实验五食品中沙门氏菌的检验

实验五 食品中沙门氏菌的检验

、实验目的要求

1、 了解食品的质量与沙门氏菌检验的意义。 2、 掌握沙门氏菌的生物学特性。

3、 掌握沙门氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、 掌握沙门氏菌属血清学试方法。 5、 掌握食品中沙门氏菌检验的方法和技术。

、原理

沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道， 其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆 菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒， 副伤寒以及食物中毒或败血症。 在世界各地的食物中毒中， 沙门氏菌食物中毒常占首位或第 二位。

食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤： 1 前增菌； 2 选择性增菌； 3 选择性 平板分离沙门氏菌； 4 生化试验，鉴定到属； 5 血清学分型鉴定。 目前检验食品中的沙门 氏菌是按统计学取样方案为基础， 25g 食品为标准分析单位。

三、试剂和仪器

一) 最先准备的器材

规格名称

数量

用途

稀释样品 制缓冲蛋白胨水 制增菌液、培养基 制三糖铁培养基和

1、500ml 广口瓶 2、500ml 三角瓶 3、250ml 三角瓶 4、 15×150mm 试管 5、13×130mm 试管 6、1ml 移液管 7、 10ml 移液管

8、直径为 90 mm 平皿 12 套 9、250ml 量筒

二) 应灭菌的其它器材

剪刀 1 把 不锈钢汤匙

三) 应准备的培养基和试剂

1 个 1 个 8 个 18 支 30 支 5 支 2 支 1 支

PH7.2 尿素 制蛋白胨水等

制 BS 、 SS平板

1把

称量纸适 量

培养基总量 所用容器

1. 2. 3. 4. 5.

缓冲蛋白胨水 (BP) ： 氯化镁孔雀绿 (MM)增菌液： 亚硒酸盐胱氨酸 (SC) 增菌液： 亚硫酸铋琼脂 (BS) ： 4 皿

1瓶 1瓶 1瓶 1瓶

1瓶

225ml/瓶 100ml/瓶 100ml/瓶 60ml /瓶 100ml/瓶

500ml 三角瓶 250ml 三角瓶 250ml 三角瓶 250ml 三角瓶 250ml 三角瓶

SS琼脂： 6 皿

6. 7. 8. 9.

三糖铁琼脂： 尿素琼脂

6支 6支 6支 6支

赖氨酸）：

6ml/支 4ml/支 2ml/支 4ml/支 6支

40 ml 25 ml 20 ml 30 ml 1ml/支

15×150mm试管 15×150mm试管 13×100mm试管 13×130mm试管

10 ml 13 ×130mm试管

（pH7.2） ： 蛋白胨水：

氰化钾 （KCN）培养基： 氨基酸脱羧酶试验培养基

10. 氨基酸脱羧酶试验培养基

11.

不含赖氨酸） ：

6 支 1ml / 支 10 ml 13 ×130mm试管

12. 沙门氏菌因子血清： 多价血清 ；11种因子血清。按 26 种用于初步分型； 57种用于 进一步分

型； 163 种用于详细分型。

四、实验内容

样品处理→→前增菌→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清 学试验鉴别→→结果报告

第一天 样品处理和增菌培养

（一）样品处理

1、加工过的样品： 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。称取检样 25g，加在装有 225mL

缓冲蛋白陈水的 500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以 8000～ 10000r/min 打碎 1min， 或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，备用。

2、未加工样品 ： 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。 各取 25g（25mL） 加入灭菌生

理盐水 25mL，按前法做成检样匀液，备用。 （二）、前增菌和增菌

1、加工过的样品 ： 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。

接种操作： 将混均匀的稀释样液放在 36± 1℃培养 4h（ 干蛋品培养 18～ 24h） ；移取 10mL，

转种于 100mL氯化镁孔雀绿增菌液 （ MM）或四硫酸钠煌绿增菌液内， 于 42℃培养 18～ 24h。同时，另取

10mL，转种于 100mL 亚硒酸盐肮氨酸增菌液 （SC）内。

培养： 于 36± 1℃培养 18～24h。

2、未加工样品： 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。

接种操作： 取 25mL匀液，接种于 100mL氯化镁孔雀绿增菌液 （MM） 或四硫磺酸钠 煌绿增菌液

内，于 42℃培养 24h；另取 25mL接种于 100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液 （SC） 内 培养操作： 于 36±

1℃培养 18～24h。

第二天 接种选择性平板进行分离培养

一）分离培养

接种操作： 取前天增菌培养的增菌液 1 环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板 （ BS） 和一个

DHL琼脂平板 （ 或 HE琼脂平板、 WS或 SS琼脂平板 ） 。两种增菌液可同时划线接种在 同一个平板上。

培养操作： 于 36± 1℃分别培养 18～24h（DHL、HE、WS、SS）或 40～48h（BS） ，观察 各个

平板上生长的菌落。

第三天 观察分离结果，从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼 脂（pH7.2） 、 氰化钾 （KCN）和赖氨酸脱羧酶试验 培 养基

（一） 、观察分离结果 典型的沙门氏菌菌落形态如下 ：

A、在 HEKTOEN氏肠道菌 （ HE）琼脂 上。

菌落呈兰绿至兰色， 带或不带黑色中心。 许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心 或几乎全部黑色的菌落。

B、亚硫酸铋 （BS）琼脂 上。

产硫化氢的菌落为 黑色， 有时带有金属光泽，呈褐色，灰色或黑色。菌落周围的培养 基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。

C、 SS琼脂 上： 无色半透明 ；产硫化氢菌株，有的菌落中 心带黑色 。

（二）、五项生化试验

接种操作：

1、接种 三糖铁琼脂： 从选择性琼脂平板上，直接挑取 2个或更多个菌落 ，分别接种 三 糖铁琼

脂 。用一空白培养基作对照试验。

用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位，接种 TSI 斜面，先在斜面上划线，再于 底层穿刺。 不需灼烧接种针 ，接种后面四项生化培养基。

2、接种 蛋白陈水 （ 供做靛基质试验 ） 、尿素琼脂 （pH7.2） 、氰化钾 （KCN）培养基和 赖氨

酸 脱竣酶试验。各 用一空白培养基作对照试验。

接种三糖铁琼脂的同时，再接种 蛋白陈水 （供做靛基质试验 ） 、尿素琼脂 （pH7.2） 、氰化 钾

（KCN） 培养基和 赖氨酸脱羧酶试验 培养基及对照培养基各 1 管。

培养操作： 于 36± 1℃培养 18～24h，必要时可延长至 48h。 革兰氏染色与镜检 ：从平板上挑取可疑菌落进行革兰氏染色与镜检

第四天 观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性，做血清学试验

（一）、观察五项生化试验结果

1、 在三糖铁琼脂内，符合沙门氏菌属种的反应结果见表 1。

表 1 沙门氏菌属种在三糖铁琼脂内的反应结果 斜

底 层 产 气 产硫化氢 可疑为沙门氏菌属和种 面

- + -

+ + + + +/- +/- + - + + - - 沙门氏菌属 沙门氏菌Ⅱ 沙门氏菌属 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌 - 在三糖铁琼脂内 只有斜面产酸并同时硫化氢 (H 2S) 阴性的菌株可以排除，其他的反应结 果均有沙门氏菌的可能 ，同时也均有不是沙门氏菌的可能。

2、符合沙门氏菌属的五项生化试

按表 2 判定结果，沙门氏菌属 五项生化试 的结果应符合 A1、 A2 和 B1，其他反应结果 均可以排

除。

表 2 沙门氏菌属种生化反应初步鉴别表 反应序号 H2S 靛基质 尿素 (pH7.2) 氰化钾 (KCN) 赖氨酸脱羧酶 判定菌属 沙门氏菌属 沙门氏菌属(少见) 沙门氏菌属、 甲型号副伤寒沙门氏菌属 尿素琼脂 判定菌属 甲型号副伤寒沙门氏菌 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ 沙门氏菌个别变体、 A1 A2 B1

+ + - - - + - - - - - - - - - - + + + - 符合反应序号 A1，为沙门氏菌属典型反应，判定为沙门氏菌属细菌。如

赖氨酸脱羧酶 (pH7.2) 、氰化钾 (KCN)和赖氨酸脱羧酶试验三项中， 有一项异常，按表 3 可判定沙门氏菌： 表3

尿素(pH7.2) 氰化钾 (KCN) - - + 二)、血清学分型鉴定 - + - - + + 1、抗原的准备

一般采用 1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 ( 如 2.5%一 3%)培养基上再检查；如果是

由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1mL生理盐水中做成浓菌液，于 酒精灯火焰上煮沸后再检查。 H 抗原发育不良时， 将菌株接种在 0.7%～0.8%半固体琼脂平板 的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有

体琼脂的小玻管 1～2 次，自远端取菌培养后再检查。

0.3%～ 0.4%半固

2、O抗原的鉴定

操作：用A～F多价 O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自 凝者为粗糙形菌株，不能分型。

玻片凝集试验图

被 A～F 多价 O血清凝集者，依次用 O4；O3、 10；O7；O8；O9；O2和 O11因子血清做 凝集试验。

根据试验结果，判定 O群。被 O3、10 血清凝集的菌株，再用 O10、 O15、 O34、 O19单因子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O抗原成分的最后确定 均应根据 O单因子血清的检查结果， 没有 O单因子血清的要用两个 O复合因子血清进行核对。

不被 A～F多价 O血清凝集者，先用 57种或 163 种沙门氏菌因子血清中的 9种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的

O因子如下：

O 多价 1 A，B，C，D，E，F群（并包括 6，14 群）

O 多价 2 O 多价 3 O 多价 4 O 多价 5 O 多价 6 O 多价 7

1718， 21 群 13 ，

16 ，， ，3539 群 28 38， 30， ， 40， 41， 42， 43群

44， 45， 47， 48群

50， 51， 52， 53群

55， 56， 57， 58群

O 多价 8 59， 60， 61， 62群

O 多价 9 63，65，66，67 群

五、思考题

1、 如何提高沙门氏菌的检出率？

2、 沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？解释这些现象？ 3、 沙门氏菌检验有哪 5 个基本步骤？

4、 食品中能否允许有个别沙门氏菌存在？为什么？