复合拮抗菌对马尾松幼苗猝倒病的生物控制

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２６卷第２期　２００８年６月　海南大学学报自然科学版　ＮＡＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＨＡＩＮＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｖ０Ｉ．２６　Ｎｏ．２　Ｊｕｎ．２００８　文章编号：１００４—１７２９（２００８）０２—０１４９—０４　复合拮抗茵对马尾松幼苗猝倒病的生物控制　刘富平　，朱天辉　（１．海南大学海洋学院，海南海Ｅｌ　５７０２２８；２．四川农业大学林园学院，四川雅安６２５０１４）　摘要：盆栽试验结果表明：用坚强芽孢杆菌Ｂ一３０５菌株的发酵液浸泡马尾松种子和在灭菌土中施入不同　量的绿粘帚霉的厚垣孢子粉剂，对马尾松幼苗在出苗前和出苗后的发病率都有明显影响，并能使病害得以减　轻；防病效果随施入土壤中的厚垣孢子量的增加而加强；同时进行种子细菌化和施入厚垣孢子的处理的防病　效果要高于各单独处理，防病效果最高达到６１．２％；２种生物拮抗菌对松苗都有促生作用，其中联合处理与　对照相比，松苗高生长最大可提高５７％；生物防治持效期试验（半年后重新播种）显示，复合拮抗菌处理的防　病效果仍然最高，但绝对值有所下降，为５５．６％．　关键词：绿粘帚霉；坚强芽孢杆菌；生物防治；立枯病；马尾松　中图分类号：Ｑ　９３９．９６　文献标识码：Ａ　猝倒病也称立枯病，为重要的苗木根部病害，长期以来，化学防治是根部病害控制的主要途径，但化　学杀菌剂对人畜和环境的毒副作用也日益突出，一些杀菌剂的长期频繁使用也使病原菌的抗性不断增　强，以致防治效果大大降低，因此，开发无污染、无公害的生物控制新技术以克服上述化学防治的种种弊　端将具有重要的理论意义和实践意义．为此，本研究以绿粘帚霉、坚强芽孢杆菌为对象，探索了２种拮抗　菌在松苗猝倒病防治中的协同作用，以期达到局部重建土壤微生物区系，丰富根际微生物类群和持续控　制根部病害的目的．　１材料和方法　１．１　病原菌接种体的制备将丝核菌、腐皮镰孢菌、腐霉菌分别接种到经灭菌的玉米砂土培养基　中，　．　２５℃培养７　ｄ，然后放人冰箱中备用（供接种土壤用）．　１．２生物抗生菌制剂的制备　１．２．１厚垣孢子粉剂的制备以ＰＤ液体培养基作为绿粘帚霉菌（Ｇ．ｖｉｒｅｎｓ）产厚垣孢子的培养基，调培　养基ｐＨ为３后灭菌．将活化２　ｄ的绿粘帚霉平板用孔径为０．５　ｅｍ的打孔器打孔，接种一菌丝块于已灭　菌的ＰＤ液体培养基中，光照振荡（１２０　ｒ・ｍｉｎ　）并在３０℃下培养１个月（参照Ｔｓａｏ　的方法），待菌丝　丛产生大量的厚垣孢子后，用布氏漏斗滤取菌丝丛，放人盛有１００　ｍＬ无菌水的匀浆杯内，经５　０００　ｒ・　ｍｉｎ　匀浆３　ｍｉｎ，使菌丝体充分破碎，然后将匀浆液以１　０００　ｒ・ｍｉｎ　离心１０　ｍｉｎ，弃上清液，用硅藻土吸　附离心杯底的厚垣孢子，放人４℃冰箱中保存备用．　１．２．２芽孢杆菌液剂的制备将１支活化的坚强芽孢杆菌（Ｂ一３０５）斜面接种于１００　ｍＬ已灭菌的　牛肉膏蛋白胨液体培养基中，２５　ｏＣ、１２０　ｒ・ｍｉｎ　培养２４　ｈ后，用灭菌的移液管移取１０　ｍＬ发酵种子液，　接种于１００　ｍＬ已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，２５　ｏＣ、１２０　ｒ・ｍｉｎ　摇床培养３　ｄ，然后放人冰箱中　备用，在显微镜检菌液中绝大多数菌体产生芽孢，少部分则形成芽孢体．　１．３盆栽生防试验盆栽土以土壤＋砂按Ｖ＋壤：Ｖ砂＝１：１的比例配制而成，并施入Ｎ、Ｐ、Ｋ复合肥料，　用常规灭菌后，将玉米砂土培养基培养的３种病原菌接种体按　丝核菌：Ｖ镰刀菌：Ｖ腐霉菌＝１：０．５　收稿日期：２００７—０８—０２　基金项目：海南大学自然科学基金资助　作者简介：刘富平（１９７４一），男，山西晋中人，海南大学海洋学院讲师，硕士　维普资讯 http://www.cqvip.com

ｌ５Ｏ　海南大学学报自然科学版　２００８焦　：０．５的比例混合后，接种到灭菌土壤中（１　ｇ／盆），搅拌均匀，然后进行以一Ｆ　８种处理：１）绿粘帚霉厚垣孢　子２　ｇ；２）绿粘帚霉厚垣孢子４　ｇ；３）绿粘帚霉厚垣孢子６　ｇ；４）种子细菌化；５）绿粘帚霉厚垣孢子２　ｇ＋种　子细菌化；６）绿粘帚霉厚垣孢子４　ｇ＋种子细菌化；７）绿粘帚霉厚垣孢子６　ｇ＋种子细菌化；８）对照（只接　种病原菌），以上处理重复４次．用常规方法对马尾松种子进行消毒后，每盆播种５Ｏ粒，常规管理，并逐日　统计出苗数、死亡数，直到对照停止发病为止；同时测量各处理健苗的苗高，并用下述方法计算发病率和　防病效果．　出苗前的发病率＝　播种数一处理出苗数　播种数　×１００％　出苗后的发病率＝—　理些　氢　总的发病率＝　防病效果＝　Ｘ　１００％　播种数一处理保留苗数　播种数　对照发病率一处理发病率　对照发病率　×１００％　×１００％　１．４生物防治持效期试验上述盆栽试验结束后，除去苗木，将盆钵保温保湿存放半年后，按上述方法　再次播种，管理和观察方法同上．　２结果和分析　２．１　室内灭菌土盆钵试验试验表明：用坚强芽孢杆菌Ｂ一３０５发酵液浸泡马尾松种子和在灭菌土中施　人不同量的绿粘帚霉的厚垣孢子粉剂后，对马尾松幼苗在出苗前和出苗后的发病率都有明显的影响（见　表１），７个不同处理在出苗前和出苗后的发病率均低于对照，在出苗前，处理７（厚垣孢子６　ｇ＋细菌化）　的发病率最低（３０％），即该处理出苗数最多（３５株），在出苗后，该处理的发病率也同样最低（１１．４％）．而　且远远低于出苗前的发病率，这说明出苗后绿粘帚霉和坚强芽孢杆菌更能有效地控制病害的发生．　防病效果曲线显示（见图１），出苗前、出苗后、总的防治效果这３条曲线的总趋势都是逐渐上升的．出　苗后的防病效果明显高于出苗前的防病效果和总的防病效果．防病效果随厚垣孢子量的增加而不断增　加，并且同时进行种子细菌化和施入厚垣孢子的处理的防病效果要高于单独处理，这说明种子细菌化和　在土壤中施入厚垣孢子都有一定的防病效果，而且这２种拮抗菌具有协同效果，联合处理的最高防病效　果达６１．２％．　促生效果表明（见图２），拮抗菌处理的健苗，其高度都高于对照，而且处理７（厚垣孢子６　ｇ＋细菌化）　的苗高是最高的，与对照相比，高生长提高了５７％，这说明２种生物拮抗菌剂都对马尾松有促进生长的作　用．因此，笔者认为，由于２种生物拮抗菌剂对马尾松具有促长作用，故在马尾松出苗后，其生长速度高于　对照，这有利于其自身的防病作用，从而使出苗后的发病率明显低于出苗前的发病率．　表１　两种拮抗茵对松苗立枯病的影响　注：出苗数为１６　ｄ后的出苗数；死苗数为２４　ｄ后的死苗数　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　刘富平等：复合拮抗菌对马尾松幼苗猝倒病的生物控制　１５１　１ＯＯ　８Ｏ　６　５　眯６Ｏ　４ｏ　２Ｏ　Ｏ　ｌ　２　３　４　５　６　７　暑４　寇３　姐２　１　Ｏ　１　２　３　４　５　６　７　８　各处理　图１　不同处理的防病效果　各处理　图２不同处理的健苗高度　注：１一对照；２一细菌化；３一厚垣孢子２　ｇ；４一厚垣　孢子４　ｇ；５一厚垣孢子６　ｇ；６一厚垣孢子２　ｇ＋　注：１一细菌化；２一厚垣孢子２　ｇ；３一厚垣孢　子４　ｇ；４一厚垣孢子６　ｇ；５一厚垣孢子　２　ｇ＋细菌化；６－－￣４　ｇ＋细菌化；　细菌化；７一厚垣孢子４　ｇ＋细菌化；８一厚垣孢子　６　ｇ＋细菌化　７一厚垣孢子６　ｇ＋细菌化　２．２生物防治持效期盆栽试验结束后，除去苗木，将盆钵保温保湿存放半年后，按同样方法继续播种，　观察２种生物制剂的防病效果，试验结果表明（见表２）：随着厚垣孢子量的增加，马尾松幼苗的发病率有　所降低；种子细菌化和在土壤中施人厚垣孢子，这２种处理具有协同效应；处理７（厚垣孢子６　ｇ＋细菌化）　的发病率依然最低（４０％）．　表２半年后各处理的生物防治持效期的防治效果　注：１一细菌化；２一厚垣孢子２　ｇ；３一厚垣孢子４　ｇ；４一厚垣孢子６　ｇ；５一厚垣孢子２　ｇ＋细菌化；６一厚垣孢　子４　ｇ＋细菌化；７一厚垣孢子６　ｇ＋细菌化　由图３可以看出，半年后各处理的防病效果都有所降低，但防病效果逐渐上升的趋势没变，而且处理　７（厚垣孢子６ｇ＋细菌化）仍然有较高的防病效果（５５．６％）．所以笔者认为，坚强芽孢杆菌Ｂ一３０５和绿粘　帚霉ＧＶＤ这２种生防菌在土壤中不仅具有协同效应，而且在土壤中可以长期处于优势菌群的地位，从而　是具有一定潜力和发展前景的・　３讨７０　Ｍｏｏｄｙ　Ｃ　…Ｐｈｏｍｏｐ　ｉｓ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｉｄｅ　６ｏ　＿三三　————　年代后期，　’　在研究对　ｓ　ｓ的自　ｏ鋈罨　一Ｌ一广　－　■　—　—　—　　；　土培养物加入土壤，以防治黄瓜黑根腐．此后，关于这方面的文　图３半年后各处理的防病效果　献就丰富起来，已经报道的有：用Ｇ２　。ｃｆⅡ　“ｍ防治棉花、萝卜、　注：　三　黄瓜、西红柿、茄子、菜豆、甜菜、豌豆、欧洲樱桃、马铃薯、柑桔、　丝石竹、百日菊、玉米、杉木幼苗等多种植物根病，且都取得了优　于或近似杀菌剂处理的效果．　ｇ＋细齑化；６一厚垣孢子　ｇ＋细菌化；７一　厚垣孢子６　ｇ＋细菌化　菌的联合防治起到了增效、协同的作用；同时，本研究还发现，这２种抗生菌对马尾松幼苗有促生作用，有　关真菌代谢产物对植物生长的促进作用的研究还有报道　一　，如植物病原物禾谷镰孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）的代谢产物ＤＯＮ毒素可促进小麦胚芽鞘的伸长生长　６　Ｊ，提高苯丙氨酸解氨酶的活性　；又　如虫生真菌玫烟色拟青霉（Ｐ．ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ）的代谢产物制剂能促进茶叶增产　等；再如王春兰等　获得　维普资讯 http://www.cqvip.com １５２　海南大学学报自然科学版　２００８焦　了对珍稀药用植物金线莲（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ　ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ）生长有显著促进作用的粉红粘帚霉（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）真菌，并利用分离、纯化手段及现代光谱技术对该菌的化学成分进行了研究．本实验中的绿粘帚　霉真菌对马尾松幼苗高生长的促生效应，可能与其所产生的类似生长素的物质有关，有关这方面的研究　尚需进一步的探索．关于细菌的促生作用可追溯到２０世纪３０年代，许多学者发现，在植物根圈范围中，　生存着许多对植物有益的细菌，它们在生长代谢过程中能产生许多促进植物生长的物质，并可诱发植物　产生抗病性．本研究认为：通过种子细菌化将Ｂ一３０５抗生菌定殖在松苗的根附近，能改变其根圈的微环　境平衡和促进松苗的生长，这可能是由于Ｂ一３０５菌在生长过程中能产生促进植物生长的物质，从而增强　了植物对土壤中元素的吸收，提高了植物的防病能力的缘故．　参考文献：　［１］方仲达．植病研究方法［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８７：８７．　［２］ＴＳＡＯ　Ｐ　Ｈ．Ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ—ｆｒｅｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｕｈｕｒｅｓ　ｏｆＰｈｙｔｏｐｈｅｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９７１，　６１：１４１２—１４１３．　［３］ＭＯＯＤＹ　Ａ　Ｒ。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｂｌａｃｋ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｂｙ　Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ１．，１９８０，６７：１１５９—１１６２．　［４］罗科，张青文，郑应化．一株拟青霉代谢产物的杀虫效果及生理活性研究［Ｊ］．生物防治通报，１９９２，８（１）：２２—２５．　［５］ＢＡＫＡＬＩＶＡＮＯＶ　Ｄ．Ｉｎｄｏｌｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｐｏｃｈｖ．Ａｇｒｏｋｈｉｍ，１９８８，３：８１—８６．　［６］姚泉洪，刘宗镇．ＤＯＮ对小麦胚芽鞘伸长生长的作用［Ｊ］．上海农业学报．１９９１，７（增刊）：７９—８０．　［７］方祺霞．８０８制剂在茶叶上应用试验［Ｇ］／／中国真菌学会虫生真菌专业组．中国虫生真菌研究与应用．第１卷．北　京：学术期刊出版社，１９８８：３５—３９．　［８］吴志凤，陈利锋，章元寿，等．小麦赤霉病菌细胞壁提取物（ＨＣＷ）的生物活性［Ｊ］．菌物系统，１９９９，１８（４）：４００—４０４．　［９］王春兰，张集慧，郭顺星，等．粉红粘帚霉化学成分的研究［Ｊ］．微生物学通报，２００１，２８（４）：２４—２７．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｍａｓｓｏｎｉａｎａ　Ｓｅｅｄｌｉｎｇ　Ｄａｍｐｉｎｇ－ｏｆｆ　ｗｉｔｈ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ＬＩＵ　Ｆｕ．ｐｉｎｇ　，ＺＨＵ　Ｔｉａｎ．ｈｕｉ　（１．Ｏｃｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ　５７０２２８　Ｃｈｉｎａ；　２．Ｆｏｒｅｓｔ　ａｎｄ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａａｎ　６２５０１４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｈｓ　ｏｆ　ｐｏｔｔｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄｓ　ｗｉｔｈ　Ｂ一３０５　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｗｅｉｇｈｔ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｓｏｉｌ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｍａｓｓｏｎｉａｎａ　ｄａｍｐｉｎｇ—ｏｆｆ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｅ　ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ　ｐｏｗｄｅｒｓ，ｔｈｅ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｒｅａｃｈｅｄ　６１．２％．Ｅａｃｈ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｍａｙ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　５７％．Ｔｈｅ　ｂｉｏ—ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｗａｓ　ｓｔｉｌｌ　ｇｒｅａｔｅｓｔ．ｂｕｔ　ｄｅｃｌｉｎｅｄ　ａｂｏｕｔ　５．６％ｔｈａｎ　ｈａｌｆ　ａ　ｙｅａｒ　ａｇｏ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｖｉｒｅｎｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｒｆｍｕｓ；ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ；ｄａｍｐｉｎｇ—ｏｆｆ；Ｐｉｎｕｓ　ｍａｓｓｏｎｉ—