链尿佐菌素加高糖高脂饮食复制大鼠2型糖尿病模型[1]

中国比较医学杂志

CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEFebruary,2008

Vol.18　No.2

研究报告

链尿佐菌素加高糖高脂饮食复制大鼠2型糖尿病模型

穆松牛,高　云,万福生,许宝华,康路妹

(南昌大学实验动物科学部,南昌　330006)

　　【摘要】　目的　链尿佐菌素加高糖高脂饮食诱导大鼠2型糖尿病模型的建立。方法　SD雄性大鼠高糖高脂饲料喂养3周后,采血检测空腹血糖及血清胰岛素,按25mgΠkg体重剂量一次性腹腔内注射链尿佐菌素,3d后,行糖耐量实验,对糖耐量异常大鼠继续喂以高糖高脂饲料,在第2、第4周再两次采血检测糖尿病鼠空腹血糖及血清胰岛素。结果　与对照组比较,高糖高脂喂养大鼠血清胰岛素明显上升(P<0101),但血糖无变化(P>0105),糖尿病鼠血糖及血清胰岛素均显著的高于对照组(P<0101)。结论　高糖高脂喂养能致大鼠明显的高胰岛素血症,辅以小剂量一次性注射链尿佐菌素而造成的糖耐量异常,可成功复制出2型糖尿病大鼠模型。

【关键词】　模型,糖尿病,2型;高糖高脂饮食;链尿佐菌素【中图分类号】R-33　　【文献标识码】A　　【文章编号】167127856(2008)0220019204

RatModelofType2DiabetesInducedbyStreptozotocin

andHigh2Carbonhydrate2FatDiet

MUSong2niu,GAOYun,WANGFu2sheng,XUBao2hun,KANGLu2mei

(FacultyofLaboratoryAnimalSciences,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

【Abstract】　Objective　Toestablisharatmodeloftype2diabetesinducedbystreptozotocinandhigh2carbonhydrate2fat

diet.Methods　HealthyadultmaleSDratswereraisedforthreeweeksbyhigh2carbonhydrate2fatfeeds。Thebloodwascollectedtodeterminethebloodglucoseandplasmainsulinlevels.Theratsofexperimentalgroupreceivedintraperitonealinjectionofstreptozotocinonceinadoseof25mgΠkg・b.w.,andwereengagedinglucosetoterancetestafterthreedays.Fortheglucosetoterancetest,theratswereraisedcontinuouslybyhigh2carbonhydrate2fatfeeds.Bloodsamplesweretakentodetectbloodglucoseandseruminsulinlevelsinthediabeticratsatthesecondandfourthweek.Results　Seruminsulinlevelinthehigh2carbonhydrate2fatfeedsgroupwassignificantlyincreasedascomparedwiththatofcontrolgroup(P<0101),butthebloodglucoselevelwasnotchanged(P>0105).Thebloodglucoseandseruminsulinlevelsinthediabeticratswerebothsignificantlyincreasedascomparedwiththoseinthecontrolgroup(P<0101).Conclusion　Atype2diabetesanimalmodelwithapparenthyperinsulinismandabnormalglucosetolerancehasbeensuccessfullyestablishedinratsraisedbyhigh2carbonhydrate2fatfeedsandcombinedwithanintraperitonealinjectionofstreptozotocinonceinalowdose.

【Keywords】　Type2diabetes,animalmodel;High2carbonhydrate2fatdiet;Streptozotocin

　　2型糖尿病(DM2)是以胰岛素分泌缺陷和胰岛

素抵抗为主要病理生理基础和显著特征、导致体内

[1]

葡萄糖和脂质代谢紊乱的一类糖尿病。现代社会,人们受生活、饮食方式的影响,糖尿病的发病率呈逐年升高的趋势,成为继心血管、肿瘤疾病以后的

第三号健康杀手,而其中2型糖尿病占绝大多数。目前临床上对2型糖尿病的治疗,基本以控制或治疗并发症为主要手段,因而以针对并发症为主的研

[作者简介]穆松牛(19-),男,高级实验师,研究方向:实验动物疾病模型。

20

中国比较医学杂志2008年1月第18卷第2期　ChinJCompMed,February2008,Vol.181No.2

究在2型糖尿病医学临床科研上占重要位置;分子

生物学技术和分子遗传学研究的发展,使2型糖尿病的遗传易感性等基础理论研究取得了很大进[2]

展。因此,建立理想的2型糖尿病模型对于深入研究其病因、发病机理、临床治疗与预防等至关重要。

糖尿病动物模型的复制通常分为遗传自发和人工诱发两类。遗传自发的糖尿病模型如BB鼠、NOD鼠、dbΠdb鼠、NYS鼠等来源困难且价格昂贵,所以用得较少;人工诱发糖尿病动物模型最简便、价廉的方法是给大鼠注射化学药物如链尿佐菌素(streptozotocin,STZ)或四氧嘧啶(alloxan)诱导。这些化学药物诱导的糖尿病动物模型也是研究糖尿病并发症的预防、控制与治疗的医学科研最为经济实用的模型。STZ和四氧嘧啶的作用机理都是选择性破坏胰岛β细胞,引起细胞坏死,导致血胰岛素不同程度下降和血糖升高,但形成的是与2型糖尿病病理特征和临床特点不符的1型糖尿病;而高糖高脂饲料的喂养会造成大鼠广泛的胰岛素抵抗,却可以维持大鼠正常的血糖水平,以上两者的有机结合可以复制出2型糖尿病动物模型1　材料和方法111　实验材料

11111　实验动物的选择与饲养:选择健康的雄性SD大鼠30只,体重120～160g(合格证:江西医动证字第02196-02号),饲养在室温(18～25)℃,相

[3]

112　实验方法与步骤

11211　第1次采血与腹腔注射:当实验组饲喂高糖

高脂、对照组饲喂基础饲料达3周时,全部鼠断食不断水12h后剪尾采血(016～1)mL,以2000转Πmin离心20～30min,吸出血清分装,约20μL血清用于测血糖,约100μL血清用于测血清胰岛素。采血后即给实验组大鼠一次性腹腔注射STZ25mgΠkg体重(STZ溶于柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液,所配浓度为10mgΠmL);对照组腹腔注射相应容量的柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液。

11212　糖耐量实验:实验组腹腔注射STZ后的第3

天,全部大鼠断食不断水,12h后连续剪尾采血3次,每次取血100μL左右,用于测血糖,做糖耐量实验。第1次取血后即以20%葡萄糖灌胃(剂量2gΠkg・体重),灌胃后依次后推1h进行第2次、再后推1h进行第3次采血。

11213　腹腔注射后的第2次、第3次采血:分别于

实验组腹腔注射STZ后的第2、第4周时行第2、第3次采血,以检查实验组大鼠的成模状况,采血方法及检测指标与第1次相同。

11214　其他:血糖测定用比色法,即GOD2PAP法;

。

血清胰岛素测定用放免法。113　统计学方法

实验数据分为3组进行统计比较:实验组鼠第1次采血的血液指标检测值属高糖高脂组;实验组腹腔注射STZ后第2、第3次采血检测达到造模标准大鼠的血液指标值属糖尿病组;对照组3次采血的血液指标检测值均属对照组。数据以均数±标准差(󰁡x±s)表示,数据比较使用方差分析,然后用Q检验。2　结果211　糖耐量实验

对湿度50%～80%的环境条件下,每笼5只,共分6

笼,自由采食、饮水。11112　实验动物的分组及饲料:以上大鼠适应性饲养1周后,称重,随机分成两组,实验组20只大鼠,对照组10只大鼠。实验组饲喂高糖高脂饲料,高糖高脂饲料的组成:基础料66.6%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇215%、胆酸钠1%,将这些成分加适量水拌匀揉团做成条状,然后放在恒温鼓风干燥箱内(80～85)℃干烤3～4h;对照组饲喂基础颗粒饲料。基础料的营养成分符合国标《GB1492413-2001・实验动物・小鼠大鼠配合饲料》的营养标准。11113　主要仪器与试剂:UV27型分光光度计:上海分析仪器厂生产;TD42台式离心机:湖南仪器仪表总厂离心机厂;GOD2PAP血糖检测试剂盒,胰岛素放免试剂盒:北京福瑞生物工程公司生产;胰岛素:美国Lilly公司生产;等。

糖耐量实验的3次取血均显示实验组血糖明显的高于对照组,有显著的统计学差异,这表明实验组注射STZ后的空腹血糖增高和糖耐量明显降低。见表1。212　3次采血所显示的造模状况及血液指标检测值分析

第1次采血实验组(即下表中高糖高脂组)未注入STZ,空腹血糖与对照组差异不显著(P>0105),但血清胰岛素与对照组比较差异极显著(P<0101)(表2);实验组成模状况:注射STZ后的第2次取血

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21

表1　对照组与实验组糖耐量实验血糖值比较(mmolΠx±s)L,󰁡

Tab.1　Glucosetolerancevaluesinratsofthecontrolandexperimentalgroups(󰁡x±s)(mmolΠL)

组别

Group

第1次1stassay

有效检样数

Effectivenumber

817

第2次2ndassay

有效检样数

Effectivenumber

8

3

第3次3rdassay

有效检样数

Effectivenumber

8

3

血糖值

Gluvalue2.44±0.448.35±5.353

血糖值

Gluvalue2.88±1.352017±6.163

血糖值

Gluvalue2113±011917.50±31333

3

对照组Control

实验组Experiment

56

注:以上各次糖耐量实验两组比较,33P<01011

Note:33P<0101,comparisonoftheglucosetolerancevaluesbetweenthetwogroups.

表2　三种状态大鼠组空腹血糖、血清胰岛素比较(󰁡x±s)

Tab.2　Comparisonoffastingbloodglucoseandseruminsulinlevelsinratsofthe3groups组别

Group

对照组Control

高糖高脂组Highsugarandfat

糖尿病组Diabetes25

33

注:与对照组比较,P<0101。

3

Note:P<0101,comparedwiththecontrolgroup.

空腹血糖检测Fastingbloodglucose

有效检样数Effectivenumber检测值(mmolΠL)Value

183122±1141102195±0198

17.00±5.173

3

血清胰岛素检测Seruminsulin

有效检样数Effectivenumber检测值(mmolΠL)Value

2349.52±18.57

1316

105.33±36.80385.53±221673

33

检测显示实验组(即表中糖尿病组)已有8只大鼠、第3次取血检测再显示实验组已有17只大鼠空腹血糖及血清胰岛素与对照组相比差异极显著(P<0101),达糖尿病造模标准(表2)。成模后的大鼠并性注射STZ的量不同而致的差别,正如有研究表明:STZ致胰岛细胞损伤程度取决于注射剂量,低剂量

[7]

诱导β细胞INS21凋亡,高剂量致β细胞坏死。本实验所注射的STZ相对较少,因而对胰岛β细胞的

出现明显的多食、多饮、多尿、消瘦;实验组有3只、对照组有1只大鼠死亡。3　讨论

损伤相对较轻,大鼠成模的速度则较缓些,然而,大

剂量的一次性注射STZ,会致大量的胰岛β细胞被破坏,可能会使造模动物的存活率降低

[8]

,而本实验

小剂量注射STZ,成模动物的存活率相对较高,模型动物的生命力相对较强,有利于进行糖尿病的其他相关研究。

本实验链尿佐菌素注射剂量,系经查有关文献进行比较并经预试而作出的选择,有些较新的文献所报道的复制1型糖尿病大鼠链尿佐菌素的注射剂量为60mgΠkg・体重

[6,9]

一直以来,人工诱导大鼠糖尿病模型多采用注

射STZ的方式,STZ对胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用,进而引发实验性糖尿病

[4]

。然而,单纯

以这种方式所诱发的模型只符合1型糖尿病特征,与2型糖尿病的病理特征和临床特点相差较大。但有研究表明:高脂饲料喂养可以引起大鼠广泛的胰岛素抵抗,虽不致于使血糖明显的升高,却可以在同时进行小剂量注射STZ造成的胰岛β细胞轻度损伤的情况下,使多数动物产生糖耐量异常,再喂以高糖饲料引起动物肥胖

[5]

,显然对于本实验不合适,但

他们所检测到的数据可以为本实验提供参考,亦即按60mgΠkg体重剂量注射后,大鼠血糖在大幅升高的同时其血清胰岛素亦极显著的降低,造成典型的1型糖尿病;一些文献报道复制2型糖尿病大鼠链

,也可以复制出2型糖尿病的

大鼠模型,本实验即依据这种理论来设计的。

本实验给实验组大鼠注射STZ后第3天的糖耐量实验即显示出糖耐量异常,与对照组相比有统计

学差异,这表明实验组注射STZ后对胰岛β细胞的破坏作用。然而,实验显示:实验组大鼠并不是在几天内全部被复制成标准的糖尿病模型,而是通过注射STZ后的第2、第4周时的取血检测表明逐步全部成为糖尿病模型的,这与有些文献报道的1型糖尿病的复制在一次性大剂量注射STZ(60mgΠkg体重)后第3天全部大鼠均变成血糖浓度≥16.7mmolΠL的糖尿病大鼠是不一致的

[6]

尿佐菌素的注射剂量可为30mgΠkg体重

[10-11]

,然而

他们所报道的结果特征不太一致;另有文献所报道的复制2型糖尿病大鼠链尿佐菌素的注射剂量为25mgΠkg体重

[8,12]

,其结果的重复性也较好,经本实

验前的预试,证实该剂量比较合适。从后来的正式实验结果来看,完全合符2型糖尿病的建模要求,即大鼠经高糖高脂饲料饲养后,小剂量的一次性注射链尿佐菌素,可造成大鼠的糖耐量异常却仍然可保持大鼠经高糖高脂饲料饲喂以后的高胰岛素血症。在本实验研究中,实验组在未注射STZ前取血

所检测的指标值(即高糖高脂组)显示血糖与对照组

,这可能是由于一次

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中国比较医学杂志2008年1月第18卷第2期　ChinJCompMed,February2008,Vol.181No.2

1993,29:911

[5]　蔡文就,熊曼琪,朱章志,等.实验性NIDDM大鼠模型及其胰

相比没有升高,而血清胰岛素极显著的高于对照组,

[3]

这种现象与有关文献所报道的结论极为一致。而从糖尿病组大鼠的血液检测指标值来看,血糖极显著的升高,血清胰岛素虽亦极显著的高于对照组,但与高糖高脂组相比又有下降趋势,这种情形系由于注射STZ后所造成的。因为STZ通过自由基损伤胰

[13]

岛β细胞,使胰岛素合成减少。假如实验组非高糖高脂饲料喂养,同时STZ又系大剂量的注射,则胰岛素的水平会降至低于对照组,形成的是与文献所

[6]

报道那样的Ⅰ型糖尿病。所以,从这里也显示出Ⅰ、2型糖尿病动物模型复制方法学上的变化及病理生理特征的不同。

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〔修回日期〕2007211221

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