用于体外扩增造血干细胞的培养体系[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108265028 A(43)申请公布日 2018.07.10

(21)申请号 201611252692.4(22)申请日 2016.12.30

(71)申请人 联亘生物科技(上海)有限公司

地址 201210 上海市浦东新区张江海科路

99号6号楼(72)发明人 张洁　曹明喆　沈思宇　

(74)专利代理机构 北京金思港知识产权代理有

限公司 11349

代理人 邵毓琴　李晶(51)Int.Cl.

C12N 5/07(2010.01)

权利要求书3页 说明书10页 附图8页

()发明名称

用于体外扩增造血干细胞的培养体系(57)摘要

本发明提供用于造血干细胞扩增的培养体系，其包含基础培养基和促进造血干细胞扩增的组合物，所述组合物包含与造血有关的早期造血生长因子。本发明还提供采用该培养体系体外扩增造血干细胞的方法以及包含上述促进造血干细胞扩增的组合物的试剂盒。采用本发明的上述培养体系对造血干细胞进行体外扩增，可实现造血干细胞的扩增倍数达到数百倍以上，从而可有效解决血液系统疾病的治疗过程中造血干细胞数量不足的问题。

CN 108265028 ACN 108265028 A

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1.用于造血干细胞扩增的培养体系，其包含基础培养基和促进造血干细胞扩增的组合物，所述组合物包含与造血有关的早期造血生长因子。

2.如权利要求1所述的培养体系，其中，所述与造血有关的早期造血生长因子选自：干细胞生长因子，Fms样酪氨酸激酶受体3的配体和血小板生成素。

3.如权利要求2所述的培养体系，其中，

所述干细胞生长因子的浓度为10-100ng/ml，

所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体的浓度为10-100ng/ml，和/或所述血小板生成素的浓度为10-100ng/ml。4.如权利要求3所述的培养体系，其中，所述干细胞生长因子的浓度为10-50ng/ml，

所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体的浓度为10-50ng/ml，和/或所述血小板生成素的浓度为10-50ng/ml。

5.如权利要求1至4中任一项所述的培养体系，其中，所述促进造血干细胞扩增的组合物还包含芳烃受体拮抗剂，和/或人造血干细胞自身更新的激动剂，和/或GSK-3抑制剂。

6.如权利要求5所述的培养体系，其中，所述芳烃受体拮抗剂选自：Stem Regenin 1；所述人造血干细胞自身更新的激动剂选自：UM171；和/或所述GSK抑制剂选自：CHIR-99021。7.如权利要求6所述的培养体系，其中，Stem Regenin 1的浓度为0.5-1μM，UM171的浓度为20-100nM，和/或CHIR-99021的浓度为100-500nM。8.如权利要求7所述的培养体系，其中，Stem Regenin 1的浓度为：0.75-1μM，UM171的浓度为：50-100nM，和/或CHIR-99021的浓度为：250-500nM。

9.如权利要求1至8中任一项所述的培养体系，所述促进造血干细胞扩增的组合物还包含IL-3，和/或IL-6，和/或粒细胞集落刺激因子，和/或多效生长因子，和/或组蛋白乙酰化酶抑制剂，和/或地西他宾。

10.如权利要求9所述的培养体系，其中，IL-3的浓度为：2ng/ml；IL-6的浓度为：10ng/ml；

所述粒细胞集落刺激因子的浓度为：1ng/ml；所述多效生长因子的浓度为：100ng/ml；所述组蛋白乙酰化酶抑制剂的浓度为：50μM；和/或所述地西他宾的浓度为：60nM。

11.如权利要求1至10中任一项所述的培养体系，其中，所述基础培养基是StemSpan无血清扩增培养基，并且所述基础培养基补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素。

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12.如权利要求1至12中任一项所述的培养体系，其中，所述培养体系包含：补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，

由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，浓度为50nM的UM171，

浓度为250nM的CHIR-99021，

浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，

浓度为11ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，浓度为35ng/ml的血小板生成素，和浓度为10ng/ml的IL-6。

13.如权利要求1至12中任一项所述的培养体系，其中，所述培养体系包含：补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，

由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，浓度为50nM的UM171，

浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，

浓度为11ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，浓度为35ng/ml的血小板生成素，和浓度为10ng/ml的IL-6。

14.如权利要求1至12中任一项所述的培养体系，其中，所述培养体系包含：补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，

由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，浓度为50nM的UM171，

浓度为250nM的CHIR-99021，

浓度为50ng/ml的干细胞生长因子，

浓度为50ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，和浓度为50ng/ml的血小板生成素。

15.如权利要求1至12中任一项所述的培养体系，其中，所述培养体系包含：补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，

由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，浓度为50nM的UM171，

浓度为250nM的CHIR-99021，

浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，和

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浓度为20ng/ml的血小板生成素。

16.用于体外扩增造血干细胞的方法，所述方法包括：

在权利要求1至15中任一项所述的培养体系中培养分离的单核细胞持续一定时间段。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述单核细胞分离自脐带血。18.如权利要求17所述的方法，其中，所述培养在37℃、5％CO2和5％O2条件下持续14天。19.用于体外扩增造血干细胞的试剂盒，其包含权利要求1至15中任一项所述的促进造血干细胞扩增的组合物。

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用于体外扩增造血干细胞的培养体系

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技术领域[0001]本发明涉及干细胞培养领域，具体而言，本发明涉及用于体外扩增造血干细胞的培养体系以及采用该培养体系扩增造血干细胞的方法。

背景技术[0002]造血干细胞具有自我更新、高度繁殖以及向多个方向分化的能力，因此，其在治疗白血病、再生障碍性贫血等你血液系统疾病方面有着广泛的应用。目前，主要采用造血干细胞移植来治疗血液系统疾病，用于移植的造血干细胞主要有三种来源：骨髓、外周血和脐带血。骨髓和外周血是目前广泛应用的造血干细胞来源，但是存在配型困难等问题。而采用脐带血来源的造血干细胞进行移植可在一定程度上避免这些问题，但是脐带血来源的造血干细胞的数量有限，难以满足造血干细胞移植所需的数量，因此，体外扩增造血干细胞是解决治疗血液系统疾病中的造血干细胞数量不足的问题的关键途径。

发明内容[0003]一方面，本发明提供用于造血干细胞扩增的培养体系，其包含基础培养基和促进造血干细胞扩增的组合物，所述组合物包含与造血有关的早期造血生长因子，所述与造血有关的早期造血生长因子选自：干细胞生长因子，Fms样酪氨酸激酶受体3的配体和血小板生成素。[0004]在一些实施方式中，所述干细胞生长因子的浓度为10-100ng/ml，所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体的浓度为10-100ng/ml，和/或所述血小板生成素的浓度为10-100ng/ml。[0005]在另一些实施方式中，所述干细胞生长因子的浓度为10-50ng/ml，所述Fms样酪氨酸激酶受体3的配体的浓度为10-50ng/ml，和/或所述血小板生成素的浓度为10-50ng/ml。[0006]本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中所包含的促进造血干细胞扩增的组合物还包含芳烃受体拮抗剂，和/或人造血干细胞自身更新的激动剂，和/或GSK-3抑制剂。其中，所述芳烃受体拮抗剂选自：Stem Regenin 1；所述人造血干细胞自身更新的激动剂选自：UM171；和/或所述GSK抑制剂选自：CHIR-99021。[0007]在一些实施方式中，Stem Regenin 1的浓度为0.5-1μM，UM171的浓度为20-100nM，和/或CHIR-99021的浓度为100-500nM。[0008]在另一些实施方式中，Stem Regenin 1的浓度为：0.75-1μM，UM171的浓度为：50-100nM，和/或CHIR-99021的浓度为：250-500nM。[0009]本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中所包含的促进造血干细胞扩增的组合物进一步包含IL-3，和/或IL-6，和/或粒细胞集落刺激因子，和/或多效生长因子，和/或组蛋白乙酰化酶抑制剂，和/或地西他宾。[0010]在一些实施方式中，IL-3的浓度为：2ng/ml；IL-6的浓度为：10ng/ml；所述粒细胞集落刺激因子的浓度为：1ng/ml；所述多效生长因子的浓度为：100ng/ml；所述组蛋白乙酰

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化酶抑制剂的浓度为：50μM；和/或所述地西他宾的浓度为：60nM。[0011]本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中的基础培养基是StemSpan无血清扩增培养基，并且所述基础培养基补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素。[0012]在本发明的一种实施方式中，所述培养体系包含：[0013]补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，[0014]由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：[0015]浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，[0016]浓度为50nM的UM171，[0017]浓度为250nM的CHIR-99021，[0018]浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，[0019]浓度为11ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，[0020]浓度为35ng/ml的血小板生成素，和[0021]浓度为10ng/ml的IL-6。[0022]在本发明的另一实施方式中，所述培养体系包含：[0023]补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，[0024]由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：[0025]浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，[0026]浓度为50nM的UM171，[0027]浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，[0028]浓度为11ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，[0029]浓度为35ng/ml的血小板生成素，和[0030]浓度为10ng/ml的IL-6。[0031]在本发明的又一实施方式中，所述培养体系包含：[0032]补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，[0033]由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：[0034]浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，[0035]浓度为50nM的UM171，[0036]浓度为250nM的CHIR-99021，[0037]浓度为50ng/ml的干细胞生长因子，[0038]浓度为50ng/ml的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体，和[0039]浓度为50ng/ml的血小板生成素。[0040]在本发明的再一实施方式中，所述培养体系包含：[0041]补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基，以及，[0042]由如下成分构成的促进造血干细胞扩增的组合物：[0043]浓度为0.75μM的Stem Regenin 1，

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浓度为50nM的UM171，

[0045]浓度为250nM的CHIR-99021，[0046]浓度为10ng/ml的干细胞生长因子，和[0047]浓度为20ng/ml的血小板生成素。[0048]另一方面，本发明提供用于体外扩增造血干细胞的方法，所述方法包括：在本发明的上述培养体系中培养分离的单核细胞持续一定时间段；其中，所述单核细胞分离自脐带血；所述培养在37℃、5％CO2和5％O2条件下持续14天。[0049]再一方面，本发明提供用于体外扩增造血干细胞的试剂盒，其包含本发明的上述促进造血干细胞扩增的组合物。任选地，所述试剂盒还可包含体外培养造血干细胞所需的培养平板和/或关于使用该试剂盒体外培养造血干细胞的说明。附图说明[0050]图1是本发明的#1#培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0051]图2是本发明的#2培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0052]图3是本发明的#3培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0053]图4是本发明的#4培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[00]图5是本发明的#5培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0055]图6是本发明的#6培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0056]图7是本发明的#7培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0057]图8是本发明的#8培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0058]图9是本发明的#9培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0059]图10是本发明的#10培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0060]图11是本发明的#11培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0061]图12是本发明的#12培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0062]图13是本发明的#13培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[0063]图14是本发明的#14培养体系中得到的培养产物的流式分选图。[00]图15是对照培养体系中得到的培养产物的流式分选图。

具体实施方式[0065]培养体系[0066]总体上，本发明提供一种用于造血干细胞扩增的培养体系，其包含基础培养基和促进造血干细胞扩增的组合物，该组合物包含与造血有关的早期造血生长因子。[0067]本发明所述与造血有关的早期造血生长因子选自：干细胞生长因子(SCF)，血小板生成素(TPO)和/或Fms样酪氨酸激酶受体3的配体(Flt-3L)。[0068]本发明所述的干细胞生长因子(SCF)是一种具有刺激自体内源性干细胞生长的蛋白质和酶的组合，其作用于最早期造血干细胞/祖细胞，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，造血细胞的生长发育中起着重要作用，其具有刺激包括早期造血祖细胞在内的原始祖细胞生长的能力，能够刺激神经干细胞等非造血干细胞。[0069]在本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中，SCF的浓度为10-100ng/ml，优选

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为10-50ng/ml。[0070]本发明所述的血小板生成素(TPO)是包含834个氨基酸的糖基化的多肽链，其分子量为92,872道尔顿。血小板生成素代表人自体免疫甲状腺疾病中自体抗原性靶点中的一种。[0071]在本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中，TPO的浓度为10-100ng/ml，优选为10-50ng/ml。[0072]本发明所述的Fms样酪氨酸激酶受体3的配体(Flt3-L)是一种与造血有关的早期造血生长因子，可与多种细胞因子协同作用。Flt3的配体与Flt3结合后能够调节原始造血干细胞/祖细胞增殖和分化，动员和刺激髓系及淋巴祖细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤树突状细胞增殖和分化，是树突状细胞最为重要的生长因子。[0073]在本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中，Flt3-L的浓度为10-100ng/ml，优选为10-50ng/ml。[0074]本发明的促进造血干细胞扩增的组合物还包含芳烃受体拮抗剂，和/或人造血干细胞自身更新的激动剂和/或GSK抑制剂。[0075]所述芳烃受体(AhR)拮抗剂是一种AhR抑制剂，该AhR抑制剂在与AhR多肽结合或与编码AhR的多核苷酸特异性结合时，其本身不会激发生物响应，但是其会阻断或缓冲激动剂-介导的或配体-介导的响应，即AhR拮抗剂能够结合但并不激活AhR多肽或编码AhR的多核苷酸，并且这种结合会部分或全部阻断所述AhR多肽或编码AhR的多核苷酸的刺激作用，降低、阻止、延迟所述AhR多肽或多核苷酸的激活作用，失活、脱敏或下调所述AhR多肽或编码AhR的多核苷酸的活性，取代AhR激动剂，和/或抑制AhR激动剂的功能。[0076]在本发明的优选实施方式中，AhR拮抗剂是化合物Stem Regenin 1(SR1)，其具有如下结构式。

[0077]

在本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中，SR1的浓度为0.5-1μM，优选为

0.75-1μM。[0079]本发明所述的人造血干细胞自身更新的激动剂是能够抑制AhR受体通路的吡啶衍生物UM171，其具有如下结构式

[0078]

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[0080]

在本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中，UM171的浓度为20-100nM，优选为

50-100nM。[0082]本发明所述的GSK-3抑制剂是指糖原合成酶激酶-3的抑制剂。糖原合成酶激酶-3(GSK-3)普遍存在于哺乳动物真核细胞中，除去最早发现的糖原合成酶(GS)的活性外，GSK-3还能作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。GSK-3抑制剂可以活化Wnt/β-catenin通路。[0083]在本发明的优选实施方式中，GSK-3抑制剂是具有如下结构的CHIR-99021，其在本发明的用于造型干细胞扩增的培养体系中的浓度为100-500nM，优选为250-500nM。

[0081]

[0084]

本发明的促进造血干细胞扩增的组合物还包含IL-3，和/或IL-6，和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，和/或多效生长因子，和/或组蛋白乙酰化酶抑制剂(VPA)，和/或地西他宾。在本发明的用于造型干细胞扩增的培养体系中，IL-3的浓度为2ng/ml，IL-6的浓度为10ng/ml，G-CSF的浓度为1ng/ml，所述多效生长因子的浓度为：100ng/ml；所述组蛋白乙酰化酶抑制剂的浓度为：50μM；和/或所述地西他宾的浓度为：60nM。[0086]本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系中的基础培养基是指完全不含动物来源组分(例如，血清)的适于人或动物细胞体外生长的培养基。所述培养基可选自：StemSpan-ACF，StemSpan-H3000，StemSpan-无血清扩增培养基，Iscove氏改良的Dulbecco培养基(IMDM)，Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)和RPMI-10培养基。在本发明的一些实施方式中，本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系使用StemSpan无血清扩增培养基作为基础培养基并且在该培养基中补充有青霉素、链霉素和肝素。[0087]在本发明的一种示例性的实施方式中，本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系包括作为基础培养基的补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基，浓度为10ng/ml的SCF，浓度为35ng/ml的TPO，浓度为11ng/ml的Flt3-L，浓度为10ng/ml的IL-6，浓度为0.75μM的SR1，浓度为50nM的UM171和浓度为250nM的CHIR-99021。[0088]在本发明的另一示例性的实施方式中，本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系

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包括作为基础培养基的补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基，浓度为10ng/ml的SCF，浓度为35ng/ml的TPO，浓度为11ng/ml的Flt3-L，浓度为10ng/ml的IL-6，浓度为0.75μM的SR1和浓度为50nM的UM171。[00]在本发明的另一示例性的实施方式中，本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系包括作为基础培养基的补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基，浓度为50ng/ml的SCF，浓度为50ng/ml的TPO，浓度为50ng/ml的Flt3-L，浓度为0.75μM的SR1，浓度为50nM的UM171和浓度为250nM的CHIR-99021。[0090]在本发明的另一示例性的实施方式中，本发明的用于造血干细胞扩增的培养体系包括作为基础培养基的补充有50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10μg/ml肝素的StemSpan无血清扩增培养基，浓度为10ng/ml的SCF，浓度为20ng/ml的TPO，浓度为0.75μM的SR1，浓度为50nM的UM171和浓度为250nM的CHIR-99021。[0091]采用本发明的上述培养体系对造血干细胞进行体外扩增，可在14天的体外培养时间内实现造血干细胞的扩增倍数达到数百倍以上，从而可有效解决血液系统疾病的治疗过程中造血干细胞数量不足的问题。[0092]培养方法[0093]本发明还提供采用上述培养体系培养造血干细胞的方法，所述方法包括：将从人脐带血中分离的单核细胞接种于96孔板中，每个孔中装有一定量的本发明的上述培养体系。细胞在37℃、5％CO2和5％O2条件下培养14天。每天检查培养物，当细胞小粒在每个孔中聚集超过直径为2mm时，以1：1的比例将细胞小粒分至新的孔中。维持每个孔中细胞小粒聚集为直径1-2mm。每2-3天更换至少一半体积的培养基。培养14天后，收获总的培养产物并且洗涤细胞并在DMEM中重悬细胞。[0094]试剂盒[0095]本发明还提供一种试剂盒，其包含基础培养基(例如，StemSpan无血清扩增培养基)和促进造血干细胞扩增的组合物，其中，所述促进造血干细胞扩增的组合物包含：干细胞生长因子，Fms样酪氨酸激酶受体3的配体、血小板生成素、芳烃受体拮抗剂(例如，SR1)、GSK-3抑制剂(例如，CHIR-99021)、人造血干细胞自身更新的激动剂(UM171)、粒细胞集落刺激因子、IL-3、IL-6、多效生长因子、组蛋白乙酰化酶抑制剂(VPA)和地西他宾中的一种或多于一种。进一步地，所述试剂盒还包括从供体收集细胞样本或组织样本所需的工具、保存所述细胞样本或组织样本的培养瓶、体外培养造血干细胞所需的培养平板以及关于使用该试剂盒体外培养造血干细胞的说明，其中，所述说明可以是书面形式的(例如包装在试剂盒中的说明书)或计算机可读形式的(例如磁盘或光盘)。[0096]实施例[0097]实施例1.体外扩增造血干细胞[0098]1.1单核细胞的分离[0099]将人脐带血(由上海第一妇婴医院妇产科提供)收集在含有作为抗凝剂的柠檬酸钠/柠檬酸/葡萄糖的血袋中，血液在4℃下保存不超过48小时。取一试管向其中加入合适体积的脐带血，采用与脐带血等体积的补充有2％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释脐带血，再取一试管，向其中加入淋巴细胞分离剂，随后将稀释后的脐带血小心地铺在淋巴细胞分离剂(---购买来源)上，避免淋巴细胞分离剂与稀释后的脐带血混合，室温下，以

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800g的速度离心分离20分钟至30分钟，离心后除去上层的血浆层，而不干扰血浆与淋巴细胞分离剂的界面，取出血浆与淋巴细胞分离剂的界面上的单核细胞层，而不干扰红细胞/粒细胞小粒。采用抗人CD34PerCP-Cy5.5(1:400)、抗人CD38PE(1:200)，抗人CD49f PE-Cy7(1:400)以及DAPI(1:25000)对单核细胞进行染色。[0100]1.2造血干细胞的体外扩增[0101]将上述分离的单核细胞在如下培养体系中以如下方式培养：[0102]将1×105个单核细胞接种于U型底96孔板中，每个孔中含有200μl的本发明的造血干细胞扩增培养基(培养基中所含的各个成分及其含量在下表1中列出)。细胞在37℃、5％CO2和5％O2条件下培养14天。每天检查培养物，当细胞小粒在每个孔中聚集超过直径为2mm时，以1：1的比例将细胞小粒分至新的孔中。维持每个孔中细胞小粒聚集为直径1-2mm。每2-3天更换至少一半体积的培养基。培养14天后，收获总的培养产物并且洗涤细胞并在DMEM中重悬细胞。[0103]表1.

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注：对比体系为Norvatis公司使用的培养体系

1.3培养产物中造血干细胞的检测(1×105个单核细胞培养产物)采用抗人CD34PerCP-Cy5.5(1:400)，抗人CD38PE(1:200)，抗人CD49f PE-Cy7(1:

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400)以及DAPI(1:25000)对如上所获得的培养产物进行染色，并通过流式分选统计总单核细胞计数以及单核细胞中造血干细胞所占的比例(单核细胞中的造血干细胞显示为CD34+CD38-CD49f+，流式分选图请参见图1至图15)。通过流式分选得到的统计结果如下表2所列。[0109]表2

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[0111]

通过上述流式分选的统计结果可以看出，采用本发明的培养体系对造血干细胞进行体外扩增，可在14天的体外培养时间内实现造血干细胞的扩增倍数达到数百倍以上，从而可有效解决血液系统疾病的治疗过程中造血干细胞数量不足的问题。[0113]本发明的培养体系中的促进造血干细胞扩增的组合物中各个成分(例如，SCF，TPO，Flt3-L，SR1，UM171，CHIR-99021)的含量通过如下方式进行优化筛选：[0114]1.在不含小分子化合物的条件下，改变上述SCF、Flt3-L和TPO这三种生长因子的浓度，SCF、Flt3-L和TPO的浓度在0-100ng/ml范围内改变，并通过流式细胞仪检测不同生长因子浓度条件下CD34+CD38-CD49f+的表达，从而获得上述三种生长因子用于造血干细胞体外扩增的优化浓度。[0115]2.在1筛选得到的优化生长因子条件下进一步加入其它细胞因子(例如，IL-3、IL-6、粒细胞集落刺激因子)，并通过流式细胞仪检测不同生长因子浓度条件下CD34+CD38-13

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CD49f+的表达，从而获得生长因子组合用于造血干细胞体外扩增的优化浓度。[0116]3.在2筛选得到的优化生长因子条件下加入小分子化合物(例如，SR1、UM171、CHIR-99021)，并通过流式细胞仪检测不同生长因子浓度条件下CD34+CD38-CD49f+的表达，从而获得生长因子组合结合小分子化合物的用于造血干细胞体外扩增的最佳条件。

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