包涵体纯化方案

缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液

缓冲液A：50mM Tris—HCl （pH8。5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton

X-100

缓冲液B：50mM Tris—HCl (pH8.5）, 1mM EDTA， 100mM NaCl，1%Triton

X-100，2M脲素

缓冲液C：50mM Tris-HCl （pH8。5）, 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X—100 缓冲液D：50mM Tris-HCl （pH8。5）， 1mM EDTA， 100mM NaCl，1%Triton

X-100,2M盐酸胍

溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl （pH8.5）, 1mM EDTA， 100mM NaCl，10mM β-巯基乙醇/DTT,2mM脱氧胆酸钠，8M脲素

复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨

酸，5％甘油，0。2％PEG,1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽

2.纯化缓冲液

Binding buffer：50mM Tris-HCl， 100mM NaCl， 10mM 咪唑，pH8。5 Elution buffer：50mM Tris-HCl， 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑， pH8.5

具体实施步骤：

1。大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀. 2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后,超声破碎。13000rpm离心10min,弃上清，收集包涵体沉淀。

2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min收集沉淀. 3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min,然后13000rpm离心10min。取上清。

4.将上清稀释至0。1—1。0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中,4℃缓慢透析24-36h.最后在纯化binding buffer中透析,确保蛋白稳定可溶。 5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。

附注：

⑩

⑦

⑧

⑨

⑤

⑥

④④

③

①

②

①EDTA防止蛋白降解

②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力

③Triton X—100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质 ④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白 ⑤β—巯基乙醇/DTT作为还原剂打开错配的二硫键 ⑥脱氧胆酸钠作为离子型去垢剂能促溶蛋白 ⑦⑧甘氨酸、甘油促溶

⑨PEG可逆修饰折叠中间体的疏水基团

⑩氧化型和还原型谷胱甘肽促进二硫键的形成. （11）1g菌使用35ml液体重悬即可.