HPLC—ESI—MS／MS同时测定松萝中3种酚酸类成分的含量

HPLC—ESI—MS／MS同时测定松萝中3种酚酸类成分的含量

建立高效液相色谱串联质谱法（HPLC-ESI-MS/MS）同时测定松萝中松萝酸、地弗地衣酸、拉马酸3种主要有效成分的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm ），流动相为甲醇（0.05%甲酸）-水（0.05%甲酸-4 mmol乙酸铵），等度洗脱，流速0.8 mL·min-1。采用正负离子切换模式，多反应监测（MRM）进行定量测定，在负离子条件下测定松萝酸和地弗地衣酸，在正离子条件下测定拉马酸。结果上述3种主要成分在进样量范围内呈良好线性（r>0.997 9）；平均回收率为95.0%～105.1%，RSD为 1.1%～5.2%。该方法简便、快速、准确、重复性好，为综合评价松萝的质量提供参考。

标签： 松萝；液相色谱-串联质谱；松萝酸；地弗地衣酸；拉马酸；定量

[Abstract] A quick HPLC-ESI-MS/MS method was established for simultaneous determination of three chemical compositions in Usnea， including usnic acid， diffractaic acid， and ramalic acid. The separation was performed on a chromatographic column of Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm ）， and the mobile phase was methanol （0.05% formic acid）-0.05% formic acid solution （4 mmol ammonium acetate）， with an isocratic elution at a flow rate of 0.8 ml·min-1. Multiple reaction monitoring scanning mode （MRM） was performed combined with the ion switching technology in positive and negative ion switching mode to apply for the quantitative determination. The calibration curves for the above three compounds were linear in corresponding injection amount. Their average recoveries were 95.0%-105.1%， with RSDs of 1.1%-5.2%. The method was simple， rapid， accurate with high repeatability， which could provide a reference for overcalling evaluation the quality of Usnea.

[Key words] Usnea； LC-MS/MS； usnic acid； diffractaic acid； ramalic acid； quantitation

doi：10.4268/cjcmm20152427

松萝为松萝科植物长松萝Usnea longissim Ach.或节松萝U. diffracta Vain.的干燥地衣体。其异名有女萝、松落、龙须草、金钱草、关公须、天蓬草、树挂、松毛、海风藤、金丝藤、云雾草、老君须、过山龙，生于深山的老树枝干或高山岩石上，成悬垂条丝状。松萝性味苦、甘、平[1-2]。具有祛风活络、清热解毒、止咳化痰的功效[3]。现代药理研究表明松萝具有抗菌、镇痛及解热、杀虫、抗肿瘤、抗过敏、抗病毒、促进伤口愈合[4-9]等作用。松萝中含有酚酸、甾体、三萜及多糖等多种化学成分，其中酚酸为其主要有效成分，例如松萝酸（usnic acid）、地弗地衣酸（diffractaic acid）、拉马酸（ramalic acid）等，上述酚酸类成分有抗癌[10]、抗菌[11]、解热镇痛[12]等药理作用。但是，目前对于松萝中有效成分的定量测定仅限于松萝酸[13-15]。2010年版《中国药典》中首次用液相色谱-质谱联用技术控制中药质量，极大提高了分析的准确度、灵敏度和专属性[16]。另外，

采用HPLC-ESI-MS/MS对其3种主要成分同时进行定量分析尚未见报道，因此，本研究首次采用HPLC-ESI-MS/MS同时对松萝酸、地弗地衣酸、拉马酸3种主要成分进行定量分析，为松萝的质量控制提供新的科学依据。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）；3200-Q-TRAP三重四级杆质谱（美国 AB 公司）；BT125D型1/10 万分析天平（德国 Sartorius 公司）；KQ-5200E 台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；铁研船；D-3024 R离心机（美国 SCILOGEX 公司）；甲醇为色谱纯（美国 TEDIA 公司）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

对照品松萝酸购自鼎瑞化工（上海）有限公司，地弗地衣酸购自上海源叶生物科技有限公司，拉马酸购自上海博湖生物科技有限公司，纯度均>98%。3种化合物的结构见图1。

9批松萝样品分别购自四川（四川-1，四川-2，四川-3）、云南（云南-1，云南-2，云南-3）、浙江（浙江-1，浙江-2，浙江-3）3个不同产地，经河北医科大学生药教研室李连怀教授鉴定，均为松萝科松萝属植物长松萝。标本存放于河北医科大学药学院。药材粉碎后过60目筛，备用。2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm ），流动相甲醇（0.05%甲酸）（A）-水（0.05%甲酸-4 mmol乙酸铵）（B），等度洗脱（0～15 min， 95% A），流速0.8 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量10 μL。质谱条件：电喷雾正负离子切换模式，离子喷雾电压分别为5 500 V和-4 500 V，离子源温度650 ℃，气体（1）60 V，气体265 V，气帘气20 V，碰撞气体为氮气。采用MRM定量模式，3种待测物的质谱分析条件参数见表1。

在上述色谱质谱条件下进行分析，拉马酸、地弗地衣酸和松萝酸的保留时间分别为2.89，5.45，7.41 min，总离子流图见图2，二级质谱图见图3。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取松萝药材粉末（过60目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液稀释1 000倍，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别取松萝酸、地弗地衣酸、拉马酸对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配置成质量浓度分别为0.400，0.392，0.404 g·L-1的对照品储备液。精密吸取上述储备液适量，置10

mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，即松萝酸、地弗地衣酸、拉马酸相应稀释50倍，5 000倍，5倍，得相应质量浓度分别为8.000，0.078，80.800 mg·L-1的单一对照品溶液，取相同体积，混合，即得混合对照品溶液。

2.3 线性关系考察

取2.2.2项下方法制备的混合对照品溶液，用甲醇按倍率稀释法配制成一系列浓度的混合对照品溶液，在2.1项下测定峰面积，以进样质量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，见表2。

2.4 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（四川-1）10 μL，在2.1项下的色谱条件连续进样6次，及连续3 d进行测定，松萝酸，地弗地衣酸和拉马酸日内精密度RSD分别为1.6%，0.90%，1.4%，日间精密度RSD分别为3.2%，4.1%，2.6%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液（四川-1），于室温下分别于0，2，6，10，12，24 h 按2.1项下的色谱条件，分别进样测定，记录松萝酸，地弗地衣酸，拉马酸的峰面积，其RSD分别为2.8%，3.6%，4.0%，表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

2.6 重复性试验

取同一批松萝样品（四川-1）6份，每份约0.1 g，精密称定，按2.2.1项下制备供试品溶液，按2.1项下测定松萝酸，地弗地衣酸，拉马酸的峰面积的 RSD分别为4.4%，4.0%，3.6%，表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量松萝样品（四川-1）约0.05 g，共6份，精密称定，分别精密加入近似等量的3种对照品溶液，按2.2.1项下制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，见表3。

2.8 样品含量测定

取9个不同批次的松萝样品粉末0.1 g，精密称定，按2.2.1项下制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定并记录峰面积，将待测化合物的峰面积代入各自的标准曲线，分别计算松萝酸，地弗地衣酸，拉马酸的含量，每批样品测定3份，见表4。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

选择依据3种待测化合物的峰面积为指标，采用正交实验设计[L9（33）]筛选最佳提取条件，考察因素如下：提取时间（因素A）、提取溶剂溶度（因素B）和样品用量（因素C），因素A分别考察20，30， 40 min 3个；因素B设置为80%，95%，100% 3个甲醇溶度；因素C设置为0.1，0.075，0.05 g 3个样品用量。本研究中忽略各因素的交互作用，分析结果及结论见表5，6，可得出最终提取条件为0.004 g·mL-1比例，100% 甲醇超声30 min 。方差分析结果显示样品用量有统计意义，对提取条件有影响（P＜0.05）；提取时间和甲醇浓度无统计意义。但是根据待测物的性质，其极性较小，甲醇浓度和提取时间能够影响酚酸类的提取效率，因此，进一步考察了甲醇浓度和提取时间的影响，料液比按正交设计的最优条件，结果表明甲醇，低温超声30 min效果最好。

3.2 流动相的选择

由于待测分析物均属于酚酸类成分，首先以甲醇-水不同比例，等度洗脱和梯度洗脱进行考察，结果显示对照品峰形有严重拖尾，所以考虑在流动相中加入甲酸来调节流动相pH，以期改善峰形，同时，因其电喷雾离子源（ESI）对待测分析物离子化效果不佳，所以考察了在流动相加入不同浓度的乙酸铵，来增强离子化效果，经过多次试验结果比较，最终流动相为甲醇（含0.05%甲酸）-水（含0.05%甲酸，4 mmol·L-1 乙酸铵）（95∶5）时，3种待测物达到了很好的分离，且峰形较好。

3.3 质谱条件优化

为使检测的松萝酸，地弗地衣酸，拉马酸化合物有较高的灵敏度，首先，对3种分析物的对照品进行质谱参数优化，包括电离模式、电喷雾离子源电压、电喷雾离子源温度、去簇电压、碰撞电压等。且在实验过程中发现化合物松萝酸，地弗地衣酸在负离子模式有较好的响应，而拉马酸在正离子模式下响应值较好，为节省分析时间，故采用正负离子切换模式对3种化合物进行同时测定，设定了2个分析周期，即Period 1（0～3.5 min）正离子模式下检测拉马酸，Period 2（3.5～15 min）负离子模式下检测地弗地衣酸和松萝酸。3.4 松萝酸、地弗地衣酸和拉马酸二级裂解途径

松萝酸为二苯骈呋喃类化合物，其母离子[M-H]-峰为343.1，二级碎片离子有m/z 328.1，313.0，299.1，259.1，231.1，根据结构和二级碎片离子，推断二级质谱图上m/z 328.1峰为[M-H-CH3]-，m/z 313.0峰为[M-H-2CH3]-，m/z 299.1峰为[M-H-2CH3-CH2]-，m/z 259.059 6峰为[M-H-3CO]-，m/z 231.064 8峰为m/z 259.059 6峰丢失CO所得。

地弗地衣酸和拉马酸均属于缩酚酸类及其衍生物，以地弗地衣酸为例，其母离子[M-H]峰为373.1，二级碎片离子有m/z 329.140 1，297.113 0，282.1，209.1，165.0，135.0，根据结构和二级碎片离子，推断二级质谱图上m/z 329.140 1峰为[M-H-CO2]-，m/z 297.113 0峰为[M-H-2CH3-H2O2-CO]-，m/z 282.1峰为

[M-H-3CH3-CH2-2O]-，m/z 209.081 4和m/z 165.091 9推断由地弗地衣酸断裂苯酚键而得。由此，此类化合物大部分遵循此质谱裂解规律：一方面，在负电离模式下母核连续丢失CH3，CO，CO2或组合丢失。另一方面，化合物苯环之间的苯酚键断裂为A，B 2部分，再由A或B部分连续丢失CH3，CO，CO2或组合丢失得二级碎片离子。同时，拉马酸属于同一类化合物，由质谱得到的母离子和二级碎片离子，结合裂解规律，拉马酸也得到了验证。

3.5 样品测定结果分析

不同批次松萝药材的含量测定结果显示，不同产地松萝中松萝酸，地弗地衣酸，拉马酸的含量均波动较大，这表明松萝质量受地域因素影响较大。同时，松萝药材批次样品数量少，且均为长松萝，不能涵盖所有松萝样品，后续研究可进一步收集全国不同产地不同种类的松萝样品进行比较。同时本次实验采用的为高效液相色谱串联质谱法，该法不仅有分离化合物的功能，还具有强大的鉴定功能，能够准确、快速的测定松萝中相似酚酸类成分的含量，避免了其他分析方法同时测定其他相似化合物的假阳性情况的发生。

4 结论及展望

本实验首次采用高效液相色谱-质谱联用方法（HPLC-ESI-MS/MS）对松萝中3种主要酚酸类有效成分进行了定量分析，该方法简便、快速、准确、灵敏度高。本实验通过对质谱条件和色谱条件的优化，各待测物达到了良好的分离，并采用正交试验法对提取条件进行了优化。另外，松萝还含有其他酚酸类有效成分，有必要在定量测定的基础上，进一步对其进行定性鉴别研究，从而为综合评价松萝的质量提供理论参考和技术支持。

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