所需仪器:恒温培养箱(微生物的试管和平板培养)、冰箱(冷冻保存)、测试分析仪、分液漏斗、试管、烧杯、锥形瓶、电子天平、纱布、土豆200g,葡萄糖20g,琼脂15—20g,蒸馏水1000ml、NaOH溶液0.75mol/L(提高吸附率)、丙酮、二氯甲烷、无水硫酸钠、酵母粉、(六价铬离子溶液、二价镍离子溶液、锌离子溶液、二价铅离子溶液、二价锰离子溶液、二价铜离子溶液、二价镉离子溶液的等比例混合物)及其他实验室常用器具。
1.)培养白腐菌:
先配置培养基,然后培养基灭菌,然后无菌条件接种,最后在25-28度恒温箱内培养,培养周期5-7天。要保证培养基内没其他的细菌,所以接种前先培养基灭菌。
培养基
土豆固体培养基 土豆200g,葡萄糖20g,琼脂20g PH 6,蒸馏水1L,KH2PO4 3g,MgSO4* 7H2O 1.5g,维B1 8mg(称去皮的土豆小块200g,加水1000ml慢慢煮开(20分钟),煮至土豆小块能被玻璃棒戳碎为止,两层纱布过滤,将滤液补足1000ml),该培养基主要用于白腐菌Phanerochaete chrysosporium的培养和纯化以及保种。 1.制作培养基的过程
(一)称量 根据用量按比例依次称取成分,常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,称量时要迅速。 (二)溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量,加热,一加入各成分,使其溶解,琼脂在溶液煮沸后加入,融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力,勿使培养基烧焦或溢出。溶好后,补足所需水分。
(三)调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。
(四)过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利于某些实验结果的观察,如无特殊要求时可省去此步骤。
(五)分装 按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内;分装时注意,勿使培养基沾染在容器口上,以免沾染棉塞引起污染。
1.液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜,分装三角瓶的量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2.固体分装 分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面,斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶,以不超过容积的1/2为宜。 3.半固体分装 装置以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。
(六)加棉塞 分装完毕后,在试管口或三解瓶口塞上棉塞(或泡沫塑料塞及试管帽等,以阻止外界微生物进入培养基而造成污染,并保证有良好的通气性能。(七)包扎 棉塞头上包一层牛皮纸,扎紧,即可进行灭菌。
(八)保存 灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时,以检验灭菌的效果,无污染方可使用。 2.高压蒸汽灭菌
1. 首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角架相平为宜。
2.放回内层锅,并装入待灭菌物品(内装培养基或小的三角瓶),不要装得太挤,以免妨碍汽流通影响灭菌效果,三角瓶口不要与桶壁接触,以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内,再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓,使螺栓松紧一致,,勿使漏气。3.用电炉或其他方法加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气,待冷空气排尽后,关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升,当锅内达到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。4.停止加热,待压力表的压力降至零位时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。注意:当压力不为零时,不能开盖取物否则由于压力突然下降,容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染而发生污染,甚至
灼伤操作者。5.高压灭菌锅上的安全阀,是保障安全使用的重要机构,不得随意调节。
真空冷冻干燥菌种的恢复培养
1. 安瓿管开封:用浸过75%酒精的脱脂棉擦净安瓿管,用火焰加热器顶端,滴加少量无菌水至加热顶端使之破裂,用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。
2. 菌株恢复培养:用无菌吸管吸取0.3-0.5毫升适宜的液体培养基,滴入安瓿管内,轻轻振荡,使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液,移植于建议的斜面培养基上,并在建议的温度下培养。
接种白腐菌
把 需要培养的 白腐菌与培养皿中的培养基接触,就算完成了 接种
1)固体接种,用无菌镊子夹起白腐菌,把白腐菌放在培养皿上(如果想要实验结果明显,就把白腐菌在培养基上用手指轻压一下)
2)液体接种,将把事先准备好的白腐菌溶液用无菌棉棒浸湿,然后把 无菌棉棒在 培养基上来回涂抹均匀
试验完了后,用福尔马林溶液浸泡实验器材,就可起到杀菌作用了。
菌种保存方法(2-8摄氏度保存) 1.斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至2—8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同,移种时间亦有不同。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。 2.液体石蜡保藏法
(1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌30分钟,然后放在40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。
(2)将需要保藏的菌种,在最适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体或孢子。
(3)用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以
高出斜面顶端1cm为准,使菌种与空气隔绝。
(4)将试管直立,置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。
此法实用而效果好。此法的优点是制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。
2.)实验菌株
本研究选择的实验菌株为白腐菌Phanerochaete chrysosporium,属于真菌中的担子纲菌,改菌经过一段时间的培养不需添加其他固定化化学药剂即为小球状
3.)生物吸附剂的制备
将菌种接入灭菌后的培养液中,置于恒温摇床30℃,转速150r/min的条件下振荡培养,培养 72h后,过滤收集菌体,用去离子水反复冲洗3遍,将所得菌体置于两层纱布中将其中水分拧干,用力适中,以防破坏菌体的球状结构,之后利用所得菌体进行重金属吸附试验,或者将其放入4℃冰箱中保存使用。
用0.75mol/L NaOH 溶液浸泡白腐菌菌体40min,可以促进其吸附金属的能力,使其吸附率达最高可到97.40﹪
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1确定实验室、试剂及实验器材 2培养白腐菌
3取纯净水,设六组实验。第一组是在不加任何物质的纯净水中加入白腐菌;其他五组之间形成白腐菌浓度梯度,每一组设浓度梯度为10%的九组重金属浓度梯度,这样既和第一组形成对照,又相互之间形成自身对照,实验结果更加准确、真实。
4观察实验现象,记录相关数据,并分别针对每组实验得出结论。 5把每组实验结果综合起来,两两对照,并得出最后结论 6去榆林地区的一些大型工厂,采集污水水样,并进行测试分析,然后,用白腐菌进行处理,观察并得出结论。
7总结,并整理资料,发表论文。 (2)
1).取45只试管
2).将45只试管分为五组,分别编号A,B,C,D,E;每组9只试管,分别编号为1,2,3,4,5,6,7,8,9。
3).每组分别按照相差 20mg/l的梯度,设置待测物分别为20mg/l,40mg/l,60mg/l,80mg/l,100mg/l,120mg/l,140mg/l,160mg/l, 180mg/l;所以,我们需要按照以上梯度,向干燥洁净的试管中,按照1,2,3,4,5,6,7,8,9,的顺序分别加入20mg/l,40mg/l,60mg/l,80mg/l,100mg/l,120mg/l,140mg/l,160mg/l, 180mg/l 的等量且适量的待测物。
4).A,B,C,D,E五组,每组设置的浓度梯度是相同的。但是这五组所加的白腐菌的量也是互成浓度梯度的,这里是指,在A,B,C,D,E五组中分别准确
的按照 2g/l,4g/l,6g/l,8g/l,10g/l称取菌体
5)由以上步骤设置完成后,实验也就正式开始了。接下来,需要观察各组、各编号试管的实验现象,并分别做出小结。
6)把各组、各个编号试管的实验结果综合整理起来,两两对照,并得出最后结论,做以总结。
内容 步 骤 纯净水+白腐菌 白腐 待测物菌2g/l 20mg/l 待测物40mg/l 、、、、、、 待测物180mg/l 白腐 待测物菌4g/l 20mg/l 待测物40mg/l 、、、、、、 待测物180mg/l 、、、、、、 、、、、、、 白腐 待测物菌 20mg/l 10g/l 待测物40mg/l 、、、、、、 待测物180mg/l 现 象 结论 总结
(4)
已得出实验室结果,总结之后,去榆林地区的一些大型工厂,采集污水水样,并进行测试分析,然后,用白腐菌进行处理,观察并得出结论。
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