２０１０，４４（９）：７—９，３７／李泽鸿，等 中国兽药杂志 ・７・ 白喉毒素ＤＡＢ３８９一ｏＬＭＳＨ重组毒素的构建及表达 李泽鸿 ，刘文涛 ，李昌昊 ，张国利 （１．吉林农业大学生命科学学院，长春ｔ３０１１８；２．军事医学科学院军事兽医研究所，长春１３００６２） ［收稿日期］２０１０—０６—２１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２０１０）０９—０００７—０４［中图分类号］￥８５２．４４ ［摘要］ 利用含有白喉毒素Ｎ端序列的基因作上游引物、含有ｏｔＭＳＨ全序列作下游引物，以 ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ 一ＥＧＦ为模板，ＰＣＲ扩增ＤＡＢ瑚一ａＭＳＨ基因片段，用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｎｃｏ Ｉ酶切，并插入原核表达载体ｐＥＴ２８ａ的相应位点，构建了重组表达载体ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ 。一 ｏ【ＭＳＨ，在大肠杆菌中表达重组融合蛋白ＤＡＢ瑚一ｃｔＭＳＨ，转化菌经１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、３０℃诱导５ ｈ， 用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达的重组毒素。结果表明扩增的片段与理论值一致，重组 质粒的ＤＮＡ序列分析正确；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ表明重组毒素相对分子量为４３．７６ ＫＤ，且表达量达菌体 总蛋白量的３１．６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显示，重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合，表明已成功 构建表达了重组ＤＡＢ埘一ｏｔＭＳＨ的工程菌株，并获得表达蛋白。 ［关键词］ＤＡＢ，的一ｅｔＭＳＨ；重组毒素；构建；表达 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｏｘｉｎ ＤＡＢ３８９一ａＭＳＨ ＬＩ Ｚｅ—ｈｏｎｇ ，ＬＩＵ Ｗｅｎ—ｔａｏ ，ＬＩ Ｃｈａｎｇ—ｈａｏ ，ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ—ｌｉ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｌ ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８； ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＭｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＭｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２；Ｃｈｉａｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＤＡＢ３８９～ａＭＳＨ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３８９一ＥＧＦ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｏｗｎ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｔＭＳＨ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ Ｎｃｏ Ｉ ａｎｄ ＥｃｏＲ Ｉ，ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｎｃｏ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ ｓｉｔｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ２８ａ（十），ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３８９一ｃ￣ＭＳＨ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＶｒＧ ａｔ ３０℃ｆｏｒ ５ ｈｏｕｒｓ．Ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｇｅｌ ｓｃａｎｎｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｏｘｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ３ １．６％ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ４３．７６ ＫＤ．Ｓｏ ｔｈｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＡＢ３８９一ａＭＳＨ ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＤＡＢ３８９一ｅｔＭＳＨ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 白喉毒素是由５３５个氨基酸组成，分子量为５８ １９３个氨基酸组成（１—１９３）；中间为穿膜区，由１７３ ＫＤ的多肽。白喉毒素在胰蛋白酶的消化作用下， 个氨基酸组成（２０５—３７８）；Ｃ端为受体结合区，由 可降解成为Ａ（１９３个氨基酸）和Ｂ（３４２个氨基酸） １４９个氨基酸组成（３８６—５３５）。白喉毒素的立体 两个片段。它有３个组成区域：Ｎ端为催化区，由 结构为Ｙ字形，穿膜区在基底部，其两臂分别为催 基金项目：长春市科技局资助项目（编号：０９ＹＪ４７） 作者简介：李泽鸿（１９６５年一），副教授，博士，硕士生导师，研究方向为生物药资源开发与抗癌药物。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｅｈｏｎｇｌｉ６６ ＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＢ．ｃｎ 通讯作者：张国利。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｇｕｏｌｉ２００１＠１２６．ＣＯＢ ・８・ 中国兽药杂志 ２０１０，４４（９）：７—９，３７／李泽鸿，等 化区和受体结合区…。将对肿瘤细胞有亲和力的 １．７ ＤＡＢ。 ，一仅ＭＳＨ重组融合蛋白的表达重组 细胞因子或抗体与毒素结合，构建获得免疫毒素 质粒转化表达菌进行ＩＰＴＧ诱导培养，以表达 （又称作生物导弹或重组毒素），对肿瘤进行导向治 ＤＡＢ 。 一ｃｔＭＳＨ蛋白，表达产物ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析， 疗已成为当前研究的热点 Ｉ４］。本研究利用ＤＴ作 并进行薄层扫描分析，检测蛋白表达量。 为细胞毒性部分，将特异性短肽激素￣ｘＭＳＨ全序列 １．８ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验Ｗｅｓｔｅｒｎ 基因与ＤＡＢ３８９基因连接，构建ＤＡＢ，。 一ｃｔＭＳＨ融合 ｂｌｏｔ按常规进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ、转膜、封闭，并依次加 蛋白，并在大肠杆菌中进行了高效表达，为进一步 入抗白喉血清和酶标二抗，在底物液中显色。 研究其特异性活性奠定基础。 ２结果 １材料与方法 ２．１ ＤＡＢ３８９一ｃｔＭＳＨ的扩增 取５ Ｌ的扩增产 １．１ 菌种及质粒ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３８９一ＥＧＦ由军事 物，电泳鉴定显示，扩增产物为９４８ ｂｐ左右的目的 医学科学院军事兽医研究所生物技术应用研究实 基因（图１）。 验室保存，原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）、受体菌 ＪＭ１０９、ＢＩ２１（ＤＥ３）均购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司，ＣＳ一９３００ 薄层扫描仪（日本岛津公司）。 １．２ 主要试剂ＰＣＲ试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ一 ２０００ ｌ０００ ．．‘—一９４８ｂｐ ２０００、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ ７５０ 和Ｎｃｏ Ｉ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、 ５００ ２５０ ＩＰＴＧ、ｐＭＤ１８一Ｔ载体等购自ＴａＫａＲａ公司，引物合 １ＯＯ 成及序列分析由大连宝生物公司完成；马源抗白喉 毒素阳性血清由本室提供，ＨＲＰ标记的鼠抗马二抗 由长春科上公司提供。 １．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ一２０００；２、３：ＰＣＲ产物 １．３ 引物的设计与合成 参考Ｃｏｌｌｉｅｒ 报道的 图１ ＤＡＢ３∞一ｃｔＭＳＨ基因的ＰＣＲ扩增结果 ＤＡＢ瑚基因的核苷酸序列，设计并合成２条引物， ２．２ ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３Ｒｑ一 ＭＳＨ的酶切鉴定 随机 引物１和２中分别引入酶切位点ＥｃｏＲ Ｉ和Ｎｃｏ Ｉ。 挑取阳性菌落，提取质粒，进行双酶切鉴定，结果如 ？ｒｉｍｅｄ：５ ＣＡＴＧ ！ ＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴ— 图２所示，ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３Ｒｑ—ｔｘＭＳＨ质粒在９４８ ｂｐ ＧＴＦＧＴＴＧ ３ ；Ｐｆｉｍｅ￣：５ ＣＧ ＴＦＡＴＡＣＣＧ— 处可见明显的酶切条带。 Ｇ 删ＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＴＧＴＦＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧ ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡ ３ 。 １ｌＩ ４ ＰＣＲ’扩增ＤＡＢ 一ｃｔＭＳＨ 以ｐＥＴ２８ａ／ ＤＡＢ３８９一ＥＧＦ为模板，ＰＣＲ扩增ＤＡＢ３８９一ｏ￣ＭＳＨ。 ２Ｏｏ０ 条件为：９４ｏＣ ２ ｍｉｎ＿＋（９４℃５０ ｓ— ５℃７０ ｓ—＋７２℃ ９４８ｂｐ １０ｏ０ ７５０ ７Ｏ ｓ）２５个循环，７２℃ｌ０ ｍｉｎ一４ｃ【＝保存。ＰＣＲ产 ５ｏｏ 物回收纯化。 ２５０ １．５ ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ 一￣ｘＭＳＨ的构建 回收片段 １００ 加入少量的ｐＭＤ１８一Ｔ，用Ｔ４连接酶１６￣Ｃ连接１６ Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ一２０００；１．ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３８９一ｃｔＭＳＨ酶切； ｈ。转化，筛选阳性重组质粒，酶切鉴定。 ２．ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３Ｂ９（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２一ａＭＳＨ酶切 １．６重组质粒ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３８９一ｏｔＭＳＨ的构建 图２ ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３Ｂ９一ａＭＳＨ的酶切鉴定 酶切质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）和质粒ｐＭＤ１８Ｔ／ＤＡＢ３８９一 ２．３ 重组质粒ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３ｓ９一ｃｔＭＳＨ的酶切鉴 ｃｔＭＳＨ，回收目的片段，纯化。用Ｔ ＤＮＡ连接酶进 定重组质粒ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３８９一ｏｔＭＳＨ进行双酶切 行连接，构建重组表达质粒ｐＥＴ２８ａ／ＤＡＢ３ 一 鉴定，结果如图３所示，切出约９４８ ｂｐ大小的外源 ｃｔＭＳＨ。转化于感受态ＢＬ２１（ＤＥ ）中，构建重组菌 基因片段，表明已将ＤＡＢ， 一ｃｔＭＳＨ基因插入 株，提取质粒，ＰＣＲ鉴定，酶切鉴定。 ｐＥＴ２８ａ（＋）中，序列分析正确，与理论值一致。 ２０１０，４４（９）：３５～３７／周明霞，等 中国兽药杂志 基因治疗产品、分析仪器资质、离子色谱、拉曼光 谱、命名法、药物稳定性、处方的药学计算、玻璃仪 器的清洁，等等。 食品补充剂中列出了编号为２０００以上的规 ２．６食品补充剂食品补充剂在ＵＳＰ中作为独立 章节叙述。本章按照字母顺序列出了大约２５０多 定，共有７个通则，分别是：微生物计数试验 ＜２０２１＞，无菌检查法＜２０２２＞，非灭菌营养和食 种食品补充剂，其品种主要包括了维生素类、氨基 酸类、营养补充物（钙、锌、铁等）和植物药等。其中 超过一半以上的品种与ＵＳＰ是重复的，正文中注明 “见×××各论”；个别与ＮＦ重复的，正文中注明： 品补充剂的生物学特征＜２０２３＞，植物药补充信息 “见×××ＮＦ”，不再重复。 ＜２０３０＞，食品补充剂的崩解和溶出＜２０４０＞，重 ３ ＮＦ ２７ 量差异＜２０９１＞，食品补充剂的生产规范 ＮＦ ２７编排在第１卷上。辅料列在ＮＦ凡例之 ＜２７５０＞。 前，按照功能作用分类列出。ＮＦ凡例列在辅料的 ２．４试剂、指示剂和溶液本章以试剂部分开头， 后面。除了名称、“法定的”和“法定品种”、非特殊 列出了试剂、试药及其有关信息，如分子式、分子 条件的贮藏等３点要求，其余均按照ＵＳＰ ３２的凡 量、性状、溶解性、熔点、比重等物理性质。某些试 例执行，通则、试剂、指示液和溶液，参考图表等内 剂还给出了简单的质量标准，如含量测定、干燥失 容也都按照ＵＳＰ ３２中的相应内容执行。 重等。本部分还给出了氯化物、硫酸盐、砷盐、重金 ＮＦ各论部分列出了大约４６０种ＮＦ法定品种 属等一般检查中的试剂的配制方法和要求。 的质量标准。凡是与ＵＳＰ ３２重复的，正文中注明： 第２部分是指示剂和指示剂试纸。列出了指 “见×ｘ×各论”，不再重复。 示剂的分子量、分子式、熔点等物理性质。指示剂 ４索引 试纸可以用滤纸条浸入一定的溶液中，再干燥制 ＵＳＰ与ＮＦ合并为统一的索引，在每卷的最后 得。这一部分注明了这些溶液的配制方法。 部分列出。读者只要查阅索引就可以方便地找到 第３部分是溶液，包括缓冲溶液、比色溶液、试 相关内容。 液、滴定液，并列出了常用溶液的配制方法。 第４部分是色谱试剂。列出柱子、相和担体的 参考文献： 代号及具体规格要求。 ［１］Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ２．５参考图表ＵＳＰ参考图表部分给出了以下内 Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ３２，Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２７［ｓ］． 容：计量胶囊剂和片剂的容器、ＵＳＰ—ＮＦ部分药物 ｆ２］美国药典官方网站：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ／． 和辅料的性状描述及相关溶解性、ＵＳＰ—ＮＦ部分药 【３］李芳．美国药典第２４版“凡例”主要内容介绍［Ｊ］．中国药学 杂志，２０００，３５（１１）：７８２—７８５． 物和辅料的近似溶解度、原子量、不同浓度乙醇比 ［４］ 陈桂良．浅谈美国药典中各论的制定原则［Ｊ］．中成药，１９９９， 重表、黏度表、温度等价表等。 （７）：３７８—３８１． （上接第９页） 国免疫学杂志，２００４，２０（３）：１７１—１７２． ［３］Ｐａｓｔａｎ Ｉ，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ Ｖ，Ｆｉｔｚ ＧｅｒＭｉｄ Ｄ Ｊ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｏｘｉｎｓ ａｓ ［８］ Ｃａｂｉａｕｘ Ｖ，Ｂｒａｓｓｅｕｒ Ｒ，Ｗａｔｔｉｅｚ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，１９９２，６１： Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ａｃｉｄｉｃ Ｌｉｐｏ— ３３１—３５４． ｓｏｍｅｓ Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｅｓｐｅｃｔｒｏｓｅｏｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ［４］Ｊ Ｄｕｖｉｃ Ｅ，Ｃａｔｈｅｒ Ｊ，Ｍａｉｚｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＤＡＢ，８９ＩＬ２ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｈｅｎ，１９８９，２６４（９）：４９２８—４９３８． Ｔｏｘｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｓｔａｇｅ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ ［９］Ｌｉ Ｙ，ＭｃＣａｄｄｅｎ Ｊ，Ｆｅｔｔｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｓｔａｔｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ，１９９８，５８（１）：８７—９Ｏ． ｏｆ ｈｔｅ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ Ａ Ｃｈａｉｎ（ＤＴ—Ａ）：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉ— ［５］ Ｃｏｌｌｉｅｒ Ｒ Ｊ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｉｃ ｔｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏ－ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ ａｎｄ ＰＥ Ｔｏｘｉｎ Ａ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ｍｏｔｅｒ—ｄｒｉｖｅｎ ＤＴ—Ａ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］． １９８８，２（２）：２９３—２９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２，６２（９）：２５７６—２５８２． ［６］李泽鸿，张国利，岳玉环，等．ＤＡＢ３８９（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２一ａＭＳＨ重组 【１０］Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｇ，Ｍｉｃｈａｅｉｌ Ｊ Ｂ，Ｇｌｅｎｎ Ｈｏｍ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 融合蛋白的构建及表达［Ｊ］．中国兽医学报，２００７，２７（４）：４７７ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｕｒｃｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ Ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ Ｂ Ｃｏｒｙｎｅ— —４８０． ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ［Ｊ］．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ，１９８３，８０：６８５３—６８５７． ［７］张国利，吴广谋，李俊植，等．白喉毒素一（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２一人表皮 ［１ １］Ｋｒｅｉｔｍａｎ Ｒ Ｊ，Ｐａｓｔａｎ Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａ－ 生长因子融合蛋白的纯化及其特异性细胞毒性研究［Ｊ］．中 ＰＹ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ Ｒｅｖ，１９９８，３１：５３—８８．
