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利用微卫星DNA标记分析贵州3个地方猪种的遗传多样性

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安徽农业科学,Journal of Anhui A .Sci.2009,37(8):3453—3454,3459 责任编辑张蕾责任校对陈秀晨 利用微卫星DNA标记分析贵州3个地方猪种的遗传多样性 郭宏宇 ,林家栋 (1.山口 农业大学动物科技学院,山西太谷o3o8o1;2.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025) 摘要『目的]为贵州地方猪种的琛护开发与利用提供遗传学依据。[方法]根据联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG) 联合推荐的27对猪微卫星引物,从中筛选出6对(SO155,SW240,IGF1,SW951,SW857,SW24),用于对糯谷猪、柯乐猪、关岭猪3个贵州 地方猪群体进行微卫星DNA检测,进而分析其遗传多样性。[结果]3个品种(类型)猪呈高度多态(P/C>0.5),Nei氏标准遗传距离为 0.206 3~0.481 5。群体间遗传距离最远的是关岭猪与糯谷猪,最近的是柯乐猪与糯谷猪。[结论J3个贵州地方猪种的遗传多样性较 好;糯谷猪是中国优良地方猪种柯乐猪中的一个特殊类型。 关键词贵州地方猪;微卫星标记;遗传多样性;亲缘关系 中图分类号¥828 文献标识码A 文章编号0517—6611(20o9)o8—03453—02 Genetic Diversity Analysis of Titree Guizhou LOCal Pig Breeds Using Microsatellite DNA Markers GU0 Hong・yu et al (College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi 030801) Abstract f Objective l The research aimed to provide the genetic basis for the protection,development and utilization of Guizhou local pig breeds.『Method】From 27 pairs of porcine microsatellitc primers recommended by Food and Agricuhure Organization of the United Nations (FAO)and International Society for Animal Genetics(ISAG),six pairs(SO155,SW240,IGF1,SW95 1,SW857,SW24)were selected ofr microsatellite DNA detection of three Guizhou local pig breeds including Nuogu Pig,Kele Pig and Guanling Pig.Subsequently,their genetic diversities were analyzed.1 Result I The three pig breeds were high polymorphic at the six microsatellite lOCi(P >0.5).The Nei’S stand— ard genetic distance ofthem was 0.206 3—0.481 5.The furthest genetic distance appeared between Nuogu Pig and Guanling Pig.and the clo— sest showed between Nuogu Pig and Kele Pig.[Conclusion]The three Guizhou local pig breeds were in high genetic diversities.Nuogu Pig is a special type of Kele Pig.an excellent Chinese local pig breed. Key words Guizhou local pig:Microsatellite nlarker;Genetic diversity;Genetic relationship 微卫星标记是20世纪80年代发展起来的一种能有效 猪种的保护与开发利用提供进一步的遗传学依据。 区别不同物种、不同群体及不同基因型个体的分子标记技 1材料与方法 术。微卫星DNA(microsatellite DNA),又称STR(short tan— 1.1材料采集3个地方猪种血液样品,共90份(表1)。 dem repeat),即短串联重复序列,指存在于真核细胞基因组 采集个体品种特征明显,公母各半。 内、由2~6 bp核心序列串联重复形成的DNA序列。微卫星 表1样品采集地点及样品数 标记具有数量多、在基因组中分布广泛、多态性丰富、突变率 Table 1 Sampling sites and quantity of 3 pig breeds 高、呈孟德尔式共显性遗传、可以特异性地PCR扩增、稳定 性和重复性好、引物通用性好、检测快速方便、能较好地反映 物种的遗传结构和遗传多样性变化等优点,被广泛应用于医 学和生物学领域。 20多年来,随着国外优良猪种的大量涌入,我国地方猪 品种受到强烈冲击,有的业已灭绝,有的处于濒危状态,群体 1.2微卫星标记的筛选采用联合国粮农组织(FAO)和国 规模急剧下降,代表血统关系的公猪数量锐减,出现全局性 际动物遗传学会(ISAG)联合推荐的27对微卫星引物,并根 的猪品种资源危机。因此,采取合理的品种保护和利用措施 据等位基因数多、具有高度多态性、相互间不存在连锁关系、 势在必行。该试验对糯谷猪、柯乐猪和关岭猪3种类型贵州 分布在多个不同的染色体上等原则进行筛选,确定6对引 地方猪DNA水平的遗传多样性进行研究,以期为贵州地方 物。所用的微卫星标记信息见表2。 表2 6个微卫星座位的相关信息 Table 2 The information of 6 microsatellite loci 基金项目贵州省农业攻关项目(黔科合NY[200S]3042)。 作者简介 孝! ?2009-动物遗传育种与繁殖。01-21 83, ).,.男, 山西太谷人,通讯作者。博士研究生, 研究方向: 21.版)3基因组总DNA的提取 ,采用常规酚一氯仿 tttl+ ̄参照《分子克隆实验指南》(甘+.]/法进行。 … ’第  收稿日期收稿日期 , , ,日币 明一 堪1 J o 3454 安徽农业科学 2O09芷 1.4微卫星多态性检测6对微卫星引物序列由上海生工 后,利用凝胶成像系统进行照相并保存。 生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系:10×扩增 1.5统计分析计算3种小型猪在6个微卫星位点上的平 缓冲液2.5 ,25 mmol/L MgCl (体积据引物所需浓度确定), 均等位基因数(MNA)、有效等位基因数(Ne)、平均杂合度 10 mmol/L4种dNTP混合物0.5 ,2.5 prod/ 上、下游引物’(H)、多态信息含量(PIC)和Shannon指数;利用软件计算Nei 各3.O ,50—1130.g/ 模板DNA 1.0 ,2 U/ 酶0.5 氏遗传距离,并进行NJ聚类。 由表3可以看出,3个贵州 l,加灭菌双蒸水至总体积25 。各组加完后,瞬时离心,轻微 2结果与分析 振荡后,再离心10 S。反应程序:95℃预变性5 min;94℃变性 2.1品种(类群)内遗传变异性30 S,58~61℃(因引物不同而异,详见表2)退火30 s,72℃ 地方猪品种(类群)的群内遗传变异不大,平均等位基因数为 延伸45 s,35个循环;72℃延伸10 rain;10℃保温至结束。 4.17~6.17;在5个统计量中,除有效等位基因数(Ne)和基 产物进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。固定、染色 因多样性(GD)外,糯谷猪都是最低的。 表3 3个品种猪枣体的遗传变异性 Table 3 Genetic variations of 3 pig breeds 2.2品种基因杂合度期望杂合度也称为基因多样性(gene diversity,GD),由表4可见,糯谷猪在位点SW240处的基因多 样性最大,关岭猪在位点IGFI处最小;6个位点中位点 SW240的平均基因多样性最大,位点IGF1的平均基因多样 性最小。 表4 3个品种(类型)猪在6个微卫星位点的遗传杂合度 Table 4 Heterozygosity of 3 pig breeds at 6 microsatellite DNA Iocl 图1 3个品种猪基于奈氏标准遗传距离的NJ聚类图 Fig.1 NJ dendrogramof3pig breeds usiIIgNei’S standard ge- netic distance 其中以版纳小耳猪近交系最高;PIC和平均杂合度均较低, 贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,它们之间的 遗传距离为0.247 2 。造成该差异的原因是该试验所用样 本为随机取样,而商海涛等所用样本均为利用原产地近交程 度较高的基础群经过l0余年封闭或近交培育而建立的品 系;另外,所选的微卫星位点数目不同是导致结果不同的另 一重要原因。 2.3 3种猪的遗传距离分析由表5可知,3种猪的Nei氏 (2)种内的遗传多样性。等位基因数、杂合度、多态信息 含量是衡量畜禽品种遗传多样性的常用指标。多态信息含 量(PIC)最初用于连锁分析时对标记基因多态性的估计,现 标准遗传距离中,糯谷猪与柯乐猪的遗传距离较近,与关岭 猪较远。根据Nei氏遗传距离绘制3种小型猪的聚类结构见 图1。 表5 3个品种间的奈氏标准遗传距离 Table 5 Nei’S standard genetic distances of3 pig breeds 在常用来表示微卫星多态性的高低 。当 c>0.50时为 高度多态;0.25<P/C<0.50时,为中度多态;而当PIC<0.25 时为低度多态。u等用微卫星方法估计了7个中国猪种的 遗传多样性,结果表明,中国地方猪种的遗传多样性高于外 来品种 ,这说明微卫星位点的变异程度能反应品种间的特 异性。由于微卫星标记比血型、蛋白质位点更具有多态性, 由其计算出的基因杂合度一般在0.3~0.8,因此在估测遗传 距离,尤其是亲缘关系较近的群体间遗传距离时就更为精 确。Van Zeveren等利用7个微卫星标记对4个比利时猪种 3讨论 . 进行了研究,通过等位基因频率、多态信息含量、遗传杂合 (1)品种间的遗传距离。遗传距离常用来反映品种间 度、有效等位基因数及品种内个体相似概率5个指标的比 的亲缘关系,研究发现糯谷猪与柯乐猪之间的遗传距离较 较,得出了品种内的遗传差异和遗传关系,其平均杂合度为 近。而与关岭猪较远。商海涛等利用35个微卫星标记对贵 0.54~0.67 ]。在该研究中,贵州3个地方猪种在各位点上 州小型香猪、广西巴马小型猪、版纳小耳猪近交系进行了遗 得到的等位基因数平均为5.11个,表明贵州地方猪种的遗传 传学分析,结果表明,3个品系的小型猪基因纯合率均较高, (下转第3459页) 37卷8期 高道侠等 江西酸橙不同栽培变种RAPD分析 3459 №一 群划分、遗传图谱构建及基因定位等研究领域。RAPD—PCR 扩增中不同的扩增条件和扩增程序都会对扩增出来的图谱 有所影响,所以试验前必须先对扩增条件和扩增程序进行筛 选,选择扩增出的主条带清楚明显,片断长度不会太大或太 小的条件进行,因为片断太大重复性较差,片断太小则不清 O O O O O O 晰。该研究在对影响PCR扩增的因素进行优化处理后得到 35 2  3 37 6  3 2 3 6 l 了适合酸橙RAPD分析的最佳反应条件为:O 0 O O O 60 ng DNA模板, 图3不同酸橙栽培变种聚类分析树状图 Fig.3 The clustering analysjs map of diferent eultivars of C/t- rus aurantium Linn. 2.5 U 驺粥∞ 酶,镁离子终浓度为2.0 mmoL/L,dNTPs终浓度为 O 0 0 O 150/xmol/L,PCR反应总体积为25 l。 不同产地的酸橙品种遗传距离不同,表明各品种之间存 粥 0 O O 差异,可以说是同一品种。 在一定的差异。从RAPD扩增图谱可以看出,同1个引物可 02 6 3 3  2 表6不同酸橙栽培变种遗传距离 以扩增出不同迁移率的条带,O O 也可以扩增出迁移率相同的条 3 3 l Table 6 The genetic distance of diferent cultivars of Citrus aurantium 带,说明可能不同条带是由不同的基因位点扩增出来的,而 Linn. 相同迁移率条带是由同样的基因位点扩增出来的,因为引物 O 3 编号 zs1 zs2 zs3 zs4 zs5 zs6 zs7 zs8 zs9 是随机与基因结合的,但是单凭一两个图谱是不能说明问题 的,必须采用一定量的条带数目进行统计才能够更真实地反 0.14 映出样品之问的遗传亲缘性。 O.15 0.1O 从遗传距离指数看,香橙Zs2、香橙Zs3亲缘性可能较 O.29 O.28 O.26 O.28 近,两者又和香橙Zsl亲缘较近,基本符合同性状鉴别的结 O.28 0.33 果。同样鸡仔橙Zs6和鸡仔橙Zs7遗传距离指数也与性状鉴 0.27 O.32 别结果一致。但是臭橙Zs4却与臭橙Zs5的遗传距离相差较 O.29 O.28 O.24 O.32 远,遗传距离指数为0.30,这与性状鉴别结果不一致,可能是由 于基因上存在一定差异但是表现型却相似或相同导致的。因 3结论与讨论 为不同的密码子可以编辑同样的氨基酸,这就使得DNA指 RAPD技术是利用随机引物在生物种群中寻找同源序 纹图谱在植物的育种及基因改良等方面发挥作用。 列,并将同源序列之间的片段扩增出来的一种分子标记技 参考文献 术。该技术主要通过DNA带的有无统计分析生物种群或个 [1]J・萨姆布鲁克,E・F・弗里奇,T・曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南 [M].北京:科学出版社,1991:956. 体间的遗传多样性和亲缘关系。RAPD技术作为一种简便、 [2]王培训,周联。赖小平.分子生物学技术与中药鉴别RAPD技术的研究 快速、安全和高灵敏度的分子标记,已广泛应用在动植物种 与应用[M].北京:世界图书出版公司,2002:177. [3]刘贤旺,于占国,葛菲,等.江枳壳种质资源的RAPD分析[J].江西中 医学院学报.2005.17(1):55—58. (上接第3454页) 糯谷猪和柯乐猪所处地理位置相近,可以推测二者源于共同 多样性较好。 的祖先,亲缘关系较近;该试验结果表明二者的遗传距离最 (3)3个贵州地方猪种的亲缘关系与地理分布。该试验 近,符合二者的地理分布。糯谷猪与关岭猪的亲缘关系最 表明,糯谷猪与柯乐猪之间的亲缘关系最近,而糯谷猪与关 远,也符合二者的地理分布。 岭猪之间的亲缘关系最远。由地理分布来看,纳雍“糯谷猪” 参考文献 (又叫黄毛猪)是中国优良的地方猪种柯乐猪中的一个特殊 [1]J・萨姆布鲁克,E・F-弗里奇,T・曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南 类型 糯谷猪产地纳雍县位于云贵高原中部,黔西北毕节地 [M].2版.金冬雁,黎孟枫,等,译.北京:科学出版社,1992. [2]商海涛,牛荣,黄中波,等.三品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学 区中南部,乌蒙山东南麓,海拔l 052—2 476 nl。地势匮北 研究[J].遗传,2001,23(1):l7—20. 高,东南、东北低。全境多山,峰峦叠起,沟壑纵横。流水下 [3j BOSTEIN D,WHITE R L,SKOLNIC M.Construction of a genetic link— 切,山高坡陡,属典型的喀斯特地貌。柯乐猪产贵州赫章,以 agemaps in mail using restriction fragment length polymorphisms[J]. Ameri-san Journal of'Human Genetics,1980,32:314—331. 柯乐(今可乐)为中心产区,分布于贵州西北部和云南宣威、 [4j LI X,LIK,FAN B,et a1.Th genetic diversity of seven pig reedsin Chi. 曲靖等地。关岭猪产于贵州省关岭县。以该县的花江一带为 Ha,estimated by means ofmicrosatellites[J].Asian—Aus J Anim Sci.20OO. 13(9):1193—1195. 繁殖中心。产区位于黔中高原和黔南高原低山峡谷地区,地 [5]VAN ZEVEREN A,PEELMAN L。VAN DE WEGHE A.et a1.A genetic study of four Belgina pig populations by means of seven microsatellite loci 形复杂 ,岭谷起伏,平地很少,海拔296—1 900 m。关岭猪分 [J].J Aniat Breed Genet,1995,112:191—204. 布于安顺地区、黔东南苗族侗族自治州、黔南布依族苗族自 治州和贵阳市,是贵州省中南部山区分布较广的地方猪种。 

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