第３Ｏ卷第６期 食品与生物技术学报 ＶｏＩＩ ３Ｏ Ｎｏ．６ ２０１１年１１月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＮＯＶ． ２０ｌ１ 文章编号：１６７３—１６８９（２０１１）０６—０８７９—０５ 植物生长调节剂对内生真菌生物合成紫杉醇的影响 李娟花， 陈， 邓百万 ， 刘开辉， 解修超， 彭 浩， 张晓伟， 张曼 （陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西省食药用菌＿－５程技术研究中 心，陕西汉中７２３０００） 摘 要：研究了植物生长调节剂对Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａ）【＿２７产紫杉醇的影响，采用ＨＰＬＣ 法检测。结果表明，赤霉素（ＧＡ。）质量浓度为４ ｍｇ／Ｌ、茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）质量浓度为６０ｕｍｏ１／Ｌ、 矮壮素（ＣＣＣ）质量浓度为２５ ｍｇ／Ｌ、６一苄氨基嘌呤（６一ＢＡ）质量浓度为４ ｍｇ／Ｌ、萘乙酸（ＮＡＡ）质量 浓度为４ ｍｇ／Ｌ时该菌产紫杉醇的质量浓度分别为：６７０．４９、８３８．１１、９４２．５７、４５５．７２、４５０．４８、 ９５３．３５／ｚｇ／Ｌ。但ＧＡｓ、ＭｅＪＡ和ＣＣＣ对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７菌丝体的生长有明显的抑制作用； ６一ＢＡ和ＮＡＡ对茵丝体的生长均有促进作用。 关键词：植物生长调节剂；内生真菌；生物合成；紫杉醇 中图分类号：Ｑ ９３４ 文献标识码：Ａ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｎ Ｔａｘｏｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ａｎ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｕｓ ＬＩ Ｊｕａｎ—ｈｕａ， ＣＨＥ Ｗｅｎ—ｑｉａｎｇ，ＤＥＮＧ Ｂａｉ—ｗａｎ ，ＬＩＵ Ｋａｉ—ｈｕｉ， ＸＩＥ Ｘｉｕ—ｃｈａｏ，ＰＥＮＧ Ｈａｏ， ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ—Ｗｅｉ， ＺＨＡＮＧ Ｍａｎ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｔｅｄ Ｆｕｎｇｉ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｗａｓ ６７０．４９ ｔ￣ｇ／Ｌ，８３８．１ｌｔ￣ｇ／Ｌ，９４２．５７ｔ￣ｇ／Ｉ ，４５５．７２ ｇ／Ｌ，４５０．４８ ｔ￣ｇ／Ｌ ｗｈｅｎ ４ ｍｇ／Ｌ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ （ＧＡｓ），６０ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ（ＭｅＪＡ），２５ｍｇ／Ｉ ｃｈｌｏｒｍｅｑｕａｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＣＣ），４ ｍｇ／Ｌ ６一 ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（６－ＢＡ），ａｎｄ ４ ｍｇ／Ｌ １－ｎａｐｈｔｈｌｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＮＡＡ）ｗａｓ ｆｅｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡ３，ＭｅＪＡ，ＣＣＣ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｍｙｅｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７，ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ，ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ６－ＢＡ ａｎｄ ＮＡＡ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｍｙｅｅｌｉａ ｇｒｏｗｔｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ，ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔａｘｏｌ 红豆杉（Ｔａｘｕｓ）又名紫杉，为裸子植物，属于冰 的树皮中提取分离出来的一种结构复杂的四环二 川活动期的孑遗植物 。紫杉醇是从红豆杉植物 萜化合物。紫杉醇（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商品名Ｔａｘｏ１）最早 收稿日期：２０１０—１０—１４ 基金项目：陕西省教育厅重点科研项目（０８ＪＺ２１）；陕西省教育厅项目（０８ＪＫ２４８，０８ＪＫ２４４）。 ＊通信作者：ｇｇ］￣－（１９６３一），男，陕西眉县人，教授。主要从事微生物学方面的科研工作。Ｅｍａｉｌ：ｄｅｎｇｂｗ２００８ ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ８８０ 食品 与 生 物 技 术 学 报 第３（ｊ卷 是１９７１年，Ｗａｎｉ等 从短枝红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉ— ｉｆｏｌｉａ）的树皮中分离得到而命名紫杉醇。Ｓｃｈｉｆｆ 等＿３ 随后证实其具有独特的抗癌机制，可以将细胞 周期阻断于Ｇ。／Ｍ期，导致有丝异常或停止， 阻止癌细胞增殖 ］。但由于原料和生产技术的限 制，全球紫杉醇的产量严重不足，因此价格昂贵。 近年来，在紫杉醇研究中最重要的进展应当是 产生紫杉醇内生真菌的发现，目前用微生物发酵的 方法生产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径＿８］。 提高内生菌产紫杉醇的产量是人们关注的热 点＿９ 。有人发现将植物生长调节剂加入细胞培 养物中可显著提高细胞中紫杉醇的产量ｌ１ 引，但这 些研究主要集中在细胞培养方面 ，将植物生长 调节剂加入内生真菌细胞发酵液中研究其对紫杉 醇含量变化的影响国内尚未见报道。本研究在内 生真菌发酵指数期加入植物生长调节剂，研究其对 紫杉醇含量变化的影响，为提高紫杉醇的产量提供 一种新的方法。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 菌种红豆杉内生真菌Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一 ２７，由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。 １．１．２ 培养基 斜面培养基：马铃薯２００．０ ｇ，葡 萄糖２０．０ ｇ，ＭｇＳＯ ・７Ｈ２ Ｏ ３．０ ｇ，ＫＨ２ ＰＯ ５．０ ｇ，ＶＨ １０．０ ｍｇ，琼脂粉１２ ｇ，ｐＨ值为自然。 发酵培养基：马铃薯２００ ｇ，葡萄糖４０ ｇ，蛋白 胨５ ｇ，酵母膏０．８ ｇ，（ＮＨ ）２ ＳＯ４ ３．０ ｇ，ＫＨ２ ＰＯ ２．０ ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＶＢ１ １０．０ ｍｇ，水１ ０００ ｍＩ ，ｐＨ值为自然。 １．１．３设备高效液相色谱仪：ｅ２６９８美国ｗａｔｅｒｓ 公司生产；紫外检测器：２４８９美国ｗａｔｅｒｓ公司生 产；旋转蒸发仪：ＲＳ２０３：上海申生科技有限公司 产品。 １．２方法 １．２．１ 生长曲线建立 挑取０．５ ｅｍ。活化菌种接 到液体培养基中，２８℃静置培养２４ ｈ，转入２８℃， １６０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，从第４ ｄ开始，每隔１天取１ Ｉ 发酵液提取并测定菌丝体生长量和紫杉醇量，绘制 其生长曲线。 １．２．２液体发酵 挑取０．５ ｅｍ 活化菌种接到液 体培养基中，２８℃静置培养２４ ｈ，转入２８℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，待菌丝体生长至指数期时向发酵 液中加入不同浓度的植物生长调节剂进行培养。 １．２．３分离提取 用布什漏斗抽滤过滤发酵液， 菌丝体烘干（５０℃），菌液称量体积。取菌液于４５ ℃旋转蒸发至１／１０体积后，加入等体积的乙酸乙 酯进行萃取，收集乙酸乙酯相；菌丝体烘 Ｆ后，放入 研钵研磨至菌丝体完全破碎，然后加入一定量的乙 酸乙酯超声波提取３次，每次３０ ｍｉｎ，收集乙酸乙 酯相。合并乙酸乙酯相，并于４５℃旋转蒸发至十， 用少量甲醇溶解后定容至２５ ｍＩ ，置４ ｏ（１冰箱保存， 备用。 １．２．４ 分析检测 标品用甲醇定溶，配置成 ０．０１～０．０８ ｍｇ／ｍＩ 的梯度，绘制标准曲线。色谱 条件：水一甲醇一乙腈（３３：３５：３２）为流动相，检测波 长２２８ ｎｍ，流速１．０／，Ｉ ／ｒａｉｎ，进样量２０ Ｉ ，柱温： 室温，色谱柱：ｃ１８（４．６ ｍｍ×ｌ ５０ ｍｍ）。精密称 取紫杉醇标准品约２ ｍｇ，甲醇定容至１０ ｍＩ ，得母 液浓度为０．２ ｍｇ／ｍＩ ，将母液依次稀释成质量浓度 梯度为０．０８、０．０４、０．０２、０．０１ ｍｇ／ｍＩ ，取２Ｏ ｌ 进 样（Ｎ一４），得回归方程为 一６．０８７ ８＋３ ５８９．３９１ ３ｘ，ｒ一０．９９９ ２２２建立标准曲线，采用外标法测定 发酵产物抽提物中紫杉醇产量。 ２结果与分析 ２．１ 生长曲线的建立 对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７进行液体培养．测定 不同发酵时期的菌丝生长量及发酵液中紫杉醇产 量，建立生长曲线，结果如图１所示。 ４００ ３５０ ｂ０ ３００— ２５０ 蚓 ２００ 镟 １ ５０ １００ ５０ Ｏ 图１ Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７代谢产紫杉醇及菌丝生长 规律 Ｆｉｇ．１ Ｌａｗ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ．ａｎｉｓｏｎｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７ 图ｌ表明，内生真菌Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７液 体发酵Ｏ～６ ｄ处于延滞期，菌丝生长量和发酵液中 紫杉醇的产量变化不明显；发酵从第７ ｄ开始进入 指数期，此时菌丝生长量和发酵液中紫杉醇的产量 增加明显，发酵至第１０ ｄ，菌丝生长量和发酵液中 紫杉醇的产量基本稳定在３１４．００ ｐ－ｇ／Ｉ ，变化不明 显，发酵至第１４ ｄ时，Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７菌丝生 长量和发酵液中紫杉醇的产量达到各自的峰值，分 别为３５．２ ｇ／Ｉ 和３１４．２９ ｔ，ｇ／Ｉ ；第１４ ｄ以后，菌丝 第６期 李娟花等：植物生长调节剂对内生真菌生物合成紫杉醇的影响８８１ 开始分泌色素，进而菌丝体开始自溶，菌丝生长量和 发酵液中紫杉醇的产量开始下降，发酵进入衰亡期。 ２．２不同植物生长调节剂对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７ 生物合成紫杉醇的影响 ２．２．１ 赤霉素（ＧＡ３）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生 物合成紫杉醇的影响 内生真菌Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７液体发酵至第７ｄ时，加入不同浓度的赤霉 素（ＧＡ。），添加范围是０～５ ｍｇ／Ｌ，研究其对 Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ－２７生物合成紫杉醇的影响。结 果见图２所示。 ８００ ７００ ３５０ ６００ 谪５００ ３４０窖 ３３０ ４００ 让３００ ３２０ ： ３１０ ３００ ０ ２９０ 知鲫 Ｏ Ｏ ０ Ｏ Ｏ Ｏ ０ ０ Ｏ Ｏ ∞如∞如加 图２赤霉素（Ｇ ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物合成 紫杉醇影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＧＡ３ ｏｎ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ． ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７ 图２表明，在使用赤霉素（ＧＡ。）诱导 Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ－２７生物合成紫杉醇时，赤霉素 （ＧＡ。）的浓度在０～４．０ ｍｇ／Ｌ范围内，紫杉醇产量 随着赤霉素（ＧＡ。）质量浓度的增大而增加，发酵液 中赤霉素（ＧＡ。）浓度到４．０ ｍｇ／Ｌ时，紫杉醇的产 量达到峰值即６７０．４９ ｔ￣ｇ／Ｌ，紫杉醇的产量在不加 诱导剂的基础上增加了１．１倍，赤霉素（ＧＡ。）对紫 杉醇的生物合成有明显促进作用。当发酵液中赤 加 如 加：２ 如Ｏ 霉素（ＧＡ。）浓度继续增大时，紫杉醇的产量反而减 小。在０～５ ｍｇ／Ｌ浓度范围内，赤霉素（ＧＡ。）对菌 丝体生长有明显的抑制作用。 ２．２．２茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－ ２７生物合成紫杉醇的影响 内生真菌 Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７液体发酵至第７ｄ时，加入不 同浓度的茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ），添加范围是０～１００ ｍｏｌ／Ｌ，研究其对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ一２７合成紫杉 醇和菌丝体生长的影响。结果图３所示。 图３表明，在使用茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）诱导 Ｍ＿ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ一２７生物合成紫杉醇时，紫杉醇的 产量随着茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）加入浓度的增大而增 加，茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）质量浓度达到６０ ｍｇ／Ｌ时， 发酵液中紫杉醇的产量达到峰值即８３８．１１ ｔ￣ｇ／Ｌ， 发酵液中紫杉醇的产量与不加任何诱导物发酵相 比紫杉醇的产量增加了１．６７倍。结果表明，在生 ∞ ２ 豳Ｉ 函 卡Ｌ 钴 咖１ 酾 图３茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物 合成紫杉醇影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｊａｏｎ ｔａｘｏｌ ｂｉｓｏｙｓｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ． ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７ 物合成紫杉醇过程中，茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）添加浓 度在Ｏ～１００ ｐｔｍｏｌ／Ｌ的范围时，茉莉酸甲酯（Ｍｅ— ＪＡ）对紫杉醇的生物合成有显著的促进作用。在０ ～１００肚ｍｏｌ／Ｉ 浓度范围内，茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）的 加入抑制菌丝体生长。 ２．２．３ 矮壮素（ＣＣＣ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生 物合成紫杉醇的影响 内生真菌Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ－２７液体发酵至７ ｄ时，加入不同浓度的矮壮素 （ＣＣＣ），添加范围是０～１０ ｍｇ／Ｌ，研究对其生物合 成紫杉醇的影响。结果如图４所示。 ２ 咖｛ ∞如∞如∞如∞０枷姗ｍ 瑚 ｍ如ｏ 图４矮壮素（ＣＣＣ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物合成 紫杉醇影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＣＣＣ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ．ａｎｉｓｏ ｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７ 图４表明，在发酵液中加入０～１０．０ ｍｇ／Ｌ质 量浓度的矮壮素（ＣＣＣ）时，发酵液中紫杉醇的产量 随着矮壮素质量浓度的增大而显著增加。当发酵 液中矮壮素（ＣＣＣ）浓度在１０．０～２５．０ ｍｇ／Ｌ范围 时，发酵液中紫杉醇产量虽然随着矮壮素（ＣＣＣ）的 质量浓度增大而增加，但增加幅度减缓，当矮壮素 （ＣＣＣ）质量浓度达到２５．０ ｍｇ／Ｌ时，发酵液中紫杉 醇产量达到峰值即最大值９４２．５８ ｇ／Ｌ。相比本底 水平发酵液中紫杉醇的产量增加了２倍，当矮壮素 （ＣＣＣ）质量浓度继续增大，紫杉醇的产量随之减小。 结果表明，在生物合成紫杉醇过程中，矮壮素（ＣＣＣ） ８８２ 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第３Ｏ卷 添加质量浓度在０～３０ ｍｇ／Ｉ 的范围时，矮壮素 （ＣＣＣ）对紫杉醇的生物合成有显著的促进作用。 在０～３０ ｍｇ／Ｌ质量浓度范围内，矮壮素（ＣＣＣ）的 加入抑制菌丝体生长。 ２．２．４ ６苄氨基嘌呤（６一ＢＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７生物合成紫杉醇的影响 内生真菌 Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ一２７液体发酵至７ ｄ时，加人不同 浓度的６一苄氨基嘌呤（６－ＢＡ），研究其对生物合成紫 杉醇影响。结果如图５所示。 ２ 面 图５ ６－苄氨基嘌呤（６－ＢＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７生 物合成紫杉醇影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ６－ＢＡ ｏｎ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ． ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７ 图５表明，发酵液中紫杉醇的产量随着６一苄氨 基嘌呤（６－ＢＡ）质量浓度的增大而增加。当６一苄氨 基嘌呤（６－ＢＡ）的质量浓度达到４．０ ｍｇ／Ｉ 时，发酵 液中紫杉醇产量达到峰值即４５５．７２ ｇ／Ｉ 。当６一苄 氨基嘌呤（６一ＢＡ）质量浓度继续增大，紫杉醇的产量 随之减小。结果表明，发酵液中６一苄氨基嘌呤（６一 ＢＡ）浓度０～５．０ ｍｇ／Ｌ浓度范围内，６～苄氨基嘌呤 （６－ＢＡ）对紫杉醇的生物合成有促进作用，但影响不 明显。在０～５．０ ｍｇ／Ｌ浓度范围内，６一苄氨基嘌呤 （６－ＢＡ）的加入对菌丝体生长有促进。 萘乙酸（ＮＡＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７生物合 成紫杉醇的影响内生真菌Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ｔａｘ一２７液 体发酵至７ ｄ时，加入不同质量浓度的萘乙酸 （ＮＡＡ），添加范围是０～５ ｍｇ／Ｉ ，研究其对生物合 成紫杉醇的影响。结果如图６所示。 ２．６ 萘乙酸（ＮＡＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物 合成紫杉醇影响 图６表明，发酵液中紫杉醇的产量随着萘乙酸 （ＮＡＡ）质量浓度的增大而增加，当萘乙酸（ＮＡＡ） 加入量达到４．０ ｍｇ／Ｉ 时，发酵液中紫杉醇的产量 达到峰值即４５０．４８肚ｇ／Ｉ 。当萘乙酸（ＮＡＡ）浓度 继续增大，发酵液中紫杉醇的产量随之减小。因 此，发酵液中萘乙酸（ＮＡＡ）的最大加入量为４．０ ｍｇ／Ｉ 。结果表明，在萘乙酸（ＮＡＡ）质量浓度０～ ５．０ ｍｇ／Ｉ 范围内，萘乙酸（ＮＡＡ）对紫杉醇的生物 合成有促进作用，但影响不明显。在０～５．０ ｒａｇ／Ｉ 质量浓度范围内，萘乙酸（ＮＡＡ）加入对菌丝体的生 长有促进作用。 一 ２ ＼ 删 图６萘乙酸（ＮＡＡ）对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物合成 紫杉醇影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＡＡ ｏｎ ｔａｘｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ． ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７ ３ 结 语 植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微 生物，用微生物发酵方法生产紫杉醇，是解决药源 问题的有效途径，且提高内生真菌产紫杉醇的量是 目前研究的热点。 本研究通过在红豆杉内生真菌液体发酵过程 中添加植物生长调节剂，研究对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ ２７生物合成的紫杉醇影响。表明适当浓度的赤霉 素（ＧＡ。）、茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）和矮壮素（ＣＣＣ）对 Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ－２７生物合成紫杉醇起到明显促 进作用，对菌丝体的生长有抑制作用；６－苄氨基嘌呤 （６－ＢＡ）和萘乙酸（ＮＡＡ）对Ｍ＿ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ ２７ 生物合成紫杉醇也有一定的促进作用，但作用没有 赤霉素（ＧＡ。）、茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）和矮壮素（ＣＣＣ） 对Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ Ｔａｘ一２７生物合成紫杉醇的影响显 著。汪爱顺 等研究将诱导子、抑制剂加入红豆杉 植物细胞系中对紫杉醇生物合成的影响，其结果表 明，适当浓度的诱导子、抑制剂对紫杉醇的生物合 成起到促进作用，与本实验的研究结果相同，但两 者的作用机制和途径是否一致，有待进一步研究。 第６期 李娟花等：植物生长调节剂对内生真菌生物合成紫杉醇的影响 ８８３ 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［１］中国林业科学院，等．中国植物学［Ｍ］．第七卷．北京：科学出版社，１９７８．４３８． ［２］ｗａｉｎ Ｍ Ｃ，Ｔａｙ Ｈ Ｌ，Ｍｏｎｒｏｃ Ｆ，ｅｔ．Ｐａｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔ ＶＩ：Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔａｘｏｌ，ａ ｎｏｖｅｒ ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ［Ｊ］．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９７１，９３：２３２５—２３２７． ［３］Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ Ｂ，Ｆａｎｔ Ｊ，Ｈｏｒｗｉｔｚ Ｓ Ｂ．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７９，２７７：６６５—６６７． ［４］Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｓ Ｂ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，１９９２，１３：１３４—１３６． ［５］Ｓｔｉｅｒｌｅ Ａ，Ｓｔｉｅｒｌｅ Ｄ，Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｇ Ａ．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔａｘｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｃｉｆｉｃ ｙｅｗ．Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ．［Ｊ］．Ｎａｔ Ｐｒｏｄ，１９９５，５８：１３１５． ［６］Ｐａｔｅｌ ＲＮ．ｔｏｕｒ Ｄｅ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ：ｂｉｏｅｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｕｒａ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，９８：３６１—３９５． ［７］Ｓｔｉｅｒｌｅ Ａ，Ｓｔｒｏｈｅｉ Ｇ，Ｓｔｉｅｒｌｅ Ｄ．Ｔａｘｏｌ ａｎｄ Ｔａｘａｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｎａｌ，ａｎ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ Ｐａ— ｃｉｆｉｃ Ｙｅｗ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６０：２１４—２１６． ［８］何颖，谈锋，谢建平．红豆杉内生真菌产紫杉醇研究进展［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００６，１８：５１９—５２３，５１３． ＨＥ Ｙｉｎｇ，ＴＡＮ Ｆｅｎｇ，ＸＩＥ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ｆｒｏｍ ｔａｘｕｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｔａｘｏｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅ— ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，１８：５１９—５２３，５１３．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［９］兰文智，余龙江，吴元喜．水杨酸对真菌诱导子诱导红豆杉悬浮细胞膜脂过氧化和紫杉醇生物合成的影响［Ｊ］．西北植物 学报，２００２，２２（１）：７８—８３． ＬＡＮ Ｗｅｎ—ｚｈｉ，ＹＵ Ｌｏｎｇ—ｊ ｉａｎｇ，ＷＵ Ｙｕａｎ－ｘｉ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒ ａｎｄ ｔａｘｏｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｏｔ Ｂｏｒｅａｌ，２００２，２２（１）：７８—８３．（ｉｎ Ｃｈｉ— ｎｅｓｅ） ［１０３陈永勤，吴蕴祺，胡秋，等．苯丙氨酸、蔗糖和甘露醇对杂种红豆杉细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭Ｉ１Ｉ和１Ｏ一去乙酰基巴 卡亭ＩＩＩ的影响［Ｊ］．药学学报，１９９８，３３（２）：１３２—１３７． ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ—ｑｉｎ，ＷＵ Ｙｕｎ－ｑｉ，ＨＵ Ｑｉｕ ｅｔ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｘｏｌ，ｂａｃｃａｔｉｎ ｍ ａｎｄ １０一ｄｅａｃｅｔｙｌ ｂａｃｃａｔｉｎⅢｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔａｘｕｓ ｍａｄｉａ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，１９９８， ３３（２）：１３２—１３７．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１１］赵春芳，余龙江，刘智，等．茉莉酸甲酯诱导下红豆杉细胞产生紫杉烷类物质群代谢轮廓分析［Ｊ］．云南植物研究，２００５，２７ （５）：５５７—５６４． ＺＨＡＯ Ｃｈｕｎ－ｆａｎｇ，ＹＵ Ｌｏｎｇ—ｊ ｉａｎｇ，Ｌｉｕ Ｚｈｉ ｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔａｘａｎｅｓ ｉｎ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｅ— ｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔｙｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｙｕｎｎａｎｉｃａ，２００５，２７（５）：５５７—５６４．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１２］汪爱顺．前体、诱导子及抑制剂对紫杉烷生物合成的促进作用研究口］．生命科学研究，２００３，７（１）：４８～５２． ＷＡＮＧ Ａｉ—ｓｈｕｎ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｘａｎｅ ｈｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｂｙ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，７（１）：４８—５２．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１３］郭志刚，冯莹，刘瑞芝．生长调节物质对紫杉醇和紫杉烷类化合物合成的作用［Ｊ］．天然产物研究与开发，１９９９，１２ （３）：２２—２６． ＧＵＯ Ｚｈｉ—ｇａｎｇ，ＦＥＮＧ Ｙｉｎｇ，ＬＩＵ Ｒｕｉ—ｚｈｉ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ ａｎｄ ｔａｘａｎｅｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９９，１２（３）：２２—２６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１４］苏湘鄂，梅兴国，龚伟，等．茉莉酸甲醋与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞中紫杉醇含量的影响［Ｊ］．生物技术， ２００１，１１（１）：１０—１３． ＳＵ Ｘｉａｎｇ—ｅ，ＭＥＩ Ｘｉｎｇ—ｇｕｏ，Ｇｏｎｇ Ｗｅｉ ｅｔ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｆｕｎｇａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１１（１）：１０—１３．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１５］陈菁，柯铁，常俊丽，等．脱氧胆酸钠体系分离紫杉烷类化合物［Ｊ］．生物技术，２００１，１１（３）：１８～２０． ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇ，ＫＥ Ｔｉｅ，ＣＨＡＮＧ Ｊｕｎ—ｌｉ ｅｔ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｘａｎｅｓ ｂｙ ＳＤＣ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００１，ｌ１（３）：１８—２０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１６］苏湘鄂，梅兴国，余依亭．稀土元素对红豆杉细胞悬浮培养及紫杉醇合成的影响［Ｊ］．生物技术．２００１，ｌ１（４）：２８—３１． ＳＵ Ｘｉａｎｇ—ｅ。ＭＥＩ Ｘｉｎｇ—ｇｕｏ，ＹＵ Ｙｉ—ｔｉｎｇ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒａｒｅ ｅａｒｔｈ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｎ Ｔａｘｕｓ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔａｘｏｌ ｓｙｎｔｈｅ— ｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１１（４）：２８—３１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１７］梅兴国，田朝霞，王传贵，等．稀土化合物对悬浮培养红豆杉细胞紫杉醇生产和释放的影响［Ｊ］．天然产物研究与开发， ２０００，１２（５）：３８—４１． ＭＥＩ Ｘｉｎｇ—ｇｕｏ，ＴＩＡＮ Ｚｈａｏ—ｘｉａ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕａｎ—ｇｕｉ ｅｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｂｙ ｓｏｍｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ｔａｘｕｓ ｉｎ ｒｅ— ｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｄｕｃｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，１２（５）：３８—４１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１８］郭志刚，冯莹，刘瑞芝．无机元素对紫杉醇和紫杉烷类化合物生物合成的作用［Ｊ］．天然产物研究与开发．１９９９，１２ （５）：２３—２７． ＧＵＯ Ｚｈｉ—ｇａｎｇ，ＦＥＮＧ Ｙｉｎｇ，ＬＩＵ Ｒｕｉ—ｚｈｉ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｘｏｌ ａｎｄ ｔａｘａｎｅｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｎｅｒａｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ。１９９９，１２（５）：２３—２７．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１９］黄新，邱德有，黄璐琦．茉莉酸甲酯对中国红豆杉细胞基因表达的ｍＲＮＡ差异显示研究［Ｊ］．分子植物育种，２００６，４（５）： ６２７～６３２． ＨＵＡＮＧ Ｘｉｎ，ＱＩＵ Ｄｅ—ｙｏｕ，ＨＵＡＮＧ Ｉ ｕ—ｑｉ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｉｎ Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，４（５）：６２７～６３２．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
