探讨PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中的应答差异

白杰; 高志涛; 石龙; 底静; 李嵩; 李祥; 聂晶; 韩为东 【期刊名称】《《解放军医学院学报》》 【年(卷),期】2019(040)004 【总页数】7页(P357-363)

【关键词】免疫治疗; PD-1抑制剂; 小鼠肿瘤模型

【作 者】白杰; 高志涛; 石龙; 底静; 李嵩; 李祥; 聂晶; 韩为东

【作者单位】[1]解放军总医院第一医学中心生物治疗病区/分子免疫室 北京100853; [2]解放军联勤保障部队第980医院 河北石家庄050051 【正文语种】中 文 【中图分类】R730.51

肿瘤基因突变的累积促进肿瘤生长，同时也增加了被免疫细胞识别的风险，然而在肿瘤发生演变过程中，肿瘤细胞能够借助免疫抑制性细胞因子、趋化因子、调节性免疫细胞及免疫检查点通路下调机体免疫功能等逃避免疫系统的监视，维持肿瘤的免疫耐受[1-2]。随着肿瘤治疗研究的日益深入，抗肿瘤免疫调节及肿瘤免疫治疗受到广泛关注，已成为重要的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫抑制在有效的抗肿瘤免疫反应中具有显著的阻碍作用，PD-1/PD-L1抑制剂等免疫检验点抗体药物能够激活效应T淋巴细胞，阻断肿瘤免疫抑制机制，恢复肿瘤患者被抑制的免疫活性，从而识别并杀死肿瘤细胞，为肿瘤免疫治疗提供了新思路和新方法[3-4]。截止2018

年12月，PD-1抑制剂，包括Pembrolizumab (Keytruda)、Nivolumab (Opdivo)等已经批准用于10余种肿瘤的治疗，包括肺癌、恶性黑色素癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌等，肿瘤客观缓解率及生存期均显著提升[5-6]。然而，PD-1抑制剂也有其自身的局限性，其单药使用反应率一般在10% ～ 40%之间，不是对所有肿瘤类型有效，且即使在敏感型肿瘤中也只有部分人群能够获益[7]；同时越来越多的临床研究发现PD-1抑制剂免疫治疗也存在继发耐药现象[8]。如何提高PD-1抑制剂临床疗效，探索其作用机制与治疗抵抗机制从而精准预测临床反应性是亟待解决的重要科学问题与临床难题；解决这些问题离不开探究性与验证性的动物实验，本研究旨在对比几种常用小鼠肿瘤模型对PD-1抑制剂的反应性差异，并初步探究其肿瘤浸润T淋巴细胞的表型及活性，为PD-1抑制剂相关研究提供参考。 材料与方法

1 实验动物与细胞 B16黑色素瘤、CT26结肠癌、MC38结肠癌细胞株均购于国家实验细胞资源共享平台(北京总部)并保存在本实验室；BALB/c小鼠(雌性、6周龄、体质量约20 g)以及C57BL/6小鼠(雌性、6周龄、体质量约20 g)均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 主要试剂与仪器 PBS缓冲液，RMPI1640培养基，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清(美国Gibco公司)；流式细胞术抗体anti-CD3-PerCP、anti-CD8α-APC、anti-IFN-γ-PE，anti-Ki67-FITC(美 国BioLegend公司)；PD-1抑制剂anti-PD-1 mAb(美国Bioxcell公司)；小鼠肿瘤组织解离试剂盒，小鼠CD8+ T细胞分选磁珠(德国美天旎公司)；小鼠肿瘤组织淋巴细胞分离液(Solarbio公司)；BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

3 小鼠肿瘤模型 体外培养B16、CT26、MC38细胞并传代至适宜状态后制备细胞悬液，于无菌条件下以PBS调整细胞浓度为2×106/ml，CT26肿瘤细胞悬液于BALB/c小鼠背部皮下无菌接种，接种量为100μl，肿瘤细胞接种量为2×105/只；

MC38、B16肿瘤细胞悬液于C57BL/6小鼠背部皮下无菌接种，接种量为100μl，肿瘤细胞接种量为2×105/只。每日观察荷瘤小鼠的生长情况。荷瘤第6天起隔日测量瘤块体积，用游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径。肿瘤体积=瘤体长径×瘤体短径2/2；当肿瘤体积达到100 mm3时，视为荷瘤成功，CT26荷瘤小鼠约10 d可成瘤，MC38、B16荷瘤小鼠约15 d可成瘤。

4 实验动物分组及处理 当肿瘤体积达到100 mm3后，CT26及B16荷瘤小鼠随机分为2组，于当日开始腹腔注射给药。PBS对照组：给予PBS 100μl/只，1次/2 d，连续5次；PD-1抑制剂治疗组：将PD-1抑制剂原液用PBS在无菌条件下调整浓度至 2μg/μl，给予 200μg(100μl)/只，1 次 /2 d，连续5次。每2 d用游标卡尺测量瘤体的最长径与最短径，绘制肿瘤生长曲线。MC38荷瘤小鼠随机分为4组，腹腔注射给药。PBS对照组：给予PBS 100μl/只，1次/2 d，连续5次；PD-1抑制剂治疗组：将PD-1抑制剂原液用PBS在无菌条件下调整浓度至2μg/μl，给予200μg (100μl)/只，1次/2 d，连续5次；PD-1抑制剂高剂量治疗组：将PD-1抑制剂原液用PBS在无菌条件下调整浓度至 4μg/μl，给予400μg (100μl)/只，1次/2 d，连续5次；PD-1抑制剂延迟治疗组：待肿瘤体积达到300 mm3后给予PD-1抑制剂治疗，将PD-1抑制剂原液用PBS在无菌条件下调整浓度至2μg/μl，给予200μg (100μl)/只，1次/2 d，连续5次。每2 d用游标卡尺测量瘤体的最长径与最短径，绘制肿瘤生长曲线，同时记录小鼠生存时间，绘制生存曲线。CT26、B16与MC38荷瘤小鼠的终止测量标准相同：当小鼠肿瘤最长径≥20 mm或到达荷瘤第45日时，脱颈处死小鼠；观察小鼠生存期终点为荷瘤第100日，之后脱颈处死剩余小鼠。

5 小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞绝对数量计数 完成腹腔注射PD-1抑制剂5次之后第2日，脱颈处死MC38荷瘤小鼠，完整取材肿瘤组织，进行称重并记录，之后使用小鼠肿瘤组织解离试剂盒将其制备成为单细胞悬液，使用小鼠肿瘤组织淋巴细

胞分离液从单细胞悬液中分离小鼠肿瘤淋巴细胞，使用小鼠CD8+ T细胞分选磁珠从小鼠肿瘤淋巴细胞中分离小鼠CD8+ T淋巴细胞并进行细胞计数，与之前所测量肿瘤重量相比对，计算单位重量肿瘤中CD8+ T淋巴细胞的数目。

6 流式细胞术检测小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞亚群完成腹腔注射PD-1抑制剂5次之后第2日，脱颈处死MC38荷瘤小鼠，完整取材肿瘤组织，进行称重并记录，之后使用小鼠肿瘤组织解离试剂盒将其制备成为单细胞悬液，使用流式抗体anti-CD3-PerCP、anti-CD8α-APC、anti-IFN-γ-PE，anti-Ki67-FITC标记，流式细胞仪进行检测。

7 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行数据分析。观测资料主要是计量数据，结果均为正态，以-x±s表示。多组样本均数比较采用单因素方差分析+两两比较LSD-t检验，多时点观测数据比较采用重复测量方差分析+组间两两比较LSD-t检验+时间两两比较差值t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果

1 三组荷瘤小鼠对PD-1抑制剂的应答存在差异

CT26、B16及MC38荷瘤小鼠分别给予PD-1抑制剂治疗，绘制肿瘤生长曲线并进行比较分析。结果如下：1)与PBS对照组对比：CT26荷瘤小鼠对PD-1抑制剂不敏感，PBS对照组与PD-1抑制剂治疗组的生长曲线没有明显区别，提示PD-1抑制剂治疗无效(图1)；2)尽管PD-1抑制剂在人黑色素瘤治疗中取得较高临床反应性，但本实验中，PD-1抑制剂对B16黑色素瘤荷瘤小鼠仅有微弱的抑制肿瘤生长的作用(图2)；3)而在MC38荷瘤小鼠模型中，PD-1抑制剂能够显著抑制肿瘤的生长，且MC38荷瘤小鼠对PD-1抑制剂的反应性存在个体差异(图3)。 图 1 PD-1抑制剂对CT26荷瘤小鼠肿瘤生长无抑制作用。 12只BALB/c小鼠在背部皮下荷瘤CT26细胞，细胞量为2×105/只；在第12日随机分为2组，12日起分别给予腹腔注射PBS(CON组，6只)或PD-1 mAb(PD-1 mAb组，6只)，

每2 d一次A：CON组小鼠肿瘤生长曲线； B：PD-1 mAb组肿瘤生长曲线; C：两组平均肿瘤体积差异无统计学意义(P均＞0.05, d22、d24、d26、d28、d30)Fig. 1 PD-1 inhibitor had no anti-tumor effect on CT26 tumor-bearing mice. Twelve BALB/c mice were subcutaneously inoculated with 2×105 CT26 cells. On day 12, they were randomly divided into CON group and PD-1 inhibitor group with 6 mice in each group, and then PBS/PD-1 mAb was injected intraperitoneally every 2 days, respectivelyA: Tumor growth curves in CON group; B: Tumor growth curves in PD-1 mAb group; C: There was no signif i cant difference in tumor volume between 2 groups (d22, d24, d26, d28, d30)

图 2 PD-1抑制剂对B16荷瘤小鼠有微弱的肿瘤抑制作用。12只BALB/c小鼠在背部皮下荷瘤B16细胞，细胞量为2×105/只；在第15日随机分为2组，分别给予腹腔注射PBS(CON组，6只)或PD-1 mAb(PD-1 mAb组，6只)，每2 d一次A：CON组小鼠肿瘤生长曲线； B：PD-1 mAb组肿瘤生长曲线; C：两组平均肿瘤体积从第28天开始显示出统计学差异(aP＜0.05，d28、d30)Fig. 2 PD-1 inhibitor had minor anti-tumor effect on B16 tumor-bearing mice. Twelve C57BL/6 mice were subcutaneously inoculated with 2×105 B16 cells. On day 15, they were randomly divided into CON group and PD-1 inhibitor group with 6 mice in each group, and then PBS/PD-1 mAb was injected intraperitoneally every 2 days, respectivelyA: Tumor growth curves in CON group; B: Tumor growth curves in PD-1 mAb group; C: There were signif i cant differences in tumor volume between 2 groups on day 28 and day 30 (aP＜0.05)

2 MC38荷瘤小鼠对PD-1抑制剂的反应性与肿瘤大小及给药剂量的关系 为深入

探讨MC38荷瘤小鼠对PD-1抑制剂的反应性，在PBS对照组与PD-1抑制剂治疗组的基础上增设了PD-1抑制剂高剂量治疗组与PD-1抑制剂延迟治疗组，并观察其肿瘤生长情况并记录小鼠生存期。比较分析如下：与200μg/只/次PD-1抑制剂给药剂量相比，400μg/只/次高剂量PD-1抑制剂对肿瘤抑制效果进一步提高(图3)，6只MC38荷瘤小鼠中，1只小鼠的肿瘤完全消失(CR)(图3)；同时，PD-1抑制剂高剂量治疗组的生存期也进一步延长(图4)。但当肿瘤体积超过300 mm3后，PD-1抑制剂的延迟给药对肿瘤生长的抑制作用显著降低 (图 3)。3 PD-1抑制剂能促进肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖与活性 通过分选各组小鼠肿瘤浸润CD8+ T淋巴细胞，我们发现：1)与PBS对照组相比，PD-1抑制剂治疗组小鼠单位重量肿瘤中浸润的CD8+ T细胞绝对数量显著上调，且PD-1抑制剂高剂量组中CD8+T细胞数量高于低剂量治疗组(P均＜0.05)(图5)；2)应用流式细胞术测定CD8+ Ki67+，CD8+IFN-γ+，CD8+ Ki67+ IFN-γ+三种细胞在 CD8+T细胞中的比例，发现类似趋势，与PBS对照组相比，PD-1抑制剂治疗组三种细胞的比例均上调，PD-1高剂量治疗组与PD-1抑制剂治疗组相比三种细胞的比例进一步升高，三组数据有统计学差异(P均＜0.05)，表明PD-1抑制剂能够显著促进CD8+ T细胞的浸润、增殖及其活性(图6)。

图 3 PD-1抑制剂显著抑制MC38荷瘤小鼠肿瘤生长。24只C57BL/6小鼠在背部皮下种植MC38细胞，细胞量为2×105/只；在第15日随机分为4组，包括CON组、PD-1抑制剂组，PD-1抑制剂高剂量治疗组、PD-1抑制剂延迟治疗组，每组6只。15日起前三组分别给予PBS、PD-1 mAb 200μg/只、PD-1 mAb 400μg/只腹腔注射，2 d/1次；延迟治疗组小鼠待肿瘤生长至300 mm3 (第21 ～ 23日)后给予PD-1 mAb腹腔注射，200μg/只，2 d/1次A: CON组小鼠肿瘤生长曲线；B: PD-1 mAb200μg组肿瘤生长曲线; C：PD-1 mAb 200μg组小鼠平均肿瘤体积从第25天开始显著低于CON组(aP＜0.05, vs CON, d25, d27,

d29, d33, d35, d37); bP＜0.01, vs CON (d29)； D: PD-1 mAb(400μg)组小鼠肿瘤生长曲线；E： PD-1 mAb 延迟给药组肿瘤生长曲线； F: PD-1 mAb 200μg组肿瘤抑制作用低于PD-1 mAb 400μg组，但高于PD-1 mAb 延迟给药组(aP＜0.05, vs PD-1 mAb 200μg，d33)Fig. 3 PD-1 inhibitor had significant anti-tumor effect on MC38 tumor-bearing mice. Twenty-four C57BL/6 mice were subcutaneouslyinoculated with 2×105 MC38 cells. On day 15, they were randomly divided into CON group，PD-1 inhibitor group, high-dose PD-1 inhibitor treatment group and PD-1 inhibitor delayed treatment group, with 6 mice in each group. Mice in former 3 groups were injected intraperitoneally every 2 days using PBS/PD-1 mAb(200μg/mouse)/PD-1 mAb (400μg/mouse), respectively. Mice in PD-1 inhibitor delayed

treatment group were treated with PD-1 mAb (200μg/mouse) every 2 days after tumor reached a volume of 300 mm3(d21- d23)A: Tumor growth curves in CON group; B: Tumor growth curves in PD-1 mAb(200μg) group; C: There were signif i cant differences in tumor volume between 2 groups on day 25-37 (aP＜0.05, d25, d27, d29, d33, d35, d37; bP＜0.01, d29); D: Tumor growth curves in PD-1 mAb(400μg) group; E: Tumor growth curves in PD-1 mAb delayed treatment group; F: The anti-tumor effect in PD-1 mAb 200μg group was signif i cantly lower than PD-1 mAb 400μg group on day 39, but higher than PD-1 mAb delayed treatment group on day 33(aP＜0.05, vs PD-1 mAb 200μg group)

图 4 各组MC38荷瘤小鼠生存曲线对比Fig. 4 Comparison of survival curves of MC38 tumor-bearing mice in each group

图 5 各组MC38荷瘤小鼠肿瘤浸润CD8+ T淋巴细胞计数(aP＜0.05； bP＜

0.01)Fig. 5 Tumor infiltrating CD8+ T lymphocytes count of MC38 tumor-bearing mice in each group (aP＜0.05； bP＜0.01)

图 6 各组MC38荷瘤小鼠中肿瘤浸润CD8+ Ki67+、CD8+ IFN-γ+、CD8+ Ki67+ IFN-γ+ T淋巴细胞的比例(aP＜0.05； bP＜0.01)Fig 6 The proportion of CD8+ Ki67+, CD8+ IFN-γ+, CD8+ Ki67+ IFN-γ+ tumor inf i ltrating T lymphocytes of MC38 tumor-bearing mice in each group (aP＜0.05； bP＜0.01) 讨 论

PD-1/PD-L1通路激活诱导效应T细胞耗竭并向免疫抑制性调节T(Treg)细胞转化，打破免疫微环境的平衡，使天平向免疫抑制倾斜，肿瘤免疫逃逸发生；而阻断PD-1/PD-L1可逆转肿瘤免疫微环境，细胞毒性T细胞重新活化，增强机体内源性的抗肿瘤免疫效应[9-10]。近年来PD-1抑制剂取得了一系列令人惊奇的治疗效果，有关PD-1的研究也方兴未艾。

在PD-1抑制剂的应用推动肿瘤治疗进步的同时，PD-1抑制剂的原发与继发抵抗也在困扰着医务人员与研究者。PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗的反应性很少超过40%，且其中主要为部分应答。此外，在PD-1/PD-L1抑制剂的初始反应之后，大多数患者发生获得性耐药，最终导致肿瘤进展或复发[8,11]。目前的研究表明诸多因素导致肿瘤对PD-1抑制剂原发性抵抗，如肿瘤微环境中浸润T淋巴细胞减少，肿瘤突变抗原负荷减低，表观遗传学异常导致Th1型趋化因子表达沉默，重要的免疫信号分子表达降低，免疫抑制性分子高表达进而免疫调控失衡等；肿瘤信号通路，如WNT-β-catenin、PI3K-Akt等通路在PD-1抑制剂原发抵抗机制中也具有重要作用。此外，代谢水平、环境因素等也会引起机体对PD-1抗体对抵抗。而PD-1抑制剂获得性抵抗的机制包括JAK-STAT通路基因突变影响肿瘤细胞对干扰素信号的响应、PD-1以外免疫检查点的表达上调从而诱发肿瘤浸润效应T细胞再

度耗竭等[3,12-14]。除上述机制之外，还有更多的抵抗机制等待验证与发现。 目前研究表明，肿瘤浸润T效应细胞的存在是PD-1抑制剂产生治疗效果的关键因素[15]；而PD-1抑制剂抵抗会导致肿瘤浸润T效应细胞耗竭，因此研究如何激活肿瘤浸润T效应细胞对克服PD-1抑制剂抵抗至关重要。现有研究成果提示联合疗法可能是克服PD-1抑制剂抵抗、提高PD-1抑制剂反应性的前进方向，通过联合其他细胞因子如IL-21或免疫检查点抑制剂或CpG寡核苷酸可克服PD-1抑制剂治疗抵抗[16-18]，但目前已有的联合疗法无法完全克服PD-1抑制剂获得性抵抗，因此亟需探索更多联合治疗方法。

研究PD-1抑制剂的作用、抵抗机制和联合疗法离不开适宜的动物模型，在本研究中我们比较几种常用小鼠肿瘤模型对PD-1抑制剂的反应性进行，发现PD-1抑制剂在不同小鼠肿瘤模型中反应性存在很大差异。在CT26小鼠结肠癌模型中，PD-1抑制剂对于肿瘤生长几乎没有任何抑制作用，我们推测CT26肿瘤对PD-1抑制剂原发性抵抗，CT26肿瘤模型可能适宜用于研究PD-1抑制剂抵抗机制。在B16小鼠黑色素瘤模型中，PD-1抑制剂在人黑色素瘤患者中并没有表现出良好反应性，能够观察到PD-1抑制剂对肿瘤产生了抑制作用，但给药组与对照组的肿瘤生长曲线整体对比并没有统计学差异，PD-1抑制剂单药对于B16肿瘤的抑制性还不够强，与其他药物联用如肿瘤疫苗或其他免疫检查点抑制剂可能能够增强对肿瘤的抑制作用。MC38小鼠肿瘤模型作为一种高免疫原性肿瘤模型，表现出对PD-1抑制剂良好的反应性，PD-1抑制剂对于MC38肿瘤产生明显抑制作用，且在PD-1抑制剂整体有效的同时，在给药组内又有明显的个体差异，在我们的实验中甚至观察到了给药之后的肿瘤超进展，MC38小鼠肿瘤模型对PD-1抑制剂的反应性最接近PD-1抑制剂在临床应用中的反应性。通过本研究我们确定MC38小鼠荷瘤模型为研究PD-1抑制剂抗肿瘤效应的适宜模型。在此基础上，我们将展开更深层次的研究，探究PD-1抑制剂增强抗肿瘤效应与PD-1抑制剂抵抗相关机制，探索PD-1

抑制剂治疗后肿瘤微环境以及肿瘤浸润T细胞信号通路、关键转录因子的改变情况，并尝试发现新的有效联合治疗策略。 参考文献

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