载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连
d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子
转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将重组克隆鉴定出来。
第一节 细菌的转化方法
自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法： a. 热激法转化感受态细胞 b. PEG介导的原生质体转化 c. 高压电穿孔法转化 d. 显微注射法转化 e. 接合转化 f. 噬菌体转染
表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较
转 化 方 法 Ca 诱 导 原生质体转化 噬菌体转化 电 穿 孔 法 结 合 转 化 转 化 效 率 107-8 105-6 107-8 106-9（<100Kb） 104-5
图4-1 热激法转化感受态的过程
一、受体细胞应具备的条件
a. 限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）
b. 重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体） c. 具有较高的转化效率
d. 具有与重组体互补的遗传性状 e. 感染与寄生缺陷型 安全角度的要求。 二、大肠杆菌感受态的制备与转化
转化的突破发生在1970s的早期，研究发现，在冷的盐溶液中转化的效率提高。一般利用50mM的CaCl2，其他的盐如氯化铷也有较高的效率。经过处理的细胞称为感受态细胞。 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
目前，机理尚不清楚，可能是CaCl2导致DNA分子沉淀到细菌细胞的外壁上，或者CaCl2与提高细菌结合的变化有关。在某些情况下，CaCl2只影响DNA的结合，并不影响细胞的吸收，当DNA分子加到处理的细胞内，仍然吸附在细胞的外部，并没有转化到细胞质中，将DNA带入感受态细胞的条件可提高温度到42°C，同样热激处理可以提高效率的机理也不很清楚。
图 4-2 热激法转化感受态细菌 的原理
三、 筛选转化细胞
感受态细胞的转化不是一个高效的过程，虽然1ng的pUC8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的DNA分子。所以必需筛选转化细胞。 （一）利用抗生素的插入失活筛选转化子
图4-3 插入失活的原理
pBR322有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子插入新的DNA片段。如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。
图4-4 pBR322与重组的pBR322 图 4-5 利用tet的插入失活筛选重组克隆
R
（二）lacZ’基因的插入失活
载体：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和头146个aa的编码序列 宿主：缺失了lacZ’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列
α-互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。
在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了amp抗性，自连质粒可以合成正常的酶，而重组质粒的细菌不能合成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物IPTG，乳糖的类似物X-gal乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。这一系统称为lac selection。
图4-6 pUC8的结构
图4-9 利用lacZ'基因的插入失活筛选重组子
第二节 phage DNA的转化
两种方法可以将噬菌体DNA转入细菌：
1） 转染（transfection）：是将纯化的噬菌体DNA通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。
2） 体外装配（in vitro packaging）：λ DNA的转染效率不高，如果将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。
图4-21 噬菌体转化大肠杆菌的方法 一、λ噬菌体的体外装配
有两种不同的系统可以应用：
一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。
另一种系统需要两种不同的缺陷品系一个是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变体，由于蛋白质合成的缺陷。体外的装配过程可以利用两种不同培养物的混合物，含有完整的外壳蛋白，完成装配过程。将装配的噬菌体接入细菌就可以完成正常的侵染过程。
图4-22 λ噬菌体体外装配的两种系统 二、噬菌斑
λ和M13噬菌体都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于细胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是浑浊的，因为细胞并未裂解，它引起的是细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。 三、重组噬菌体的鉴定 （一）利用插入失活鉴定
M13噬菌体，多种λ噬菌体载体都含有lacZ’基因，可以通过插入失活鉴定重组噬菌体。 （二）λ噬菌体的cI基因的插入失活
λ噬菌体载体在cI基因位点上含有单一的酶切位点，该位点上插入外源基因可以导致该基因的失活，引起表现型的变化。正常的噬菌斑是浑浊的，但重组的噬菌斑是清亮的。 （三）利用Spi(sensitive to P2 inhibition)表型选择
一般来讲，λ噬菌体不能侵染已被P2噬菌体侵染的大肠杆菌细胞，因此λ噬菌体被称为Spi+（对P2前噬菌体抑制敏感），插入新的DNA后，能变成spi-，可以侵染含有P2噬菌体的细菌，只有重组子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的选择出来。 （四）根据λ基因组的大小筛选
λ装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可以进入头部结构，小于37kb的不能装配。许多构建的λ载体切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被装配到头部结构中，使载体的长度等于或大于37kb。对于这样的λ噬菌体载体，只有重组的噬菌体才能进行正常的复制。
图4-23 利用lacZ'基因的插入失活筛选重组噬菌斑
第三节 转化子的鉴定
通过插入失活可以初步筛选重组子，但筛选到的克隆是否插入了正确的片段，还需要进一
步的鉴定，鉴定的方法主要有如下几种情况：
1 限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。
2 PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定 3 菌落原位杂交法：将在后面的章节中提到。
4 基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。
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