南极土壤微生物宏基因组文库构建及其抗肿瘤活性初探.pdf

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南极土壤微生物宏基因组文库构建

及其抗肿瘤活性初探\"

&\"\"赵!晶!!杨祥胜!!曾润颖\"!

!#厦门大学生命科学学院!厦门&’!$$)\"\"#国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室!厦门&’!$$)\"

&#国家海洋局第三海洋研究所!厦门&’!$$)

摘要!!微生物代谢产物是药物的重要来源之一!然而采用传统的分离培养筛选的手段仅能对不到!;的微生物资源进行研究开发#通过构建环境样品微生物宏基因组文库能突破人工培养的瓶颈!直接克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇!并从中寻找新的药物和活性次生代谢产物#实验直接提取南极中山站排污口土壤样品中微生物总基因组R为载体!构NB!以黏粒#:56>@DM!$K建了宏基因组文库!获得了约\"*$$$个克隆子!平均插入片段在&)QS以上!覆盖了至少<+’9S的微生物基因组信息#通过差异性R法对该文库进行筛选!获得!NB修复试验#RREI$&个具有抗肿瘤活性的克隆子!并采用9II法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定!表明克隆

子B,(&对卵巢癌细胞具有明显的生长抑制作用#关键词!!南极土壤微生物!宏基因组文库!抗肿瘤活性!次生代谢产物!!微生物作为生物活性物质的一个重要来源!为筛选和开发抗肿瘤药物提供了丰富的资源#在过去几十年里!人们从微生物资源中获得了众多的活性物质#然而!随着微生物活性产物研究开发的广泛开展!可培养微生物往往被重复培养和筛选!从中筛选到新活性物质的几率逐步下降#而且!利用现有技术培养的微生物仅占微生物总种类数的!;左右!而多达<或非可培养<;的未培养#58450U5>67%#%微生物没有得到研究!因此新物8D8(450U5>.S06

质的发现迫切需要新的技术和方法#宏基因组技术的建立!避开了传统的微生物的分离培养!能够最大限度地开发利用未-非可培养微生物的功能基因#同时!迄今为止所发现的大多数活性物质的生物合成基因都是成簇排列的!因此需要通过宏基因组技术来克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇!并从

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中寻找新的药物和活性次级代谢产物&#

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尽管从\"$世纪’$年始至今已分离得到了

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几十种具有潜在抗肿瘤活性的新物质&!但恶性肿

瘤中<$;以上的实体瘤的治疗未能达到满意效果!因此抗肿瘤新药筛选在肿瘤治疗中占重要地位#南极的极端环境中生存着众多尚未得到研究的特殊微生物!为筛选特异*新颖的抗肿瘤药物提供了丰富的资源#目前在利用构建环境宏基因组文库进行活性物质筛选的研究中!通过构建@DM-/7或细菌人工染色体#文库获得了次级代谢途径的聚酮合FB@%

’+!’+%

!成酶基因*抗菌素*抗生素等多种天然产物&

但尚未见到通过构建环境样品宏基因组文库筛选到抗肿瘤活性克隆子的报道!尤其是在南极*深海等极端环境中#本文构建了南极土壤样品的宏基因组RNB的@DM-/7文库!并采用指示菌株的差异性

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作为抗肿瘤活性物质的筛RNB修复试验#RREI%

选模式对所构建的文库进行初步筛选!获得了!&

$$’($)(!*收稿!\"$$’($*(!$收修改稿!\"

批准号$+%$+$’$\"$,(-./0>58/8?68.PDD#4D-#48!\"\"通讯作者!!3311

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个具有潜在抗肿瘤细胞活性的克隆子!并对其细胞水平的抗肿瘤活性进行了分析#

子的数目$

-总数目j包装效价#T5-Y%ZK

包装好的@DM-/7RNB文库总体积#-Y%!$%!筛选培养基的配制用于&--+&)乳糖!;!氯化钠$#);#使用前加入)-YI>.46

!!材料和方法

!$!!材料

--指示菌株&+&)6公司\"K

5K6>@DM!@DM-/7XUD>Q/U和G/1.K.4QOOOeY.4Q.1/81,2U>.4U购自:U>.U.1686公司\"I+RNB连接酶购自I.].E.公司\"消毒过滤膜装置购自9/00/K

D>6公司#南极沉积物样品取自中山站排污口!样品于$$)年\"月中国第\"!次南极考察期间采集!采集后保存于c\"$g@!带回实验室在无菌超净台分装后!转移至c%$g@保存#

$#!环境样品宏基因组234提取

根据原位裂解法的基础上加以改进

&!$

’#在)1样品中加入核酸提取缓冲液#!$$--D0-Y磷酸钠缓冲液#K=%#$%!!$$--D0-YI>/M(=@0#K

=%#$%!$$--D0-Y,RIB#K

=%#$%!!#)-D0-YN.@0!!;IBF!!$;蔗糖溶液%!蛋白酶]#终浓度\"$$\"

1--Y%!溶菌酶#终浓度!-1--Y%和\";:R:!混合均匀!于摇床中)$g@低速振荡过夜\"裂解完全后离心!上清加入等体积的苯酚i氯仿i异戊醇#\")i\"+i!%溶液抽提!直至抽提液中的杂蛋白消失#总RNB

用$#&-D0-Y醋酸钠#K=)#\"%和\"#)+&倍体积的预冷的无水乙醇进行沉淀!最终溶解于!-Y双蒸水#粗提总RNB用低熔点琼脂糖电泳进行检测!并用低熔点琼脂糖酶回收纯化#

$\"!宏基因组文库的构建

宏基因组RNB文库构建参照:5K6>@DM!@DM(/7XUD>Q/U和G/1.K.4QOOOeYC.4Q.1/81,2(>.4U相关的操作指导手册进行#噬菌体包装蛋白包装效价根据公式计算$

效价#K

T5--Y%j克隆数Z稀释倍数-包装后用于涂板的实际体积#-Y%按包装效价计算整个@DM-/7RNB文库中全部克隆

溶液&!$

’!内含@.@0\"$#$$\";!91:V+$

#$$\";!J6:V+$

#$$!;!盐酸硫氨素$#$$!;!Y(组氨酸*Y(精氨酸*Y(脯氨酸*Y(赖氨酸各$#$);!烟酸$#$!;!以及!-!$$体积的*$;乙醇#含!;7(生物素%#!$&!2278试验

菌株&+&-)#&+&-)将保存的RNB@DM-/7宏基因组文库转接到筛选培养基上!将形成抑菌透明圈的阳性克隆挑出接种于YF液体培养基!&*g@振荡培养%+\"$P#将不同培养时间的发酵液浸入%--直径的滤纸片!把滤纸片贴在上述固体培养基上于&*g@培养!\"P!以产生的抑菌圈大小的差异来判断其是否对RNB造成损伤以及活性高低#实验以在临床使用的抗肿瘤抗生素丝裂霉素#$#)\"

1%作为阳性对照#!$(!@88法测定体外肿瘤细胞生长抑制率

将克隆子B,(!!B,(&和含有:5K6>@DM!的eY!(F0569E菌株置于&*g@振荡培养!$(!!P!使各菌体达到对数生长期!测定BU’$$值!用YF培养基稀释菌液!使其BU’$$值均为!#\"#菌液离心后用无菌过滤膜装置过滤除菌!制成受试物#消化收集处于对数生长期的=V(%:C\"!!@!-U!

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-含$#\"--Y9II的CF:溶液!继续培养+P!1

去除9II!加入R9:V与甘氨酸缓冲液!&*g@温育$#!其)+!P!用酶标仪测定吸光值#*$8-%3j)

中+孔以全培液作空白对照!+孔作细胞悬浮液对照!每样平行测试&孔!以阿霉素作为阳性对照!同时以YF液体培养基和:56>@DM!的发酵液上清K作为实验对照组#

基因的要求#

#$\"!2278法结果

利用RREI法对环境样品@DM-/7文库进行功能筛选!发现!&个克隆子的发酵液和离心后的上清液对R-NB修复缺陷菌株&+&)’$

抑制率K!$$;X#BU对照PBU实验%-BU实验

!结果

$!!234提取结果

构建宏基因组文库的前提是获得大片段*高纯度和高浓度的宏基因组RNB!采用原位裂解法能最大限度地获取环境样品中的总RNB!避免因被样品微粒吸附而造成微生物RNB的损失!尤其适用于生物量较低的极端环境样品#实验结果表明!我们所得RNB片段在)$QS以上!满足构建@DM(/7文库的要求#图!%#

图!!南极沉积物样品总234提取结果

从左到右依次为$3R

NB--/2!提取的RNB!3R

NB-S/)7OOO$#!宏基因组文库构建

对文库进行滴度测定时!每!$\"Y包装后的重组@DM-/7能够获得)!$个克隆子!根据包装效价公式的计算!所构建的@DM-/7宏基因组文库包装

效率为)#!Z!$+

KT5--Y#该文库包装总体积为)&$\"Y!因此可获得\"*$&$个克隆子#以平均插入片段&)QS

计算!该宏基因组文库至少包括了<+’9S极端环境样品总RNB!满足后续功能基因筛选及寻找新

B,(&产生的抑菌圈最大!抗菌活性较强#用蛋白胨(

肉汤培养基对这两个克隆进行培养!取不同培养时间的发酵液和上清进行检测!包括阳性对照在内的所有测试样品在含野生菌株&+&-’&’菌株的蛋白胨(肉汤培养基上均不产生透明圈!而在含缺陷型菌株&+&-)-)表!!克隆子4:*!和4:*\"不同培养时间的发酵液及上清

对菌株\"%\")&Q!的抑菌活性比较$直径)//#

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#时间B,(!B,(&

-PBU发酵液上清发酵上清’$$

抑菌圈抑菌圈BU’$$

抑菌圈抑菌圈%$#*&$!+!&!#!$)!)!&<$#<*+!)!&!#\"$!!+#’!&#+!$!#\"$*!+!&!#&’$!)!&#+!!!#\"&&!)!\"!#&’&!)!&!\"!#+\")!+!\"#’!#)$%!+!\"#’!&!#+&+!+!\"!#)<)!)!\"!+!#)+*!+!!!#*\"!!)!\"#’!)!#’)!!)!!!#*%*!)!&#+!’!#’<%!+!$!#%&+!)!&!*!#%!$!)!!!#%*!!)!&!%!#%)!!)!!!#%<+!)!\"#’!<

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!!.%包括阳性对照在内的所有测试样品对野生菌株&+&-’&’均无抑菌作用

#$%!@88分析结果

在实验中!选取受试菌的培养时间为%+##-#!

图#!4:*\"不同培养时间的发酵液和上清对

234修复缺陷菌株\"%\")&Q!抑菌圈

#.%阳性对照\"#S%B,(&上清\"#4%B,(&发酵液

径%均较大#表!%#以卵巢癌细胞作为指示肿瘤细胞

株!测定B,(!和B,(&的抗肿瘤活性#对平行样品测试结果的统计分析显示!B,(&对卵巢癌细胞增殖具有明显的抑制作用!稀释倍数为!$时抑瘤率能达到));\"B,(!的抑瘤作用较不明显#两者的抑瘤率均随受试物浓度的增加而增加!初步表明在测定浓度范围内表现为剂量依赖性抑制#为了证实克隆B,(!和B,(&的抑瘤作用并非受培养基或载体的影响!同时以培养基和:5K6>@DM-/7作为实验对照!结果表明两者对卵巢癌细胞的增殖基本没有影响#图&%#

!讨论

筛选新的抗肿瘤药物一直都是癌症治疗方面的重要课题#从抗肿瘤药物的作用机理来看!多数抗肿瘤药物的作用机制主要是作用于RNB#而多数对RNB有损伤的物质虽有一定毒性但也具有抗肿瘤作用!其中毒性等副作用小的可作为抗肿瘤药物在临床上使用#本研究利用46!(#/差异性RNB修复测定方法!以RNB修复缺陷菌株&+&-)\"!

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获得了至少\"*$$$个克隆子!平均插入片段在&)QS以上!覆盖了至少<+’9S的微生物基因组信息!获得了较为丰富的微生物群体的遗传信息!为寻找新的功能基因簇*开发药物资源等提供了丰富的生物材料#并且通过RREI法!通过功能筛选快速鉴别出!&个具有潜在抗肿瘤活性的克隆子!通过对插入片段的测序!将获得完整的产抗肿瘤活性物质的基因簇#预期随着后续研究的进一步开展!从该$BMMD/0-6U.68D-6U>.U6D>.446MM/8P61686U/4.87T584(11U13TU/D8.07/H6>M/UT58450U5>67-/4>DD>.8/M-M#B0,8H/>9/4>D(3D1KK!\"$$$!’’$\")+!+\")+*S/D0

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筛选模型#中国抗生素杂志!\"$$!!\"’$!)+!%

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文库中可能发现更多的活性物质和极端环境微生物特殊的代谢途径#

致谢!感谢厦门大学生命科学院细胞生物学与肿瘤细胞工程实验室欧阳高亮博士在9II实验中

给予的协助#

参!考!文!献

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