中华哮喘杂志（电子版） ２０１１年８月第５卷第４期Ｃｈｉｎ』 垦 ！ｃｔ！ ｎｉ！Ｅｄ ！垒 ， ． ！ ． 。５‘ ．论著． 支气管哮喘急性发作期激活转录因子一３的 表达及作用 彭文芳 戴爱国 朱黎明 【摘要】 目的 探讨支气管哮喘（简称哮喘）急性发作期激活转录因子一３（ＡＴＦ３）的表达及作用。方 法３Ｏ只健康雄性豚鼠，按随机数字表法分为对照组（Ａ组）、哮喘组（Ｂ组）及地塞米松治疗组（Ｃ组），每 组１Ｏ只。卵清蛋白致敏法复制哮喘模型。收集支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）并进行细胞总数及分类计 数；观察豚鼠肺组织病理学改变；检测豚鼠肺组织及ＢＡＬＦ中ＲＯＳ含量；采用免疫组织化学和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法测定豚鼠肺组织中ＡＴＦ３蛋白的表达和量的变化；原位杂交、ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ的表 达变化；免疫细胞化学检测豚鼠ＢＡＬＦ细胞中ＡＴＦ３蛋白的表达。结果 ①哮喘组豚鼠ＢＡＬＦ中炎细 胞总数、嗜酸粒细胞百分比（Ｅ０Ｓ％）显著高于对照组（Ｐ＜Ｏ．０１），哮喘组豚鼠肺组织可见大量炎症细胞 浸润及明显气道重塑改变，且哮喘组ＲＯＳ含量显著升高，而地塞米松治疗组上述变化明显减低（Ｐ值 均＜Ｏ．０１）；②ＡＴＦ３蛋白及ｍＲＮＡ表达哮喘组明显高于对照组（Ｐ值均＜０．０１）；③ＡＴＦ３蛋白及 ｍＲＮＡ的表达变化与ＲＯＳ含量及ＢＡＬＦ炎细胞总数、ＥＯＳ 变化均呈正相关。结论 哮喘急性发作期 豚鼠肺组织及ＢＡＬＦ细胞中ＡＴＦ３的表达升高，可能与气道炎症反应和氧化应激有关；给予地塞米松治 疗后ＡＴＦ３表达下降，可能在哮喘的防治中起重要作用。 【关键词】支气管哮喘；激活转录因子３；氧化应激 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡＴＦ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ ＰＥＮＧ’ —ｆａｎｇ，ＤＡＩ Ａｉ—ｇｕｏ， Ｚ ＨＵ Ｌｉ—ｍｉｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ。Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ ＨＯＳｐｉｔａＺ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１ ００１ ６，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＤＡＩ Ａｉ—ｇｕｏ，Ｅｍａｉｌ：ｄａｉａｉｇｕｏ２００３＠】６３．ｃｏｒｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡＴＦ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ（ａｓｔｈｍａ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｉｒｔｙ ｈｅａｌｔｈｙ ｍａｌｅ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ Ａ），ａｓｔｈｍａｔｉｃ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ Ｂ），Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐ Ｃ），１ ０ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ａｓｔｈｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ＢＡＬＦ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｅｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＢＡＬＦ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ１０ｇｙ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｒ０Ｓ）ｉｎ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ，ＢＡＬＦ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ．Ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ，ｔｈｅ ＡＴＦ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，ａｎｄ ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴＦ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＢＡＬＦ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ①Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＥＯＳ ｉｎ ＢＡＬＦ ｏｆ ａｓｔｈｍａ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｂｒｏｎｅｈｉｏｌｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｅｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ｇｒｏｕｐ， ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｒ ｏｆ ＲＯＳ ａｌｓｏ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ＢＡＬＦ ｏｆ ａｓｔｈｍａ ｇｒｏｕｐ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ．②Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｕＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＡＴＦ３ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）． ③Ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ Ｒ０Ｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ，ＥＯＳ ｉｎ ＢＡＬＦ． 基金项目：湖南省卫生厅科研计划课题项目（Ｂ２０１０—０８９，Ｂ２００７１６９）；湖南省科技计划项目（２０１０ＦＪ６１１３） 湖南省自然科学基金（０９ＪＪ５０２１） 作者单位：４１００１６长沙，湖南省老年医院老年医学研究所呼吸疾病研究室 通信作者：戴爱国，Ｅｍａｉｌ：ｄａｉａｉｇｕｏ２００３＠１６３．ｃｏｍ 主 盘查 皇 ＿２Ｏｌｌ笙８Ｂ第５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ａｓｔｈｍａ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），ＡｕｇｕＳｔ ２０１１，Ｖ０ｉ．５，Ｎｏ ４ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴＦ３ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ＢＡＬＦ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｓｔｈｍａ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ． Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴＦ３ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｍａｙｂｅ ＡＴＦ３ ｐｌａｙｅｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｒｅ ｏｆ ａｓｔｈｍａ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ；Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３；Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ 支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道慢性炎症性 疾病。过强的炎症反应会导致过多的活性氧的形 成，氧化／抗氧化失衡，引起气道氧化损伤、组织破坏 和气道高反应的进一步加重口］。前期大量研究表 明［２ ］哮喘急性发作期豚鼠肺组织中抗氧化基因 （Ｎｒｆ２、７－ＧＣＳ）表达下降，总的抗氧化能力降低 ］， 氧化应激在哮喘的发病机制中起关键作用。激活转 录因子一３ （Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ３， ＡＴＦ３）－３ 属于具有碱性亮氨酸拉链结构（ｂａｓｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ，ｂＺＩＰ）的ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白 质（ＣＡＭＰ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＣＲＥＢ）家族中的转录因子。ＡＴＦ３在大部分正常静 息细胞中呈稳态表达，但可被体内外一系列损伤性 应激信号（如氧化应激）快速诱导表达 Ｊ。ＡＴＦ３是 细胞应激反应中最早表达的转录因子之一，具有广 泛的转录调节作用。本实验通过检测豚鼠肺组织和 支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）炎细胞中ＡＴＦ３表达变 化，探讨其在哮喘发病机制及防治中的作用。 材料和方法 一、材料 卵清蛋白购自Ｓｉｇｍａ；ＡＴＦ３兔多克隆抗体购 自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１３－肌动蛋白（Ｂｅｔａ—ａｃｔｉｎ）抗体购自武 汉博士德生物工程有限公司；ＳＰ免疫组织化学试剂 盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ＡＴＦ３原 位杂交试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒购自武汉博士德生 物工程有限公司；ＲＯＳ检测试剂盒购自南京建成生 物工程研究所；总蛋白提取试剂盒、ＢＣＡ法蛋白定 量检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所； ＡＴＦ３、｛３一ａｃｔｉｎ上、下游引物由上海捷瑞生物工程有 限公司引物合成部设计合成，总ＲＮＡ抽提试剂 （ＴＲＩＺＯＬ）购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＲＴ试剂盒（ＭＢＩ Ｋ１６２２一ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）购自ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ购自索莱宝公司。 二、方法 １．豚鼠哮喘模型的建立及分组：３０只健康雄性 清洁级豚鼠（湖南中医药大学实验动物中心供证书 号：０４２，发证单位：湖南省实验动物管理委员会），ｌＯ 周龄左右，体质量２００～２５０ ｇ，按随机数字表法分为 对照组（Ａ组）、哮喘组（Ｂ组）及地塞米松治疗组（Ｃ 组），每组１０只。参照文献［２］采用卵清蛋白致敏激 发法复制哮喘豚鼠模型。 ２．ＢＡＬＦ细胞分类及计数和肺组织病理观察： 末次雾化吸入结束后立即以２ 戊巴比妥钠 （２ ｍｌ／ｋｇ）腹腔注射麻醉豚鼠，暴露气管、主支气管， 在气管分又处夹闭左主支气管，于气管正中作一小 切口将静脉输液管改良的肺泡灌洗管插入右主支气 管，用４ ｍｌ生理盐水灌洗，每次气道内反复注入、回 抽３次，回收率＞８０ 以上即为ＢＡＬＦ，ＥＰ管分装， 液氮罐转移至一８０℃保存备用。解冻后离心管中 以１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清液用于检测ＲｏＳ 含量，沉淀用ＰＢＳ缓冲液重悬，取２０ Ｉ用以细胞计 数，细胞涂片，苏木精～伊红染色至少计数２００个，观 察细胞分类情况。 约１０ ｒａｉｎ内搜集好ＢＡＬＦ后，放血处死豚鼠， 立即切除右肺，液氮罐转移至一８ｏ℃冰箱保存用于 行逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析。同时向未灌洗的左肺灌注４ 多聚甲醛（含 １‰ＤＥＰＣ水）１～２ ｍｌ，结扎取下置于４ 多聚甲醛 中固定，脱水，石蜡包埋，切片，厚度４ Ｆｍ，行ＨＥ染 色及免疫组织化学、原位杂交实验，光镜下观察。 ３．活性氧含量测定：参照文献［７］方法取肺组织 匀浆、ＢＡＬＦ，离心取上清液。按照ＲＯＳ测定试剂 盒（南京建成生物工程研究所提供）说明书操作。本 试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法 （Ｅｌ ＩＳＡ），４５０ ｎｍ波长下测定ＯＤ值，根据标准品 和样品的ＯＤ值，计算样本中ＲＯＳ含量。单位采用 Ｕ／ｍ！。 ４．免疫组织化学检测肺组织ＡＴＦ３蛋白表达： 操作步骤按ＳＰ染色试剂盒说明书操作，一抗ＡＴＦ３ 用ＰＢＳ稀释（比例为１：１００），ＤＡＢ显色，苏木精复 染，镜下观察，阳性结果显棕黄色。用显微显影系统 （日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）采集图像，每只豚鼠选３张结 构完整的切片，每张切片以单盲法随机选５支管径 １ＯＯ～２００址ｍ的细支气管，以ＪＤ系列病理图文形态 分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）检测并计 算阳性信号平均吸光度（Ａ）值作为每只动物ＡＴＦ３ 中华哮喘杂志（电子版） ２０１１年８月第５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ａｓｔｈｍａ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ａｕｇｕｓｔ １１， ０１． ！ ． 蛋白表达相对强度。 ＢＡＬＦ细胞涂片，４ 多聚甲醛固定３０ ｍｉｎ，浸泡 ５．原位杂交检测肺组织ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ表达：地 （３０％过氧化氢１份与纯甲醇５ｏ份的）混合液中，室 高辛标记的多相寡核苷酸探针。ｍＲＮＡ序列为： 温３０ ｍｉｎ，蒸馏水洗３次；滴加５ ＢＳＡ液，室温封 ＡＴＦ３：①５，＿ＣＡＧＡＡ ＣＡＡＧＣ ＡＣＣＴＣ ＴＧＣＣＡ 闭２０ ｍｉｎ后甩去多余液体，不洗；余同上述免疫组 ＣＣＧＧＡ ＴＧＴＣＣ ＴＣＴＧＣ一３，⑦５ 一ＴＡＣＡＴ ＧＣＴＣＡ 织化学法操作步骤。用显微显影系统（日本 ＡＣＣＴＴ ＣＡＴＣＧ ＧＣＣＣＡ ＣＧＴＧＴ ＡＴＴＧＴ一３ ，③ Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）采集图像，高倍镜（×４００）下选择细 ５ ～ＴＴＴＡＴ ＣＣＡＡＣ ＡＧＡＴＡ ＡＡＡＧＡ ＡＧＧＡＡ 胞分布均匀部位照相，测量并计算阳性信号Ａ值。 ＣＡＴＴＧ ＣＡＧＡＧ一３ ，具体步骤按照原位杂交检测 三、统计学处理 试剂盒说明书操作，ＤＡＢ显色，苏木精复染。检测 全部数据用ＳＰＳＳ １３．０软件进行统计分析，计 方法同免疫组织化学。 量资料用 ±Ｓ表示。计量资料行方差齐性检验 ６．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测肺组织中ＡＴＦ３蛋白的含 后，多组样本比较采用单因素方差分析，ＬｓＤ法行 量：豚鼠右肺组织匀浆离心取上清液即为肺组织总 两两比较；相关性分析采用直线相关法。Ｐ＜０．０５ 蛋白溶液，采用ＢＣＡ法进行蛋白定量，１０ ＳＤＳ－聚 为差异有统计学意义。 丙烯酰胺凝胶恒压电泳，电压积层胶８０ Ｖ，分离胶 １２０ Ｖ。用２８０ ｍＡ恒流电转移５０ ｍｉｎ。一抗 、 结 果 （ＡＴＦ３）稀释倍数１：５００，辣根酶标记羊抗兔二抗 一、各组豚鼠肺组织病理学改变ＨＥ染色显示 稀释倍数１：５ ０００。漂洗后增强化学发光法发光， Ｂ组细支气管管腔狭窄，腔内有大量脱落的上 Ｘ线胶片显影，图像分析系统（上海Ｔａｎｏｎ 皮细胞，黏膜皱折增多，上皮水肿，杯状细胞显著增 Ｇｉｓ２２０１０）对扩增产物条带吸光度半定量，计算待测 多，腺体增生肥大，基底膜、平滑肌明显增厚，损伤甚 条带的吸光度与内参照Ｂ肌动蛋白（ｐ—ａｃｔｉｎ）的吸光 至断裂，细支气管周围和黏膜层及肺泡壁大量炎性 度比值。 细胞浸润，以中性粒细胞（ＮＥＵ）、嗜酸粒细胞 ７．ＲＴ—ＰＣＲ检测肺组织ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ表达量： （ＥＯＳ）和淋巴细胞多见。符合哮喘病理特点。ｃ组 取右肺组织约１００ ｍｇ，用ＴＲＩＺＯＬ试剂提取总 支气管黏膜仍有比较明显的水肿，但管周炎细胞浸 ＲＮＡ，检测其浓度及质量，按ＲＴ试剂盒说明书逆 润较Ｂ组豚鼠明显减轻，腔内有少量的上皮细胞和 转录合成ｃＤＮＡ。扩增引物由上海捷瑞生物工程有 炎性细胞。Ａ组豚鼠肺组织结构完整，细支气管形 限公司引物合成部设计合成。ＡＴＦ３ ｓｅｎｓｅ： 态规则，黏膜上皮完整，基底层和平滑肌完整，未出 ＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧ， ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： 现增殖，支气管腔内分泌物少，肺泡形态正常，支气 ＴＴＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣ，扩增长度：１９３ ｂｐ， 管、肺泡壁及血管周围炎症细胞浸润少见。实验中 扩增范围：３５１－５４３；退火温度：５５℃。Ｊ３一ａｃｔｉｎ Ｂ组一只豚鼠于第１天雾化时死亡，死前明显发绀 ｓｅｎｓｅ：ＡＣＧＧＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＣ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： 和喘息，死因考虑呼吸衰竭。 ＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＣ，扩增长度：３０３ ｂｐ， 二、豚鼠ＢＡＬＦ中炎细胞总数和分类计数 扩增范围：８１２—１１１４；退火温度：５５℃。ＰＣＲ反应条 结果示Ｂ组ＢＡＬＦ中炎细胞总数（×１０ Ｌ ）、 件：９４℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性３０ Ｓ，退火３０ Ｓ， 百分比（ＥＯＳ ）显著高于Ａ组，ｃ组细胞总数、 ７２℃延伸３Ｏ Ｓ，反应２８个循环，最后７２℃延伸 ＥＯＳ 与Ｂ组比明显降低，各组比较差异有统计学 ５ ｍｉｎ，各样品同时扩增。ＲＴ－ＰＣＲ产物经２ 的琼 意义（Ｐ值均＜Ｏ．０１）（表１）。 脂糖凝胶（含０．５ ｕｇ／ｍｌ溴化乙啶）电泳，并在凝胶 ‘三、豚鼠肺组织、ＢＡＬＦ中ＲＯＳ含量变化 成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增 豚鼠肺组织匀浆蛋白中ＲＯＳ含量，Ｂ组 带吸光度值，方法同Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ。 （４５０．２７±２．４３）Ｕ／ｍｌ明显高于Ａ组（１９３．８５± ８．免疫细胞化学法检测ＡＴＦ３蛋白表达： ３．６１）Ｕ／ｍ！和Ｃ组（２６９．１５±３．９２）Ｕ／ｍｌ，三组间 表１各组豚鼠ＢＡＬＦ中炎细胞总数和分类计数（ ±ｓ） 注：ＮＥＵ：中性粒细胞；ＬＹＭ：淋巴细胞；ＭＯ：巨噬细胞；与对照组比较，ａＰ＜０．０５， 尸＜０．０１；与哮喘组比较，ｃＰ＜Ｏ．０１ ・８・ 中华哮喘杂志（电子版）２０１１年８月第５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ａｓｔｈｍａ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｕｇｕｓｔ ２０１１，Ｖｏ１．５，Ｎｏ．４ 差异有统计学意义（Ｐ值均ｄ０．０１）。ＢＡＬＦ中Ｂ组 ＲＯＳ含量（１ ２０８．７３±４９．４３）Ｕ／ｍｌ明显高于Ａ组 （７１４．２９±２２．０５）Ｕ／ｍｌ，Ｃ组（１ ０６３．８４±３８．６８） 症为特点的，大量ＥＯＳ、ＮＥＵ和淋巴细胞浸润支气 管腔。ＥＯＳ是哮喘过敏性气道炎症的标志物，在其 发病机制中起重要作用。本研究发现Ｂ组ＢＡＬＦ 中炎细胞总数显著高于Ａ组，细胞分类计数显示以 Ｕ／ｍｌ低于Ｂ组但仍高于Ａ组，各组间差异有统计 学意义（Ｐ值均ｄ０．０１）（图１）。 四、肺组织中ＡＴＦ３蛋白的表达情况 免疫组织化学显示（表２，图２）豚鼠肺组织中 ＡＴＦ３蛋白在Ｂ组细支气管中表达呈强阳性，Ａ组 ＥＯＳ 增加最为显著，而ｃ组较Ｂ组明显减少。进 一步证实气道炎症反应在哮喘的发病机制中的重要 许多研究显示氧化应激在引起气道炎症及其发 作用，ＥＯｓ为主要炎性反应细胞。 展中起关键作用ｌ９ 。本实验中Ｂ组ＲＯＳ含量明 显高于Ａ组，哮喘急性发作期存在严重氧化应激。 表达呈弱阳性，Ｃ组呈阳性；其表达主要集中于上皮 细胞胞浆，炎细胞胞浆、胞核和平滑肌层。三组表达 差异有统计学意义（Ｐ值均＜Ｏ．０１）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 过高水平的ＲＯＳ通过激活ＥＯＳ和ＮＥＵ损伤气 结果（表２，图３）显示的ＡＴＦ３蛋白表达含量变化与 道；或通过活化应激激酶ＭＡＰＫ，激活氧化还原敏 免疫组织化学结果一致，各组间表达差异有统计学 感的转录因子ＮＦ—ＪｃＢ和ＡＰ～１，促成氧化应激诱导 意义（Ｐ值均ｄ０．０１）。 的炎症反应机制口 。 五、肺组织中ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ的表达变化 ＡＴＦ３是一个细胞应激反应网络中心，可被各 原位杂交显示（表２，图４）：豚鼠肺组织中 种各样的应激信号诱导，其蛋白是各种修饰的潜在 ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ在Ｂ组细支气管中表达最强，Ａ组表 靶点，参与许多疾病的发生、发展＿１ 。ＡＴＦ３功能 达最弱，Ｃ组表达较Ａ组强但弱于Ｂ组；ＡＴＦ３ 具有多效性，其表达可能有利也可能不利，因具体环 ｍＲＮＡ表达部位与免疫组织化学显示蛋白表达部 境而不同。在神经系统的研究中 ，ＡＴＦ３保护轴 位相同，三组表达差异有统计学意义（Ｐ值均＜ 突免受氧化损伤，诱导表达的ＡＴＦ３减少ＲＯＳ在轴 ０．０１）。ＲＴ—ＰＣＲ测得（表２，图５）各组ＡＴＦ３ 突线粒体积累。星形胶质细胞内Ｎｒｆ２上调ＡＴＦ３ ｍＲＮＡ的表达水平与原位杂交显示的变化趋势一 的表达，Ｎｒｆ２一依赖的ＡＴＦ３诱导增强Ｎｒｆ２的抗氧 致，各组间表达差异有统计学意义（Ｐ值均＜ 化和细胞保护功能［１ 。而Ｂｒｏｗｎ等 研究发现 ０．０１）。 ＡＴＦ３作为一种新的抑制剂阻遏Ｎｒｆ２介导的应激 六、豚鼠ＢＡＬＦ细胞中ＡＴＦ３蛋白表达 反应途径。ＡＴＦ３表达抑制ＧＳＴ／ＧＳＨ介导ＤＥＭ 免疫细胞化学显示ＡＴＦ３蛋白表达在Ｂ组阳 的解毒作用，且测得ＲＯＳ产生增加了３０ ９／６。ＴＧＦ—ｊ３ 性率最高，Ａ组最低；三组表达差异有统计学意义 介导表达的ＡＴＦ３显著抑制Ｎｒｆ２调控的ＡＲＥ依 （Ｐ值均ｄ０．０１）（图６）。 赖性Ⅱ相基因（７一ＧＣＳ，ＧＳＴｓ，ＳＯＤ１）的表达ｕ 。本 七、相关性分析 研究结果显示哮喘急性发作期豚鼠模型中ＡＴＦ３ 直线相关分析表明，豚鼠肺组织中ＡＴＦ３蛋白 的表达显著升高，而经地塞米松处理后表达下降，且 及ｍＲＮＡ的表达变化与ＲＯＳ含量呈正相关（ｒ值 其表达变化与ＲＯＳ含量及ＢＡＬＦ中炎细胞总数和 分别为０．９９１，０．９９９；Ｐ值均＜０．０１），ＢＡＬＦ中 ＥＯＳ ９／６呈正相关。说明ＡＴＦ３的表达参与哮喘气 ＡＴＦ３蛋白与炎细胞总数、ＥＯＳ ９／６及ＲＯＳ含量变化 道氧化应激和炎症反应机制。研究还表明ＡＴＦ３ 均呈正相关（ｒ值分别为０．９７８，０．９９５，０．８０９；Ｐ值 可抑制促炎基因表达，阻止免疫系统反应过强，以防 均＜０．Ｏ１）。 治机体炎性疾病（如哮喘ｌｌ 、呼吸机相关性肺 讨 论 损伤 。 ）。 本研究从动物实验方面探讨了应激反应转录因 哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的慢性炎症 子ＡＴＦ３，提示ＡＴＦ３可能通过调控抗氧化基因 性疾病。ＯＶＡ： 诱导的哮喘认为是以慢性气道炎 Ｎｒｆ２／ｙ—ＧＣＳｃ或促炎基因ＮＦ—ＫＢ和ＡＰ一１等的表达 表２各组豚鼠肺组织中ＡＴＦ３蛋白及ｍＲＮＡ的表达变化（ ±Ｓ） 注：ＡＴＦ３：激活转录因子一３；ＲＴ－ＰＣＲ：逆转录一聚合酶链反应；与对照组比较， Ｐ＜Ｏ．０１；与哮喘组比较， Ｐ＜Ｏ．０１ 中华哮喘杂志（电子版） ２０１１年８月第５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ ！！ 旦竺！！ ！ ！！垒 壁 ！ ： ！ ！： ・ ９ ・ 在哮喘的发病机制中发挥重要作用，其具体作用机 ２Ｏ１Ｏ，７４：１８１４—１８１８． 制及防治可行性还有待进一步研究。 ［ 。］ Ｃｈｏ ＹＳ，Ｏｈ ＳＹ。Ｚｈｕ Ｚ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＳＨＰ一１ ｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ （本文图１～６见光盘） ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００８，３９：４１２— 参 考 文 献 ４１９． ［１１］ Ｙａｄａｖ ＵＣ，Ｒａｍａｎａ ＫＶ，Ａｇｕｉｌｅｒａ－Ａｇｕｉｒｒｅ Ｌ，ｅｔ ａ１． ［１］ Ｎａｄｅｅｍ Ａ，Ｍａｓｏｏｄ Ａ，Ｓｉｄｄｉｑｕｉ Ｎ．Ｏｘｉｄａｎｔ—ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ａｓｔｈｍａ：ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ６５３５． ｄａｔａ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ， ［１２］ Ｈａｌ Ｔ，Ｗｏｌｆｏｒｄ ＣＣ，Ｃｈａｎｇ ＹＳ．ＡＴＦ３，ａ ｈｕｂ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ２００８，２：２１５－２３５． ａｄａｐｔｉｖｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｎｅｔｗｏｒｋ，ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｅ２］ 张秀峰，戴爱国，胡瑞成．Ｎｒｆ２／Ｂａｃｈｌ调控支气管哮喘豚鼠 Ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａ ｕｎｉｆｙｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ７．Ｇｅｎｅ 肺组织Ｔ一谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达．中华结核和呼吸 Ｅｘｐｒ，２０１０，１５：卜１１． 杂志，２００８，３１：８５３－８５５． ［１３］ Ｋｉｒｙｕ—Ｓｅｏ Ｓ，Ｏｈｎｏ Ｎ，Ｋｉｄｄ ＧＪ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ Ｅ３］ 陈建，戴爱国，胡瑞成，等．支气管哮喘豚鼠ＢＡＬＦ炎症细胞 ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｘｏｎａｌ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ 中ＰＰＡＲ７、Ｎｒｆ２和７－ＧＣＳ－ｈ表达的变化．中国病理生理杂 ｏｆ ａｘｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ１ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１０，３０： 志，２０１０，２６：７６０—７６５． ６６５８—６６６６． ［４］ Ｄｅｂｌｅｙ ＪＳ，Ｓｔａｍｅｙ ＤＣ，Ｃｏｃｈｒａｎｅ ＥＳ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ Ｅ１４］ Ｋｉｍ ＫＨ，Ｊｅｏｎｇ ＪＹ，Ｓｕｒｈ ＹＪ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ— ｏｘｉｄｅ，ｌｕｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｗｈｅｅｚｙ ｉｎｆａｎｔｓ ｒｅｓｐｏｒ￣ｓｅ ＡＴＦ３ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｎｒｆ２ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｎｄｔｏｄｄｌｅｒｓ．Ｊ ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２０１０，１２５：１２２８—１２３４． Ａｃｉｄｓ Ｒａｓ，２０１０，３８：４８—５９． Ｅ５］ Ｋｉｍ Ｅ－Ｙ，Ｓｈｉｎ ＨＹ，Ｋｉｍ Ｊ－Ｙ，ｅｔ ａ１．ＡＴＦ３ ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ［１５］ Ｂｒｏｗｎ ＳＬ，Ｓｅｋｈａｒ ＫＲ，Ｒａｃｈａｋｏｎｄａ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｎ Ｋｄｏ２—‘ｌｉｐｉｄ Ａ——ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＬＲ４—。ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｖｉａ ＮＦ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２Ｏ１０，５：ｅｌ４１８１． ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（Ｎｒｆ２）一ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅ６］ Ｈａｃｋｌ Ｃ，Ｌａｎｇ ＳＡ，Ｍｏｓｅｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８，６８：３６４—３６８． ｆａｃｔｏｒ一３（ＡＴＦ３）ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ［１６］ Ｂａｋｉｎ ＡＶ，Ｓｔｏｕｒｍａｎ ＮＶ，Ｓｅｋｈａｒ ＫＲ，ｅｔ ａ１．Ｓｍａｄ３一ＡＴＦ３ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｓ ｕｐ—。ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ｈｅａｔ— ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｓ ＴＧＦ ｂｅｔａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ （Ｈｓｐ９０）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，１０：６６８． ＰｈａｓｅⅡｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００５， ［７］ Ｌｅｅ ＣＴ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ３８：３７５－３８７． ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｃａｉｎｅ． ［１７］ Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ Ｍ，Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ，Ｌｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ＰＬｏＳ Ｍｅｄ，２００８，５：ｅｌ１７． ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＡＴＦ３ ａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｔｏｌｌ— Ｅ８］ Ｊｕｎｇ ＪＹ，Ｌｅｅ ＫＹ，Ｌｅｅ ＭＹ．ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４１：１７３—１７８． ａｎｔｉａｓｔｈｍａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｕｅｅｒｎｅｏｌ Ｄ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ［１８］ Ａｋｒａｍ Ａ，Ｈａｎ Ｂ，Ｍａｓｏｏｍ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１ １，１ １：６９８— ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ－ ７０５． ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ ＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔ ＣａｒｅＭｅｄ，２０１０，１８２： ［９］ Ｌｅｅ ＪＡ，Ｌｅｅ ＭＹ，Ｓｅｏ ＣＳ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉ—ａｓｔｈｍａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ４８９—５００． ａｎ Ａｍｏｍｕｍ ｅｏｍｐａｃｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ａｎ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）一 （收稿日期：２０１１－０２～１８） ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ａｓｔｈｍａ ｍｏｄｅ１．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， 彭文芳，戴爱国，朱黎明．支气管哮喘急性发作期激活转录因子一３的表达及作用［Ｊ／Ｃｂ］．中华哮喘杂志：电子版，２０１１，５（４）：２３４—２４０