兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究刘杰 王建 周跃

【摘 要】  目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养，观察细胞的形态、表型及超微结构改变，研究其体外生物学特性。 方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织，在含有15%灭活FBS的DMEM/F12 培养液中培养，倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态。分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间，进行髓核细胞活力测定；爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察；MTT法绘制髓核细胞生长曲线，并行原代及第2代细胞透射电镜观察，对体外细胞的生物学特性进行研究。 结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形，折光性较强；5 d开始有细胞贴壁，细胞呈多角形或短梭形；6～8 d细胞生长进入指数生长期；约17 d时，细胞长满瓶壁，可进行传代；随传代次数增加，细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变。髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%，原代培养期间为98%～100%，第1代培养期间仍能维持为100%，第2代细胞活力下降较为明显，为75%～80%。髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性；HE染色见细胞核、细胞质着色明显。第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性，聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性；第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性，聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅。MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符。透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少，胞质内有大量糖原颗粒，随传代次数增加，糖原颗粒减少，线粒体数量增多，细胞器开始肿胀。 结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁，为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据。

【关键词】 组织工程  髓核细胞 体外培养 生物学特性  兔中图分类号： R681.5 R687.1  文献标志码：A

EXPERIMENTAL STUDY ON BIOLOGICAL FEATURE OF RABBIT INTERVERTEBRAL DISC NUCLEUS PULPOSUS IN VITRO/LIU Jie, WANG Jian, ZHOU Yue. Department of Orthopaedics, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing, 400037, P.R.China. Corresponding author: WANG Jian, E-mail: tonywjxq@yahoo.com.cn

【Abstract】  Objective To research the biological feature of intervertebral disc nucleus pulposus cells (NPCs) by observing cell morphous, phenotype and ultramicrostructure. Methods The NPCs from 2-week-old healthy rabbit were cultured in DMEM/F12 medium with 15% FBS. The cell biological features were observed by inverted phase contrast microscope, light microscope, electron microscope, cell vitality assay, cell growth curve and cells staining after harvest and during the periods of culturing the primary, the 1st passage and 2nd passage. Results The results of inverted phase contrast microscope showed that the primary passage adhered at 5 days, grew exponentially at 6-8 days, and were subcultured after covering the bottom at 17 days. The phenotype of the NPCs changed from polygon to long fusiform with passage increased; the vitality assay showed that there was about 95%-97%, 98%-100%, 100% and 75%-80% NPCs survived just after isolation from intervertebral disc, during the period of culturing the primary, the 1st passage and the 2nd passage, respectively. The toluidine blue staining of the NPCs was strongly positive, and HE staining showed clear cell nucleus and cytoplasm. The I collagen immunohistochemical staining showed negative results in the 1st passage, but II collagen immunohistochemical staining and safranin O staining showed positive results. However, the I collagen immunohistochemical staining showed positive result in the 2nd passage, and II collagen immunohistochemical staining and safranin O staining showed weakly positive results. The cell growth curve showed the same as the growth course of cell cultured in vitro. The results of TEM showed that there were many glycogen particles and less chondriosomes in the primary passage. With the increased passage, the glycogen particles decreased and the chondriosomes increased, and cell organ became swell. Conclusion This study clarifies the biological feature of NPCs in vitro, providing the experimental basis for the seed cell research of the nuclues pulposus tissue.

Tissue engineering Nucleus pulposus cells Culture in vitro Biological feature Rabbit 【Key words】

Foundation item: Natural Science Foundation of Chongqing (2007BB5056)

基金项目：重庆市自然科学基金资助项目（2007BB5056）400037）作者单位：第三军医大学新桥医院骨科（重庆，

E-mail: tonywjxq@yahoo.com.cn通讯作者：王建，副教授，硕士导师，研究方向：脊柱外科髓核组织工程，

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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, September 2008, Vol. 22, No.9椎间盘突出症是骨科常见病和多发病，多见于青壮年，是引起腰腿痛的常见病因。椎间盘退变的发生机制迄今仍不清楚，因此有必要对椎间盘细胞的生物学特性作深入研究[1]。目前椎间盘突出症治疗多采用椎间盘髓核摘除术，但术后常发生脊柱不稳、椎体滑脱及脊柱活动受限。虽有人工椎间盘成功应用的报道[2]，但因目前应用的非生物材料易发生破裂和脱出，尚不能推广。组织工程研究的发展和可降解生物材料的发现，使组织工程椎间盘髓核的研究具有了可能性[3]。目前国内对椎间盘髓核细胞的研究多停留在某一单独的性状，或是单纯细胞原代培养，而对其经进一步系统培养后原代及传代细胞体外生物学、细胞超微结构以及细胞表面标志物表达变化的研究罕见报道。我们对兔腰椎髓核细胞进行体外培养，光镜及电镜观察其一般形态与超微结构变化，并行细胞组织化学实验鉴定其表面标志物特征变化，探讨髓核细胞体外培养生物学特性改变，以期进一步了解髓核细胞体外生物学特征，优化培养模式，为组织工程椎间盘髓核的深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料、仪器

健康2周龄新西兰白兔4只，雌雄不限，体重0.5～1.0 kg，由第三军医大学新桥医院实验动物中心提供。小鼠抗兔Ⅰ型胶原蛋白单克隆抗体（ABR-Af-finity BioReagents公司，美国）；小鼠抗兔Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体（天津灏洋生物公司）；二抗免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物公司）；HE、甲苯胺蓝、番红O染液（第三军医大学试剂中心）。倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；BB5060UV型恒温CO2孵育箱Heraeus公司，德国）；电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂）；TECNAI10型透射电镜（Philips公司，荷兰）。1.2 髓核细胞的分离及培养

实验动物以2%戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔注射，过量麻醉处死后，取背部正中切口，分离椎旁肌肉，取出脊柱胸腰段，0.01 mol/L PBS液冲洗至无明显血迹。尖刀切开椎间盘纤维环，撑开椎间隙，用无菌小刮匙将胶冻样髓核组织刮出，置入盛有DMEM/F12液的培养皿中，剪成大小约1 mm × 1 mm × 1 mm的碎块后转移至离心管，以离心半径 20 cm，1 000 r/min离心5 min，收集沉淀。用0.2%Ⅱ型胶原酶消化液重悬组织，37℃消化15 min，期间间断用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液混浊后加入过量培养液停止消化。同上法离心5 min后取上清液，用含15%灭活FBS的DMEM/F12制成细胞悬液，血细胞计数板计数，

按1 × 105个/ mL接种至50 mL培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，每2天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞情况。细胞融合为单层时用

0.25%胰蛋白酶消化并进行细胞传代。1.3 检测指标

1.3.1

髓核细胞活力测定 分别在取材后、原代、

第1代、第2代细胞培养期间取细胞悬液，计数制成

1 × 105个/mL悬液，按DMEM/F12∶细胞悬液∶2%苔盼蓝母液为7.9∶0.1∶2.0的比例混匀，37℃静置5 min，吸取适量上述悬液至平板计数器上，于倒置相差显微镜上计数4大格蓝染和未蓝染细胞个数，计数2次，取均值计算细胞活力。细胞活力＝未蓝染细胞（/蓝染细胞＋未蓝染细胞）× 100%。

1.3.2 髓核细胞组织学观察 将第1代及第2代细胞按 1 × 104个/mL接种至含盖玻片的6孔培养板中进行细胞爬片。培养至细胞基本长成单层时取出玻片，行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O染色以及Ⅰ、Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色观察。

1.3.3 MTT测定髓核细胞生长曲线 取原代细胞用含5% FBS培养液配成单个细胞悬液，细胞计数1 × 104个/mL，以每孔体积 200 μL加入96孔培养板中。分别于培养1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 d，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度（A）值。

1.3.4 透射电镜观察 取原代和第2代髓核细胞，以离心半径20 cm，1 500 r/min离心5 min后，于离心管培养3 d，固定、脱水、包埋、聚合、染色，透射电镜观察。2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察

原代髓核细胞刚分离时呈类圆形，折光性较强1 a），贴壁速度较缓慢。分离培养后5 d开始有部分细胞贴壁，呈克隆状或岛状分布，细胞呈多角形或短梭形，部分贴壁完全细胞呈纺锤形，轮廓清楚，胞核明显，可见1～2个核仁（图1 b、c）。培养6～8 d后细胞贴壁数目明显增多，细胞生长进入指数生长期，生长迅速，10～15 d贴壁细胞开始出现融合。培养约17 d，细胞长满瓶壁，即可进行传代。传代后细胞贴壁时间较快，约为3 d，生长较原代细胞稍快，但胞质内出现空泡；细胞传第2代后出现老化，形态发生明显改变，约80%细胞变成长梭形（图1 d）。2.2

髓核细胞活力测定

髓核细胞在刚分离完成后活力为95%～97%，原

（（图中国修复重建外科杂志2008年9月第22卷第9期代培养期间为98%～100%，第1代培养期间仍能维持100%，第2代细胞活力下降较为明显，为75%～80%。2.3

髓核细胞组织学观察

髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性（图2 a），HE染色见细胞核、胞质着色明显（图2 b）。第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性，细胞核、细胞浆均不着色（图2 c）；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性，细胞核几乎不着色，胞浆着色，靠近核周明显，并可见颗粒状物质，苏木精复染后细胞核呈浅蓝色（图2 d）；聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性，胞浆呈粉红色，核周可见棕红色颗粒状物质，苏木精复染后细胞核呈浅蓝色（图2 e）。第2代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性（图2 f），Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性（图2 g），聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅图2 h）。

2.4  MTT测定髓核细胞生长曲线

将各孔每个时间点所测结果取均数，绘制的细胞生长曲线与体外细胞培养时观察的生长过程相符图3）。

2.5 透射电镜观察

原代髓核细胞的细胞核呈卵圆形，核表面光滑，有完整核膜，核仁多偏于一侧，核内常染色质占优势；细胞质中可见少量长条状的粗面内质网及线粒体，有黑色颗粒散在分布，细胞间质散在黑色糖原颗粒聚集。随着细胞代次的增加，细胞内核糖体的数量逐渐减少，线粒体增多，粗面内质网的囊池逐渐扩张，第2代髓核细胞可见胞质内大量空泡出现，黑色糖原颗粒减少，线粒体增多，细胞器出现肿胀，细胞开始老化（图4）。3

讨论

种子细胞的获取和体外培养是组织工程的重要研

究内容之一。细胞主要来源于自体、异体及异种组织细胞等，自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓度的细胞接种，自体组织细胞存在数量少及长期传代后细胞功能老化的问题[4-5]，因此探讨自体组织细胞体外扩增和维持其功能的方法十分重要。椎间盘的退变发生和发展与椎间盘基质的合成及分解代谢平衡失调密切相关[6-7]，激活椎间盘细胞，改善ECM，有可能在一定程度上延缓甚至逆转椎间盘组织退变的发生及发展。髓核细胞作为髓核中的主要细胞，对髓核基质成分的改建和维持起重要作用，因此研究体外髓核细胞生物学特性，对以髓核细胞作为种子细胞的椎间盘髓核组织工程有重要意义。

髓核细胞的增殖能力较一般细胞弱，对培养环境要求较高，单层培养时具有锚着依赖性[8]。根据文献，

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我们实验采用DMEM/F12加15% FBS培养基，酸碱度调至pH 7.0，并加入维生素C 30 mg/L，促进细胞增殖；根据细胞生长情况，每2～3 d 换液1次，以保证细胞有良好的生长环境[9-11]。

新分离出的细胞均呈类圆形，初贴壁时呈短梭形或多角形，胞质向外伸突，然后突起逐渐伸长，达亚融合状态时呈漩涡状或火焰状的细胞团，10～15 d融合。传代的细胞贴壁后又恢复至短梭形或多角形，但随传代次数的增多，突起逐渐变长，最终成为长梭形，生长缓慢，融合时间明显延长，提示髓核细胞具体反分化趋势[12]。细胞活力测定表明刚分离的细胞活力较强，培养约1周后活力达最强，传代培养后活力逐渐减弱，符合细胞的生长周期，同时也说明髓核细胞的生长能力不旺盛。

正常椎间盘髓核细胞合成分泌大量的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖以及其他的一些蛋白聚糖，包括多功能蛋白聚糖、Ⅵ型胶原蛋白等。聚集蛋白聚糖是髓核细胞中的大分子糖蛋白，其核心蛋白连结大量葡萄糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG），番红O染液可与

GAG特异性结合显色[13]，而Ⅰ型胶原蛋白表达及ALP反应均为阴性，这两项标记物均为成纤维细胞所有[14]。随着髓核细胞体外培养传代次数的增加，细胞形态发生改变，有向成纤维细胞分化的趋势，其细胞表型也发生相应变化。我们分别对不同时期的髓核细胞进行了Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖的免疫组织化学染色，结果表明随细胞体外传代次数的增加，髓核细胞原有蛋白表型发生了改变，原来所不具有的Ⅰ型胶原蛋白开始合成分泌，不仅从细胞形态上，而且从表达分子上均有去分化生长趋势。

实验中透射电镜观察到髓核细胞体积较大，为25～85 μm，含有幼稚线粒体和粗面内质网，黏稠的胞浆内含有糖原和胞质丝。原代髓核细胞内线粒体数量较少，提示椎间盘细胞的代谢在体内相对不活跃，传代后细胞内线粒体逐渐增多而核糖体的数量逐渐减少，粗面内质网的囊池逐渐扩张，提示细胞逐渐衰老。Ttout等（1982）曾报道幼稚线粒体和糖原的存在是体内髓核细胞的特性，因为椎间盘组织为无血管组织，细胞的代谢主要为无氧代谢，能量来源于糖酵解，而体外培养的细胞因处于有氧环境中，可见较多线粒体，糖原很少或消失。

目前，这些特殊的细胞内结构具体功能尚不明确，但它们的存在也给了我们一些提示，比如幼稚线粒体表明无氧代谢旺盛，粗面内质网提示代谢能量的大部分供给了蛋白质合成。我们已知髓核的能量供给相对较少，而细胞内存在的糖原能是在骨骼运动中为髓核

（（·1124·

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, September 2008, Vol. 22, No.9图1 兔髓核细胞倒置相差显微镜下观察

a 原代细胞1 第2代（× 100） b 培养5 d时细胞（× 200） c 培养7 d贴壁完全时细胞（× 400） da 第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色（× 100） b 第1代髓核细胞HE染色（× 200） c 第

e1d髓核细胞（× 100） 图2 兔髓核细胞组织学染色观察 1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色（× 100） 髓核细胞聚集蛋白聚糖番红O染色（× 200） 图3 内黑色颗粒状物质及少量内质网、线粒体 肿胀

第1代髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（× 400）

g 第1代髓核细胞聚集蛋白聚糖番

h红O染色（× 400） f 第2代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色（× 400）

第2代髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（× 200） 第2代

原代髓核细胞生长曲线 图4

兔髓核细胞透射电镜观察（× 1 850） a 原代髓核细胞见胞质

c 第2代髓核细胞可见胞质内大量空泡出现，细胞器出现b Cells cultured for 5 days (× 200) c Cells with full b 原代髓核细胞间质可见黑色颗粒物质聚集

a Primary cells (× 100) Fig.1 The rabbit NPCs by inverted phase contrast microscope adherence at 7 days (× 400) passage (× 100) 1d The 2nd passage (× 100) Fig.2 The rabbit NPCs by histological staining Safranin O staining of the 1st passage (× 400) a Toluidine bule staining of the 1st 1db HE staining of the 1st passage (× 200) ec I collagen immunohistochemical staining of the 1st passage (× 100) fh II collagen immunohistochemical staining of the 1st passage (× 400) ing of the 2nd passage (× 400) g I collagen immunohistochemical stain- Safranin O staining of the 2nd passage II collagen immunohistochemical staining of the 2nd passage (× 200) (× 200) Fig.3 Growth curve of primary paasage Fig.4 The rabbit NPCs by TEM (× 1 850) observed in primary passage organ became swellb Black particle were observed in intercellular substance a Black particle and less endoplasmic reticulum were c Large amounts of vacuoles, decrease of black particle and cell 中国修复重建外科杂志2008年9月第22卷第9期细胞提供能量，这可能解释了为什么成年后髓核细胞会逐渐消失，因为糖原的不断消耗，而补给的能量不足，最终细胞内糖原消耗殆尽，导致细胞死亡[15]。

髓核细胞体外培养受到多种因素的影响，如氧浓度、细胞接种浓度、添加的物质成分（抗生素、微量元素、生长调节因子等）。赵梓汝等[16]将TGF-β1干预下的兔BMSCs移植到兔退变椎间盘，抑制髓核细胞退变并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。Gilbertson等[17]研究了rhBMP-2和rhBMP-12对椎间盘纤维环细胞及髓核细胞的影响，发现这两种细胞因子均可促进椎间盘细胞基质的合成分泌，并具有相互促进作用。此外

Le Visage等[18]和Vadala等[19]同时发现，体外髓核细胞与BMSCs共培养时，髓核细胞具有促进干细胞向髓核细胞分化，两种细胞相互影响其基因表型的改变，增加其细胞基质蛋白分泌的作用。

衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特性，髓核细胞培养3代后即出现老化，生长停滞，功能逐渐丧失。Halloran等[20]将正常髓核细胞植入酶处理的交联atelocollagenⅡ支架，培养7 d后与种植在未经酶处理的atelocollagenⅡ支架中的细胞比较，其Ⅱ型胶原和Aggrecan合成明显增加。Sakai等[21]首次报道通过腺病毒转染SV40基因的方法构建了永生化的人髓核细胞株，细胞培养超过5个月，传20代以上，但形态学和功能特性仍保持不变，且无致瘤性。Kaneyama等[22]研究发现，随着椎间盘髓核细胞的退变，其Fas配体基因表达显著降低，证明Fas配体和髓核细胞退变存在关联，为基因治疗髓核退变提供了一个新的方向。综上述，改进细胞培养体系、改变细胞培养模式（单独培养、与成体干细胞共培养或复合支架培养），构建永生化细胞株，对髓核细胞进行基因干预，以期提高髓核细胞培养质量和数量、延缓细胞体外衰老及去分化发展，仍需进一步深入研究。

4 参考文献

1 胡有谷. 腰椎间盘突出症. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 1995: 94-95. 2 孟壮志, 朱青安, 范真, 等. 腰骶部椎间盘髓核摘除对脊柱稳定性影响的生物力学研究. 中国临床解剖学杂志, 1999, 17(1): 75-76. 3 Roughleya P, Hoemann C, DesRosiers E, et al. The potential of chito-san-based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus supplementation. Biomaterials, 2006, 27(3): 388-396.

4 Anderson DG, Risbud MV, Shapiro IM, et al. Cell-based therapy for disc repair. Spine J, 2005, 5(6 Suppl): 297S-303S.

5 Sobajima S, Vadala G, Shimer A, et al. Feasibility of a stem cell therapy for intervertebral disc degeneration. Spine J, 2007. [Epub ahead of print]

6 Gruber HE, Hanley EN Jr. Recent advances in disc cell biology. Spine, 2003, 28(2): 186-193.

·1125·

7 Roughley PJ, Alini M, Antoniou J. The role of proteoglycans in aging, degeneration and repair of the intervertebral disc. Biochem Soc Trans, 2002, 30(Pt 6): 869-874.

8 Gan JC, Ducheyne P, Vresilovic E, et al. Bioactive glass serves as a sub-strate for maintenance of phenotype of nucleus pulposus cells of the intervertebral disc. J Biomed Mater Res, 2000, 51(4): 596-604. 9 张传志, 周跃, 李长青. 兔髓核细胞体外最佳培养条件的探索. 中国矫形外科杂志, 2005, 13(14): 71-74.

10 Gan JC, Ducheyne P, Vresilovic EJ, et al. Intervertebral disc tissue en-gineering II cultures of nucleus pulposus cells. Clin Orthop Relat Res, 2003, (411): 315-324.

11 Lee JY, Hall R, Pelinkovic D, et al. New use of a three-dimensional

pellet culture system for human intervertebral disc cells: initial charac-terization and potential use for tissue engineering. Spine, 2001, 26(21): 2316-2322.

12 陈岩, 胡有谷, 刘勇. 椎间盘细胞培养过程中的反分化研究. 中国脊

柱脊髓杂志, 2000, 10(3): 188-1.

13 Richardson SM, Hughes N, Hunt JA, et al. Human mesenchymal stem

cell differentiation to NP-like cells in chitosan-glycerophosphate hy-drogels. Biomaterials, 2008, 29(1): 85-93.

14 Sive JI, Baird P, Jeziorsk M, et al. Expression of chondrocyte markers

by cells of normal and degenerate intervertebral discs. Mol Pathol, 2004, 55(2): 91-97.

15 Hunter CJ, Matyas JR, Duncan NA. The notochordal cell in the nucle-us pulposus: a review in the context of tissue engineering. Tissue Eng, 2003, 9(4): 667-677.

16 赵梓汝, 吴小涛, 祁亚斌, 等. TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细

胞对退变椎间盘治疗的实验研究. 中国矫形外科杂志, 2006, 14(13): 1019-1022.

17 Gilbertson L, Ahn SH, Teng PN, et al. The effects of recombinant hu-man bone morphogenetic protein-2, recombinant human bone mor-phogenetic protein-12, and adenoviral bone morphogenetic protein-12 on matrix synthesis in human annulus fibrosis and nucleus pulposus cells. Spine, 2008, 8(3): 449-456.

18 Le Visage C, Kim SW, Tateno K, et al. Interaction of human mesen-chymal stem cells with disc cells: changes in extracellular matrix bio-synthesis. Spine, 2006, 31(18): 2036-2042.

19 Vadalà G, Studer RK, Sowa G, et al. Coculture of bone marrow mesen-chymal stem cells and nucleus pulposus cells modulate gene expression profile without cell fusion. Spine, 2008, 33(8): 870-876.

20 Halloran DO, Grad S, Stoddart M, et al. An injectable cross-linked

scaffold for nucleus pulposus regeneration. Biomaterials, 2008, 29(4): 438-447.

21 Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, et al. Immortalization of human

nucleus pulposus cells by a recombinant SV40 adenovirus vector: es-tablishment of a novel cell line for the study of human nucleus pulpo-sus cells. Spine, 2004, 29 (14): 1515-1523.

22 Kaneyama S, Nishida K, Takada T, et al. Fas ligand expression on hu-man nucleus pulposus cells decreases with disc degeneration processes. J Orthop Sci, 2008, 13(2): 130-135.

（收稿：2008-01-22

修回：2008-05-28）

（本文编辑：王雁 董奇男）