大曲中可培养霉菌多样性的分子分析

大曲中可培养霉菌多样性的分子分析

惠丰立1,　褚学英1,　冯金荣1,2,　文祯中1

(1.南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳473061;2.河南师范大学生命科学学院,河南

新乡453002)

摘　要:从中温大曲中分离98株霉菌进行纯培养,通过形态和培养特征初步分析后得到6个不同的类群,从各类群中随机选取1个代表菌株进行5.8S2ITS序列分析和系统发育分析。结果表明,

分离的菌株分布在Monascus属、Eurotium属、Rhizopus属、Cladosporium属、Penicillium属、Absidia属等6个已知真菌属,揭示了中温大曲中霉菌的多样性。关键词:中温大曲;霉菌;5.8S2ITS;多样性中图分类号:Q939;TS262.4文献标识码:AMolecularAnalysisonDiversityofCulturableMoldIsolated

fromMediumTemperatureDaqu

HUIFeng2li1,ZHUXue2ying1,FENGJin2rong1,2,WenZhen2zhong1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,NanyangNormalCollege,Nanyang473061,China;2.CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453002,China)

Abstract:Inthismanuscript,98moldstrainswereisolatedfrommediumtemperatureDaquusingPDAculturemedium.Byanalysisofthemorphologyandculturecharacteristic,theisolateswereclusteredinto6genotypes,andtherepresentativesofeachgenotypewererandomlychosenforthedetermination5.8S2ITSregionsequences.Thephylogeneticanalysisindicatedthatalloftheisolateswereclusteredinto6group:Monascus,Eurotium,Rhizopus,Cladosporium,Penicillium

andAbsidia,respectively.Theseresultsshowthatthegooddiversityofmoldinmedium

temperatureDaqu.

Keywords:mediumtemperatureDaqu;mold;5.8S2ITS;diversity

　　大曲是大曲酒生产的糖化剂和发酵剂,含有多种微生物及其产生的多种酶类,它构成了酿酒过程的内在动力[1,2]。由于大曲的生产是传统工艺,自然培菌来网罗和富集环境中的微生物。因此,大曲

　　收稿日期:2006207230.

　　基金项目:河南省自然科学基金项目(0411032300).

中的微生物组成十分复杂。多年来,人们致力于大曲中微生物多样性认识,但由于受技术以及研究手

段的限制,基本上是以传统的形态和生理生化特征来进行分类和鉴定[1,3]。

作者简介:惠丰立(19652),男,河南南阳人,理学硕士,教授.主要从事微生物资源与生态学研究.Email:huifl@

126.com

　第2期惠丰立等:大曲中可培养霉菌多样性的分子分析77

以分子生物学方法为基础的微生物分子生态学,为人类认识自然界微生物群落组成的多样性提供了极大便利。5.8S2ITS是介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域,该区域进化速度较编码区快。已有的研究表明,5.8S2ITS在真菌的种间存在着丰富的变异,而种内不同菌株间却高度保守,可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息。目前5.8S2ITS序列已广泛应用于真菌分子分类学、分子系统及其多样性等方面的研究[4-6]。作者从大曲中进行霉菌的分离,在获得纯培养菌株的基础上,以5.8S2ITS序列分析为依据,对大曲中可培养霉菌的多样性进行分子分析,为揭示大曲中丰富的霉菌资源提供理论基础。

所得PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后,用PE公司BigDye循环测序试剂盒在ABI377型DNA自动测序仪上进行直接双向测序,正反向测序引物分别为上述ITS4和ITS5。116　构建系统发育树

根据测序结果,利用BLAST搜索软件在Gen2Bank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,以比较

代表菌株与已知霉菌相应序列的相似程度。根据同源序列搜索结果,下载相关霉菌种的518S2ITS序列,与代表菌株的518S2ITS序列放在一起,用CLUSTALX118软件[10]进行多序列比对,并采用Neighbor2joining法[11]进行系统进化树构建和同源

性比较。

1　材料与方法

1.1　样品、培养基与试剂

2　结果与分析

211　菌株的分离和初步归类中温大曲由河南省卧龙酒厂提供;菌株分离培养基为PDA培养基;TaqDNA聚合酶,dNTP,λDNA/EcoRⅠ+HindⅢmarker,DL2000marker均购自鼎国公司;5.8S2ITS扩增引物ITS4和ITS5由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2　菌株分离将曲样在无菌操作的条件下粉碎(包括外、中、内3层的混合曲样),用稀释平板法分离大曲中的霉菌,挑取形态不同的菌落分别纯化并保存。1.3　菌株的初步鉴定和归类

参照文献[7,8],对分离菌株的产胞结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征进行观察,并对所有菌株进行初步分类,将形态和培养特征高度一致的归为同一类群。1.4　DNA的提取

各类群选取1个代表菌株,从生长约4～5d的PDA平板上刮取代表菌株的菌丝体,用CATB法[9]提取DNA,检测后置于-20℃冰箱中备用。1.5　PCR扩增和测序

采用稀释平板法从混合曲样中分离到98株大

曲霉菌,它们的表型特征丰富多样。根据其产胞结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等,将分离到的菌株初步归为6个类群,分别编号为DQY28到DQY213。2.2　DNA的提取和PCR扩增

用CATB法提取了6个代表菌株的总DNA,DNA片段较为完整,大小主要集中在2112kb左右(见图1)。以ITS4和ITS5为引物通过特异性PCR反应扩增得到518S2ITS序列,扩增产生的DNA片段为单一条带,片段大小长度约为600～800bp,扩增产物无明显非特异扩增现象(见图2)。

用真菌通用引物ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC23’)和ITS5(5’2GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG23’)PCR扩增各类群代表菌株的ITS125.8SrDNA2ITS2区域序列。PCR反应体系(25μL):10×PCR缓冲液(含20μmol/L的Mg2+)215μL,引物ITS4/ITS5(10μmol/L)各1μL,模板DNA(约50ng/mL)110μL,dNTP(10mmol/L)015μL,Taq酶(5U/μL)012μL,双蒸水1818μL。PCR扩增条件:94℃1min;56℃1min;72℃115min,36个循环。

A1λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ;B1菌株DQY28;C1菌株DQY29;D1菌株DQY210;E1菌株DQY211;F1菌株DQY212;G1

菌株DQY213

图1　代表菌株总DNA电泳图

Fig.1　AgarosegelelectrophorsisoftotalDNAofrepre2

sentativestrains

78食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第26卷　

　　在系统发育树中,6个代表菌株分别与Monas2

cus属、Eurotium属、Rhizopus属、Cladosporium

属、Penicillium属、Absidia属等6个已知真菌属聚

为一支,相互之间的亲缘关系较远,表明大曲中的霉菌有着很高的遗传多样性和种属多样性。然而,不同的菌株却位于不同的亚分支上。菌株DQY28与Monascuspilosus聚在进化树的同一个亚分支上,其相似性为100%,这表明DQY28属于Monas2cuspilosus相同种;DQY211与Rhizopusoryzae相似性为100%,并聚在进化树的同一个亚分支,作者认为DQY211应属于Rhizopusoryzae相同种;菌株DQY212与Penicilliumexpansum相似性为9912%,聚在进化树的同一个亚分支,根据这个结果,DQY212应属于Penicilliumexpansum相同种;菌株DQY213与Absidiacorymbifera相似性为100%,聚在进化树的同一个亚分支,根据这个结果,DQY213应属于Absidiacorymbifera相同种;菌株DQY29和DQY210与已知种的518S2ITS序列相似性都较高(>99%),分类地位须进一步研究确定。

A1DL2000marker;B1菌株DQY28;C1菌株DQY29;D1菌

株DQY210;E1菌株DQY211;F1菌株DQY212;G1菌株

DQY213

图2　代表菌株518S2ITS序列电泳图

Fig.2　AgarosegelelectrophorsisofITSsequencesof

representativestrains

2.3　518S2ITS序列分析

测定6个代表菌株的518S2ITS序列,将获得代表菌株的518S2ITS序列与GenBank数据库中已知相关菌株序列进行比较。采用CLUSTALX118软件进行多序列匹配排列,根据Neighbor2joining法构建系统发育树(见图3)。

图3　基于518S2ITS序列构建的系统进化树状图

Fig.3　PhylogenetictreeshowingtherelationshipsamongtypestrainsandisolatesfromDaqubasedon518S2ITSse2

quence

　第2期惠丰立等:大曲中可培养霉菌多样性的分子分析79

3　结　论

通过对中温大曲中霉菌的表型及遗传多样性的研究,发现大曲中的霉菌具有丰富的多样性,主要分布在Monascus属、Eurotium属、Rhizopus属、Cladosporium属、Penicillium属、Absidia属等6

个已知真菌属。其中菌株DQY28、DQY211、DQY212及DQY213,与它们最相近的已知种分别为

Monascuspilosus、Rhizopusoryzae、Penicilliumexpansum、Absidiacorymbifera;菌株DQY29和

DQY210与多个已知种的518S2ITS序列相似性都

较高,分类地位需进一步研究确定。

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(责任编辑:李春丽)