（PD）发病过程中的作用提供细胞模型。方法 于Gen Bank中检索人Drpl基因的核R酸序列，设计并筛

选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA（siRNA）的单链DNA寡核 R酸（DNA oligo），与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNA oligo片段。分别用Age I与EcoR I双酶切双

链DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后，加入T4 DNA

，得到重组慢病毒载体质粒Drpl-RNA1和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi加入到大肠杆菌TOPlO感受态细胞中反应后，分别提取质粒 DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中，培养48 h后收集 上清液，离心后过

Drpl-RNAi 慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drpl-RNAi重组慢病毒组（D组，用Drpl-RNAi重组慢病毒感染）、阴性对照组（N组，用阴性对照慢病毒感染）、正 对照组（C组，正常培养），采用

定量PCR法检测各组细胞Drpl mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞Drpl蛋白。结果 重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drpl

mRNA和蛋白的相对表达量为0.47 ±0. l2和0.40 ±0.04,N组Drpl mRNA和蛋白的相对表达量为l. l2 ±0.33和

0. 67 ±0.05,C组Drpl mRNA和蛋白的相对表达量为l.02 ±0.23和0. 72 ±0.02；D组Drpl mRNA和蛋白的相对表 达量与N组、C

』均＜0.05；N组DrplmRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均＞0.05成功构建了稳定干扰Drpl基因的慢病毒载体质粒,并建立、。结论 筛选 稳定干扰Drpl基因的神经母细胞瘤细胞株，进一步探讨Drpl基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型关键词：：Drpl基因；RNA干扰;慢病毒载体质粒;。神经母细胞瘤细胞株;帕金森病doi 0. 3969/j. issn. l002-266X. 20l9. 24. 00l中图分类号:R745 文献标志码:A

文章编号：l002-266X（20l9）24-000l-04Construction of lentiviral vector, plasmid and neuroblastoma cell, line stably interfering with Drp1 geneZHOU( Mengqi, CHAI YuanFENG Wandi, MA Haojie, GAI CongSUN HongmeiBeijing University of Chinese Medicine, Beijing l02488 , ChinaAbstract: )Objective To construct a lentiviral vector plasmid and a neuroblastoma cell line stably interfering with the

Drpl gene in order to provide a cell model for further investigation of the role of the Drpl gene in the pathogenesis of Par­kinsons disease ( PD). Methods The nucleotide sequence of the human Drpl gene was searched in Gen Bank, and the

interference sequence with the optimal kinetic parameters and the unrelated sequence as the negative control group were de­

signed and screened. We designed and synthesized a single-stranded DNA oligonucleotide (( DNA oligo) of interfering RNA

siRNA) according to its target sequence, and reacted with annealing buffer to form a double-stranded DNA oligo fragment

with sticky ends., The double-stranded, DNA oligo fragment and the GV248 lentiviral backbone plasmid were digested with Agel and EcoRIrespectivelyand ligated with T4 DNA ligase to obtain a recombinant lentiviral vector plasmid Drpl -RNAi and a negative control , plasmid. The recombinant lentiviral vector plasmid Drpl -RNAi was added to E. coli TOPl0 compe­

tent cells for reactionand plasmid DNA was separately extracted and subjected to DNA sequencing. The recombinant lentiviral vector plasmid Drpl-RNAi and the negative control plasmid were transfected into 293T cell culture medium, and基金项目：国家自然科学基金资助项目(81573773 ；1774110)。第一作者简介:周梦琪(1992-)，女，硕士研究生，主要研究方向为中医药防治脑病的机制。E-mail： 20170931120@bucm.edu.cn 通讯作者简介:孙红梅(1961-)女,

，教授，

为中 病的机制。E-mail： hm-sun@163.com

1山东医药2019年第59卷第24期the supernatant was collected after 48 hours of cultureand then was centrifuged to obtain Drpl-RNAi recombinant lentivir-

, ) , negative control group ( group N, infected

with negative control lentivirus) , and normal control group ( group C, normal culture). The real-time fluorescent quantita­tive PCR was used to detect Drpl mRNA in each group, and the Drpl protein in each group was detected by Western blot­

lentivirus group ( group Dinfected with Drpl -RNAi recombinant lentivirusus and negative control lentivirus. Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y was divided into the Drpl -RNAi recombinant

, ting. Results The DNA sequence of the recombinant lentiviral vector plasmid Drpl -RNAi was identical to the designed in­

terference sequence. The relative expression levels of Drpl mRNA and protein in the group D were 0.47 ± 0. l2 and 0. 40

± 0. 04 the relative expression levels of Drpl mRNA and protein in the group N were l. l2 ± 0. 33 and 0. 67 ± 0. 05 the

； relative expression levels of Drpl mRNA and protein in the group C were l. 02. ± 0. 23 and 0. 72 ± 0. 02 significant differ­

； ; ence was found in the relative expression of Drpl mRNA and protein in the group D as compared with that of group N and group C ( both P < 0. 05 ) ; no significant difference was found in the relative expression of Drpl mRNA and protein between

the group N and group C ( both P >0.05). Conclusions The lentiviral vector plasmid stably interfering with Drpl gene is successfully constructed, and the neuroblastoma cell line stably interfering with Drpl gene is established and screened,

which lays a model foundation for further study of the role of Drpl gene in the pathogenesis of Parkinsons disease.Key wordsDrpl geneRNA interferencelentiviral vector plasmidneuroblastoma cell lineParkinsons disease: ; ; ； ; 帕金森病(PD)是一种发病率较高的神经退行 焦扫描显微镜购自日本Olympus FVl000公司, Safire2全波长荧光酶标仪购自瑞士 TEcan公司,

性疾病，与环境毒素和遗传缺陷造成线粒体的异常 及线粒体融合的动态平衡被破坏密切相

PCR仪购自美国ABI公司，测序仪购自美季生物公

![l>2]。线粒体的主要由Drpl基因来，且 司，数显式稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪购自天能公 司,CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有

的频率决定了线粒体的形态和功能。因此,

Drpl基因与PD的关系越来越被关注和重视。20l7

限公司,细菌摇床购自华利达实验设备公司,Blue Pard隔水式恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有

年6月8日~20l7年7月23日，本研究构建了稳定

干扰Drpl基因的重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi, 限公司，紫外分光光度仪购自美国Bio-Rad公司。l.2 ；吟霉素的细胞最低致死浓度筛选取状态

包装病毒后感染并筛选稳定干扰Drpl基因的神经 母细胞瘤细胞株,为进一步研究Drpl基因在PD发

良好且处于对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96 孔板中培养24 h,设置实验组、对照组。实验组中分 别加入l、2. 5、5,7.5、0 Rg/mL浓度的；吟霉素工

作液,每个浓度设置5个复孔;对照组不加；吟霉素

病过程中的作用提供了细胞模型。1材料与方法l.l材料、试剂及仪器人神经母细胞瘤细胞株

SH-SY5Y、GV248 慢病毒骨架质粒 hU6-MCS-CMV- 工作液。以不含SH-SY5Y细胞的孔为空白组，采用

CCK-8法测算各组细胞存活率，结果显示,随着；吟

EGFP、大肠杆菌TOPlO感受态细胞、293T细胞、慢

病毒包装辅助质粒pHelper l. 0载体和pHelper 2. 0 载体、；吟霉素(REVGlOOl)、聚凝胺(REVG000l)

助感染试剂和 Enhanced Infection Solution

霉素浓度增加，实验组细胞存活率逐渐降低，但当； 吟霉素浓度为5,7.5、0 Rg/mL时，实验组细胞存 活率均小于30%，且三组间细胞存活率相比,P均

>0. 05,故选取浓度最低的5 Rg/mL为；吟霉素最

(REVG0002)感染用培养基均购自上海吉凯基因技 术有限公司，T4 DNA连接酶和逆转录试剂盒购自 美国Thermo Scientific公司，性核酸内切酶购自

上海NEB公司，Taq Plus DNA polymerase购自南京 Vazyme 公司，Lipofectamine 3000 转染试剂、TRIzol

低致死浓度进行后续实验。l.3重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi的构建与鉴

定 于Gen Bank中检索人Drpl基因的核R酸序列

(基因编号 l0059 DNMlL)，利用 BLOCK-iTTM RNAi

Designer 公用设计软件(http://rnaidesigner. ther­mofisher. com/rnaiexpress/insert. do)设计并筛选最

试剂购自美国Invitrogen公司,无内毒素质粒大提试

剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，thun­

derbird qPCR定量检测试剂购自日本TOYOBO

佳动力学参数的干扰序列为：5'-GTGGT- GCTAGAATTTGTTA-3',同时设计作为阴性对照的

公司，二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司，高速

冷冻离心机购自美国Thermo Scientific公司，倒置式

荧光显微镜购自日本Nikon TE2000公司,超净工作

无关序列为:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3',根据 靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链

DNA寡核R酸(DNA oligo)把合成的单链DNA台购自北京昌平长城空气净化工程公司,激光共聚2山东医药2019年第59卷第24期oligo干粉与退火缓冲液配制成终浓度为20 “mol/L

株。C组细胞使用 时荧光定量PCR 检

基 。①采用实的溶液,90七 15 min, 冷 ，退火后细胞Drpl mRNA 收逆转录成cDNA,以定量PCR反应。弓|物形成带黏性末端的双链DNA oligo片段。分别用 Age I与EcoR I双酶切双链DNA oligo片段和

细胞，采用TRIzol 提取 细胞总RNA,

照逆转录试剂盒

0-actin为内参，进行

GV248慢病毒骨架质粒hU6-MCS-CMV-EGFP后，加T4 DNA

4 过夜， 慢病毒100 大肠序列如下：Drpl上游引物为5'-GGTGAAGCG-

GCAAATCAAACG-3，,下游弓［物为 5'-ATGTTTTGT-

载体质粒Drpl-RNAi和阴性对照质粒。将10 重慢病毒载体质粒Drpl-RNAi GTTGATATAAGCCA-3'；0-actin 上游引物为 5'-CG- GCTACAGCTTCACCACCA-3',

杆菌TOP10感受态细胞中，冰上反应30 min,42 °C物 为 5'-激90s, 2 min。取适量菌液 在CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC-3'0 建立 20 rL PCR

有氨节霉素的平板上，在 中，置于37 C 质粒大提试剂盒

箱中倒置16 h,按照无内毒素反应体系:cDNA 2 rLpower 10 rL、H2O2 7. 2 rL、

物各0.4 rL PCR反应 为：95C F

o12-16 h,挑选单个菌落分别 于LB液体 基

性 10 min,40 个 15 s）o 以 2-AACt

（95 C 5 s、60 C 30 s、95 CDrpl mRNA 的相对

；分别提取质粒DNA,用测序量。仪对其进行DNA 序，将DNA 序 与设计的 ②采用Western blotting 检测各组细胞Drpl 1

细胞, 用 RIPA 液提取 细胞干扰序列进行对比，进一步确定 序列的 性。 1.4稳定干扰Drpl基因的神经母细胞瘤细胞株的

，用BCA试剂盒进行 SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后

浓 定后进行1 h,力 应的建立及鉴定 取对数生长期293T细胞于细胞中 ，待细胞汇合度70% -80%

，用Lipo-fectamine 3000将重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi

一抗，常温在 lh后4 C过夜，次日用TBST 3遍，每次15 min,随后 应的二抗和辅助质粒（pHelper 1.0载体和pHelper 2. 0载体） 1 h, ECL化学发光液后采用凝胶成像系

转 293T细胞中，培养48 h后 液，离心统显像，使用Image J

Drpl = Drp1

分 带

° ，计算后过 Drpl-RNAi 慢病毒 阴性对照慢病

毒,分装后 于-80 C 箱内备用。取对数生长SH-SY5Y细胞，以5 x 104/mL 于6孔板中，的对

带

Drpl 的对表达量/ P-actin 带1.5 计学 采用SPSS20.0 计 计量°分为Drpl-RNAi Drpl-RNAi

慢病毒组（D组）、阴性对照组10隅48 h,（N组）、正常对照组（C组）D组、N组分别加入

料以x± s , 用单因 差分析;计数料 用X2检验0 p ＜0.05为差异有统计学意义。慢病毒、阴性对照慢病毒 2 结果2.1

聚凝胺助感染试剂的细胞

为含10%

液，培养24 h后基进行筛选，慢病毒载体质粒Drpl-RNAi的鉴定结果的DMEM 基 DNA测序 显示,重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi一致，见图1,提用含5 Rg/mL瞟吟霉素的

,带有

的DNA序列与设计的干扰序列

2-3 d 液、传代，反复筛选2周, 显微镜 慢病毒载体质粒Drpl-RNAi构建成功。构建 的重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi结构见图2°A的细胞 为稳定转 的细胞jB03403503603703803904004104204304TTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCGTGGTGCTAGAA'nTCTTACTCGAGTAACAAATTCTAGCACCACCGTTTTTAATTCTCGACCTCGAGlii11A1111B• •Aw注:两个箭头之间即为重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi的DNA序列图1重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi测序结果2. 2 稳定干扰 Drpl 基因的神经母细胞瘤细胞株的组Drpl mRNA和蛋白的相对表达量为1.02 ±0.23

和0.72 ±0.02；。组。中1 mRNA和蛋白的相对表达

定 D Drpl mRNA 的 对为 0.47 ±0. 12 和 0.40 ±0.04,N 组 Drpl mRNA 和量与N组、C组相比,P均＜0.05；N组Drpl mRNA

的相对

蛋白的相对表达量为1.12 ±0.33和0.67 ±0.05 ,C与C 』均＞0.05。3山东医药20l9年第59卷第24期，它对细胞

细胞均具有感染能力，并体 ,从而 可有效地 源基因 合

性，具有感染谱广、感染效 及稳定表的优势[ll'l2]o本 选取慢病毒构建了靶向干

扰Drpl基因的慢病毒载体，并成功转染SH-SY5Y 细胞。本 中，；吟霉素最

浓度筛选、慢病毒载体质粒的构建及测定，为后期获得稳定干扰

Drpl基因的SH-SY5Y细胞模型奠定了基础，之后

进一步采用实时荧光定量PCR和Western blotting 图2重组慢病毒载体质粒Drpl-RNAi结构图3讨论PD近年的发病率明显上升，调查显示65岁以

上人口 PD患病率约为l. 5%，给社会和经济发展带 来沉重的负担研究⑷表明，线粒体和融合

的动态

与PD的发病 关。线粒体分 合 多属于

保守的三磷酸鸟R(GTP)

族,Drpl

中线粒体的关键分子，主要位于细胞浆。在线粒体分

，Drpl可被招募 粒体 ，富集于线粒体潜在位点，通过GTP水解致线粒体⑸。研究⑷发现,

中脑多巴胺神经元被敲除Drpl基因的小鼠可出现 PD样运动障碍,纹状体内多巴胺样神经终末和多巴

胺的 显减少，其多巴胺神经元内的线粒体明显变长、运动变慢，轴突终末内线粒体匮乏。研 ⑴发现，果蝇中Drpl基因缺失可 起线粒体的损伤,导致神经肌肉接头突触传递的障碍，同样线粒

体的损耗影响了 ATP产，神经肌肉接头处突触传

递的能量供应不足。总之,Drpl介的线粒体断裂 与PD发病有

联系。对Drpl的进一步

：,尤

对它的作用方式 能的 ，有助于阐明PD的发病，也为临 疗新靶点的发现提供实验依据。RNA干扰(RNAi)技术是通过双链RNA高效

特异地 源基因mRNA,从而抑制细胞内特定基因表达的一种基因沉默技术⑻。目前国内外用

于沉默基因 的RNAi载体种类 有质粒、腺病毒和慢病毒等,每种载体各有特点。质粒载体的 速度快，流程相对简单，但其转染效 ，约为37%左右，且多为瞬时转染⑼；腺病毒载体包装容

，对人致病性低,能够在

细胞中感, 带的 源基因

合 细胞体 中, 能 抑 靶 基 因 的 效[l0];慢病毒载体 人类 型病毒为基础发展起来的基因载体，与一般的逆转录病毒载体相4检测Drpl mRNA

的相对 ，结果提不Drpl的 有效抑制，这为进一步

Drpl与PD 的关系 定 基 o，为了探究Drpl与PD发病之间的关

系， 本

过构建 Drpl 基因的 siRNA 慢病毒载体， 建 稳定干扰 Drpl 基因 的 SH-SY5Y 细 胞

模型， 为进一步 Drpl 基因在 PD 发病过程中的

作用 定 模型基 o参考文献：[1] Bose A, Beal MF. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's dis­

ease [J]. Neurochem, 20l6 ,l39( Suppl l) ：2l6-23l.[2] Moon HE, Paek SH. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's dis­

ease [J]. Exp Neurobiol, 20l5 ,24(2) ：l03-ll6.[3] Blesa J, Przedborski S. Parkinson's disease: animal models and do­

paminergic cell vulnerability[ J]. Front Neuroanat, 20l4,8：l55.[4] Abdullah R, Basak I, Patil KS, et al. Parkinson's disease

andage: The obvious but largely unexplored link[ J]. Exp Geron­

tol, 20l5,68：33-38.[5 ] Cho B, Choi SY, Cho HM, et al. Physiological and pathological

significance of dynamin- related protein l ( drpl ) -dependent mito­chondrial fission in the nervous system[ J]. Exp Neurobiol, 20l3 , 22(3) ：l49-l57.[6] Berthet A, Margolis EB , Zhang J, et al. Loss of mitochondrial fis­

sion depletes axonal mitochondria in midbrain dopamine neurons

[J]. J Neurosci, 20l4,34(43) ：l4304-l43l7[7] Verstreken P, Ly CV, Venken KJ, et al. Synaptic mitochondria

are critical for mobilization of reserve pool vesicles at Drosophila

neuromuscular junctions[ J]. Neuron, 20l5 ,47 ：365-378.[8 ] Liao Z, Wang X, Lin D. Construction and identification of the

RNAi recombinant lentiviral vector targeting human DEPDC7 gene

[J]. Interdiscip Sci, 20l7 ,9 (3 ) ：350-356.[9]陈小艳，张弓，刘芳，等•不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20

的探讨[J] •实用医学杂志,2009,25(l9) ：320l-3203.[l0]马晓生，姜建元，吕飞舟，等•腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间

质干细胞的比较[J].中华医学杂志,006,47) ：3340-3344.[ll ] Liu YP, Westerink JT, ter Brake O , et al. RNAi-inducing lentivi-

ral vectors for anti-HIV-l gene therapy [ J ]. Methods Mol Biol,

20ll,72l：293-3ll.[2]郑传宜，陈政纲，白恩琪，等•人GLUT3基因RNA干扰病毒载

体的构建与鉴定[J].中南大学学报(医学版),0l6,l (5 ):

4562.

(收稿日期：20l9-04-2l)