一 八一 赢 中国食品添加剂 山梨酸钾与牛血清白蛋白相互作用的研究 周享春 ，金小芬，宁方秀，王映，王慧 （长江大学化学与环境工程学院，荆州摘４３４０２３） 要：在模拟动物体生理条件下，用荧光光谱、三维荧光光谱、同步荧光光谱、紫外一可见吸收光谱 法等研究了在不同温度下，山梨酸钾（ＰＳＳ）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）结合反应的光谱行为。试验发现，ＰＳＳ 对ＢＳＡ有较强的荧光猝灭作用。用Ｓｔｅｍ—Ｖｏｌｍｅｒ和Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ方程及热力学方程分别处理试验数据， 发现ＢＳＡ与ＰＳＳ发生反应生成了新的复合物，属于静态荧光猝灭，得到了它们相互作用的生成常数Ｋ ｅ （８．４２１×１０ Ｌ－ｎｌｏｌ ）、热力学参数（ＡＨ。＝一３．５９５ｋＪ・ｍｏｌ～，ＡＳ。＝６３．２６Ｊ・Ｋ ，△Ｇ ＝一２２．７３ｋＪ・ ｍｏｌ ）和结合位点数（０．９７０）等。位点竞争实验结果显示ＰＳＳ与ＢＳＡ的作用位置主要在ＢＳＡ的Ｓｉｔｅ Ｉ（ｓｕｂ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＡ）位。证明二者主要靠静电作用力结合，同时用三维荧光光谱及同步荧光光谱法探讨了ＰＳＳ对 关键词：山梨酸钾；牛』ＩＩＬ清白蛋白；荧光猝灭光谱；三维荧光光谱；热力学参数 中图分类号：０４７２．３；Ｏ６１４．８；０６５７．３文献标识码：Ａ文章编号：１００６—２５１３（２０１０）０６—０１０７—０７ ＢＳＡ构象的影响，为研究ＰＳＳ的毒性和生物学效应提供了重要信息。 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ＺＨＯＵ Ｘｉａｎｇ－ｃｈｕｎ，ＮＩＮＧ Ｆａｎｇ－ｘｉｕ，ＹＡＮ Ｃｈｅｎｇ－ｎｏｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２３） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｂｏｄｙ，ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒ— ｎｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｓｙｎ— ｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｕｌｔｒａ—ｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ｈａｄ ａ ｑｕｉｔｅ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｑｕｅｎｃｈ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｕｎｃｈｉｎｇ ｆｒｏｍ ＢＳＡ．Ａｆｔｅｒ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｄａｔａ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｓｔｅｍ— Ｖｏｌｍｅｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ ｄｏｕｂｌｅ—ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｑｕａｔｉｏｎ，ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＢＳＡ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｈａｔｅ ａｎｄ ｆｏｒｍｅｄ ａ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｕｎｄ．Ｔｈｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｓｔａｔｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ（ＫＬＢ＝８．４２１×１０ Ｌ・ｍｏｌ一 ），ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ＡＨ。＝一３．５９５ｋｊ ・ｍｏｌ一 ，ＡＧ。＝一２２．７３ｋＪ・ｍｏｌ一 ａｎｄ ＡＳ。＝６３．２６Ｊ・Ｋ一 ）ａｎｄ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ（０．９７０）ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｓｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＰＳＳ ｔｏ ＢＳＡ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｔｏｏｋ ｐｌａｃｅ ｉｎ ｓｉｔｅ Ｉ（ｓｕｂ—ｄｏｍａｉｎ ＩＩＡ）ｏｆ ＢＳＡ．Ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒ— ｂａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＳＡ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ，ｃｏｎｔｆｏｕｒ ｓｐｅｃｔｒａ ａｎｄ ｓｙｎｃｈｒｏ— ｎｏｕｓ ｓｐｅｃｔｒａ．Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＰＳＳ ｏｎ ａ ｌｉｖｉｎｇ ｂｏｄｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ；ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｐｅｃｔｕｍ；ｔｒｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓ— ｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ；ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ 收稿日期：２０１０—０３—１５ 项目资助：湖北省自然科学基金（Ｎｏ．２００５ＡＢＡ０６７、Ｎｏ．２００４ＡＢＡ１０４），长江大学大学生创新实验项目基金（ＨＧ２００９００９）。 作者简介：周享春（１９６２一），男，湖北荆州人，硕士，教授，主要从事分析化学的教学与研究。 生ｏｏｄ Ａ ｆｆｆｖ 竺 ：！兰： ！ Ｃｈｉｎ ａ Ｆ就山梨酸钾（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ，简称ＰＳＳ），学 名己二烯一（２，４）一酸钾，是一种常用的食品防 ２结果与讨论 ２．１ ＰＳＳ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱 由于ＢＳＡ分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸等芳香性氨基酸残基能够发射荧光，因而ＢＳＡ 是内源性荧光物质。ＰＳＳ在与ＢＳＡ的作用过程中 腐剂，能有效地抑制霉菌，酵母菌和好氧性细菌 的活性，防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等 有害微生物的生长和繁殖。但过量使用将会对人 体产生毒副作用 Ｊ。本实验在模拟动物体生理条 件下，用荧光光谱和紫外一可见吸收光谱研究了 ＰＳＳ与ＢＳＡ结合反应的光谱特征，着重探讨了 能显著的猝灭ＢＳＡ的荧光。按实验方法测得ＰＳＳ ＰＳＳ对ＢＳＡ的荧光猝灭作用，经处理实验数据得 到了结合常数、作用位点数、结合作用力类型和 作用热力学参数等，通过位点竞争实验确定了 ＰＳＳ与ＢＳＡ之间的结合部位，并用 维荧光光谱 和同步荧光光谱技术考察了ＢＳＡ构象的变化。在 了解ＰＳＳ与蛋白质的结合方式、明确ＰＳＳ在动物 体内的代谢过程、研究ＰＳＳ的中毒机制及指导对 ＰＳＳ的解毒等方面具有重要意义。 １实验部分 １．１仪器与试剂 ＬＳ一５５型荧光分光光度计（美国ＰＥ公司）， ＵＶ一２４５０型紫外分光光度计（１３本岛津公司）， ＡＹ一１２０电子分析天平（日本岛津公司），ＳＹＣ 一１５超级恒温水浴（南京桑力电子设备厂），ｐＢ 一１０精密ｐＨ计（塞多利斯科学仪器有限公司）。 ＰＳＳ（上海浦山化学品有限公司，摩尔质量 １５０．２０）工作液：４．０００×１０～ｔｏｏｌ・Ｌ一；ＢＳＡ （上海化学试剂公司）溶液：１．０００×１０一ｍｏｌ・ Ｌ；ＮａＣ１溶液：０．５ｍｏｌ・Ｌ‘。；Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲 溶液：ｐＨ＝７．４；所用试剂均为分析纯，实验 水为二次蒸馏水，经检测均无荧光杂质。 １．２实验方法 在１０ｍＬ比色管中依次加入０．５ｍｏｌ－Ｌ ＮａＣ１ 溶液２．０ｍＬ、ｐＨ为７．４０的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液 ２．０ｍＬ、１．０００×１０～ｔｏｏｌ・Ｌ ＢＳＡ溶液２．０ｍＬ及 一定量的ＰＳＳ工作液，定容为１０．０ｍＬ，摇匀，恒 温静置３０ｒａｉｎ，在一定波长范围内扫描ＢＳＡ和 ＢＳＡ在ＰＳＳ作用下的荧光猝灭光谱、同步荧光光 谱和三维荧光光谱，在紫外一可见分光光度计上 记录紫外吸收光谱。 与ＢＳＡ作用的荧光猝灭光谱（如图１）。 ６００ ５００ ４（）（） ｋ ３００ — ２ｏｏ １００ ０ ３００ ３６０ ４２０ ４８０ ／ｎｍ 图１ ＰＳＳ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱（３７￣（２） Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＳＳ ｃＢＳＡ＝２．０×１０一 ｍｏｌ・Ｌ一’，ｃＰＳＳ／（１０一 ｍｏｌ・Ｌ一 ）， １—８：０．０，２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，１２．０，１４．０ ２．２荧光猝灭作用的描述 荧光猝灭作用通常按其猝灭机制的不同可分 为动态猝灭和静态猝灭。荧光猝灭的类型可用 Ｓｔｅｍ—Ｖｏｈｎｅｒ方程（１）来判断 ；若为静态猝 灭过程，则可用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ方程（２）来 描述 ］。方程中Ｉ 和Ｉ 分别为无猝灭剂和有猝灭 剂时ＢＳＡ的荧光强度，ｃ 为猝灭剂浓度，Ｋｓ 为 Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ猝灭常数；Ｋ 为静态荧光猝灭结 合常数，它反映了在静态猝灭过程中生物大分子 与荧光猝灭剂分子的结合反应达到平衡时的量效 关系。 Ｉ ／ＩＦ＝１＋ＫｓｖｃＰＳｓ （１） （Ｉ 一Ｉ ） ＝（ｉｏ） ＋Ｋ （Ｉ ）ｃＰＳｓ （２） 本实验在温度分别为２２ｃ【＝，２７。【＝，３２℃， ３７℃时，测定了加人ＰＳＳ后ＢＳＡ的荧光强度变 化，由实验数据分别作出Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ曲线和 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ双倒数曲线，如图２一（Ａ）、 （Ｂ）。对实验数据线性拟合得到直线方程、相关系 数等，见表１一（Ａ）、（Ｂ）。 ｌ６ １２ 呈 ８ ４ ｌＯ－Ｓｍｏｌ Ｕ ） ｃＰｓｓ｜ ／（１０５Ｌ ｍｏｌ ） 图２ ＢＳＡ的Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ曲线（Ａ）和Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ曲线（Ｂ）（１－４的温度分别为２２￣Ｃ，２７℃，３２０（２，３７￣Ｃ） Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ ｃｕｒｖｅｓ（Ａ）ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ ｃｕｒｖｅｓ（Ｂ）ｏｆ ＢＳＡ ａｓ ＰＳＳ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ 表１线性方程与相关系数 Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔ／Ｋ Ｋ ／Ｌ・ｔｏｏｌ～ ＫＬＢ／Ｌ・ｔｏｏｌ～ ＡＨ￣／ｋＪ．ｍｏ１ ＡＳ￣／Ｊ．ｍ０１ ＡＧ￣／ｋＪ．ｍｏ１ ２．３猝灭作用性质和结合反应机理讨论 从表１、表２和图２可以看出，Ｋ 随温度的 体系的ＡＧ，由表２可以看出，ＡＧ＜０，ＰＳＳ与 ＢＳＡ的相互作用可自发进行；另一方面，紫外一可 升高呈明显下降趋势，且Ｉ￣ｖ／Ｉ 与ｃ 及（ｉｏ— Ｉ ） 与ｃ －１均呈良好的线性关系，这表明ＰＳＳ对 ＢＳＡ的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动 态猝灭，而是生成了ＰＳＳ—ＢＳＡ复合物的静态猝 见吸收光谱（图３）显示ＰＳＳ、ＢＳＡ的吸收光谱与它 们作用后的ＰＳＳ—ＢＳＡ体系明显不同，同步荧光光 谱（图６）中峰波长明显红移，都是ＰＳＳ与ＢＳＡ发 生反应生成新化合物的显著标志 Ｊ。 灭。ＰＳＳ与ＢＳＡ的结合反应能否自发进行取决于 生Ｃｈｉｎ ａ Ｆ ｏｏｄ Ａ ｆｆｆｖ 竺 ：＝！三＝ ＡＨ和ＡＳ增大；氢键或者Ｖａｎｄｅｒ Ｗａｌｌ’Ｓ力有可 能使体系的ＡＨ和ＡＳ减小；静电作用力使ＡＨ一 ０，ＡＳ＞０。由表２的数据可以看出：ＰＳＳ与ＢＳＡ 结合反应的△Ｈ一０，ＡＳ＞０，因此它与ＢＳＡ之间 的作用力可能主要是静电作用力。 食品添加剂等有机小分子与蛋白质分子之间 的相互作用位点结合数可用Ｓｃａｔｃｈａｒｄ方程 求 ，ｎｍ 得，相互作用常数（Ｋ）和结合位点数（ｎ）满足ｌｇ 图３ ＰＳＳ（１）、ＢＳＡ（２）和ＰＳＳ—ＢＳＡ体系（３） ［（Ｉ￣／Ｉ ）一１］＝ｌｇＫ＋ｎ ｌｇｃ 方程，由实验数据求 的紫外吸收光谱（３７℃） 得其斜率ｎ为分别为０．９２４（２２￣Ｃ）、０．９８６（２７ｏＣ）、 Ｆｉｇ．３ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＰＳＳ（１）， ０．９８４（３２℃）和０．９８７（３７℃），平均值为０．９７０。 ＢＳＡ（２）ａｎｄ ＰＳＳ—ＢＳＡ ｃｏｍｐｌｅｘ（３） ２．５ ＰＳＳ与ＢＳＡ间的结合部位 Ｃｕｒｖｅ １—３：ｃＰＳＳ：２．０×１０“，０，２．０×１０一 ｍｏｌ・Ｌ一 ； ＢＳＡ与人血清白蛋白（ＨＳＡ）的三维晶体结 ｃＢＳＡ：０．０，２．０×１０．２．０×１０ ｍｏｌ・Ｌ 构非常类似，有３个结构域（ｄｏｍａｉｎ）：Ｓｉｔｅ Ｉ， ２．４结合作用力与结合位点数 Ｓｉｔｅ ＩＩ和Ｓｉｔｅ ＩＩＩ，其中每个结构域可分为Ａ和Ｂ 猝灭体和生物大分子相互作用主要是通过范 两个亚结构域（ｓｕｂ—ｄｏｍａｉｎ），它们彼此以槽口 德华力、静电作用力、氢键作用力和疏水力等进 相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有的疏水性 行的。因为温度对结合常数的影响比较小，所以 氨基酸都包埋在圆筒腔内部，形成疏水腔。而 当温差不是很高时，可以把反应焓变ＡＨ。看作一 ＢＳＡ的主要键和区域就位于亚结构域ＩＩＡ（Ｓｕｄ． 个常数。因此，由Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ方程中不同 １ｏｗ’Ｓ Ｓｉｔｅ Ｉ）和ＩｌｉＡ（Ｓｕｄｌｏｗ’Ｓ Ｓｉｔｅ ＩＩ）的疏水腔中， 温度下的结合常数，可以根据热力学公式 这两个亚结构域显示了相似的化学性质。为了确 ＡＧ。＝ＡＨ。一Ｔ・ＡＳ。 （３） 定ＰＳＳ在ＢＳＡ上的结合位置，选择华法林（ｗａｒｆａ． ＡＧ。＝一ＲＴｌｎＫ。 （４） ｒｉｎ）和布洛芬（Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）分别作为Ｓｉｔｅ Ｉ和Ｓｉｔｅ ＩＩ ｌｎ（Ｋ。 ／Ｋ ）：（ＡＨ。／Ｒ）．（Ｔ１一Ｔ ） （５） 位 的标记物加入到ＰＳＳ—ＢＳＡ体系，进行位点竞 分别计算出不同温度下ＰＳＳ与ＢＳＡ作用的反 争实验。按实验方法，逐渐增加体系中ＰＳＳ的浓 应焓变、自由能变和熵变，结果见表２。Ｒｏｓｓ 度，ＢＳＡ的内源荧光有规律的猝灭（图１）。Ｗａｒｆａ— 等根据大量的实验结果，总结出了判断生物大分 ｒｉｎ加入后，ＰＳＳ—ＢＳＡ体系表现出明显不同的光谱 子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力 特征（图４一Ａ）；而Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ加入后，体系的荧光 性质的热力学规律，即疏水作用有可能使体系的 猝灭情况与未加入前基本相同（图４一Ｂ）。 ５０ｏ ５００ ４ｏｏ ４００ — ３ｏ０ ３００ ２０ｏ ２００ １０Ｏ ｌＯ０ ０ Ｏ ３ｏｏ ３６０ ４２０ ４８０ ／ｎｍ ／ｎｍ 图４位点标记物对ＰＳＳ—ＢＳＡ体系荧光・眭能的影响（３７ｑＣ） Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＳＳ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ＢＳＡ（Ｔ＝３１０Ｋ， ＝２８５ｎｍ）． （Ａ）ｃ（ＢＳＡ）＝ｃ（Ｗａｒｆａｒｉｎ）＝２．０×１０‘。。ｍｏｌ・Ｌ～；（Ｂ）ｃ（ＢＳＡ）＝ｃ（Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）＝２．０×１０ ｔｏｏｌ・Ｌ～； ｅ（ＰＳＳ）／（１０～ｍｏｌ・Ｌ ），１—８：０，２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，１２．０，１４．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 一一一 中国食品添加剂 为了更方便地比较Ｗａｒｆａｒｉｎ和Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ对 ＰＳＳ与ＢＳＡ结合情况的影响，对实验数据用Ｌｉｎ— ｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ双倒数方程（２）进行处理（见表 ２４ ｊ ３和图５）。结果表明，华法林存在时的结合常数 是其不存在时的结合常数的４８．１％，而布洛芬存 在时和不存在时的结合常数基本相同。因此可以 ｎ。 ∞ ∞ 加 １６ 加 ｍ ０ ８ 推断ｗａｒｆａｒｉｎ与ＰＳＳ竞争同一个位点，即Ｓｉｔｅ Ｉ （ｓｕｂ—ｄｏｍａｉｎ ＩＩＡ）位。 表３ ＰＳＳ—ＢＳＡ体系位点竞争实验结合常数 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ＰＳＳ—ＢＳＡ ｓｙｓｔｅｍ． 图５ ＰＳＳ—ＢＳＡ体系位点竞争实验 的Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ方程图 Ｆｉｇ．５ Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ——Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＳＳ——ＢＳＡ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ （Ｔ＝３ＩＯＫ ａｎｄ ｐＨ ７．４）．１一Ｂｌａｎｋ， ２一Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ，３一ｗａｒｆａｒｉｎ． ２．６ ＰＳＳ对ＢＳＡ蛋白质构象的影响 ６０Ｏ ５ＯＯ ４００ ３００ ２ｏｏ １ｏｏ ０ ２６０ ２８０ ３００ ３２０ ２６０ ２８０ ３００ ３２０ 图６同步荧光光谱Ａ（ ＝１５ｒｉｍ）和Ｂ（Ａ，ｋ＝６０ｎｍ） Ｆｉｇ．６ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａ（ ＝１５ｎｍ）ａｎｄ Ｂ（从＝６０ｎｍ） ｃＢｓＡ＝２×１０一 ｔｏｏｌ・Ｌ ；Ｃｐｓｓ／（１０一 ｔｏｏｌ・Ｌ’）１—８：０．０，２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，１２．０，１４．０ 同步荧光光谱可以提供荧光发射基团附近微 环境的变化信息。Ａｈ＝６０ｎｍ和ＡＸ＝１５ｎｍ时 ＢＳＡ的同步荧光分别显示色氨酸和酪氨酸残基的 合位点更接近于色氨酸残基。二者的最大发射波 长发生红移，表明色氨酸和酪氨酸残基所处环境 极性增强、疏水性降低，肽链的伸展程度增加， 构象发生变化。 ２．７三维荧光光谱 光谱特征。因最大发射波长与其所处环境的极性 有关，故由发射波长的变化可以判断蛋白质构象 的变化。一般来说红移表明蛋白质所处环境疏水 性降低，疏水结构有所瓦解，肽链的伸展程度增 加；蓝移表明蛋白质所处环境疏水性增强，ＢＳＡ 分子趋于折叠态 。按照实验方法，得到在ＰＳＳ 存在下ＢＳＡ的同步荧光光谱图（图６）。可以看 出在此实验条件下，色氨酸和酪氨酸残基发射的 荧光同时被猝灭，相比之下色氨酸残基荧光强度 降低比酪氨酸残基更显著，说明ＰＳＳ—ＢＳＡ的结 三维荧光光谱能够全面展现样品的荧光信 息，利于综合考察样品的组分分布和构象变化特 征，按照实验方法，得到了ＢＳＡ及ＢＳＡ—ＰＳＳ体 系的三维荧光光谱（见图７），由相关图形处理软 件绘出了相应的强度等高线图（见图８），并将部 分荧光信息列于表４。图中有两类峰，一类为瑞 利散射峰（图７中山脊形峰与图８中相应的铅笔 形峰对应）， ＝入 ，加入ＰＳＳ后，其峰强度增 生Ｃｈｉｎａ Ｆｏｏｄ ｄＡ ａｉｔｉｖｅｓ： ：堕 ！＝ 大，可能是形成了ＢＳＡ—ＰＳＳ复合物导致ＢＳＡ粒 结构有关。加入ＰＳＳ前，二荧光峰的强度比为 １．０１５：１，当ｃ ＝７．０×１０ ｔｏｏｌ・Ｌ 时，两荧 径增大而使散射效率增强的缘故。另一类为荧光 峰（图７中的山峰Ｐｅａｋｌ和Ｐｅａｋ２与图８中相应 的指纹图谱相对应），Ｐｅａｋｌ与紫外一可见吸收光 光峰的强度比为１．１２１：１，当Ｃ ＝１４．０×１０。 ｏｏｌ・Ｌ 时，二荧光峰的强度比为１．３９８：１，可 ｔ见ＰＳＳ对Ｐｅａｋ２的猝灭作用略强于对Ｐｅａｋｌ的猝 谱（图３）中２８５ｎｍ附近的吸收峰相对应，由 ＢＳＡ分子中色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环的订一 丌 电子跃迁所引起，与二维荧光发射光谱一样， 灭作用。加入ＰＳＳ后，两荧光峰的强度均明显降 低（见表４），同时，Ｐｅａｋｌ和Ｐｅａｋ２的发射峰波 长分别红移了１ｎｍ和２ｎｍ，进一步说明了色氨酸 与酪氨酸残基所处微环境疏水性减弱，极性增 强，ＢＳＡ内部的疏水结构有所瓦解，肽链的伸展 程度有所增加¨ “ 。 主要揭示色氨酸和酪氨酸残基的荧光光谱特性； Ｐｅａｋ２与紫外一可见吸收光谱中２２０ｎｍ附近很强 的吸收峰相对应，由ＢＳＡ分子肽键上羰基的ｎ一 电子跃迁所引起 Ｊ，与蛋白质分子中 一螺 旋含量有关，主要揭示ＢＳＡ分子中肽链结构的荧 光光谱特性，其峰的位置和强度与蛋白质的二级 表４ ＰＳＳ与ＢＳＡ作用前后三维荧光光谱的变化 Ｔａｂｌｅ ４ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ ａｆｔｅｒ ＰＳＳ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ㈦ 图７ ＢＳＡ（Ａ）及ＢＳＡ—ＰＳＳ体系（Ｂ）。（Ｃ）的三维荧光光谱 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆＢＳＡ（Ａ）ａｎｄ ＢＳＡ—ＰＳＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂ，Ｃ） ｃＢｓＡ＝２．０×１０ ｍｏｌ・Ｌ’；％ｓｓ／（１０ ｍｏｌ－Ｌ一 ），Ａ—Ｃ：０，７．０，１４．０ ＾ｅｘ ｎｌｌｌ 图８ ＢＳＡ（Ａ）及ＢＳＡ—ＰＳＳ体系（Ｂ），（Ｃ）的等高线图 Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅ ｃｏｎｔｏｕｒ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ（Ａ）ａｎｄ ＢＳＡ—ＰＳＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂ，Ｃ） ｃＢｓＡ＝２．０×１０一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ；Ｃｐｓｓ／（１０一 ｍｏｌ・Ｌ一 ），Ａ—Ｃ：０，７．０，１４．０ ［４］Ｚｈａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｇａｏ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｘ Ｘ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｏｃｔｕｐｏｌａｒ ｅｏｍ－ ３ 结论 ＰＳＳ与ＢＳＡ之间主要由静电力相互作用形成 ｐｏｕｎｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｅＹｉ３ｎｌ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｊ］．Ｍ０ｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ，２００９，３６：１４０５—１４１１． ［５］Ｒｏｓｓ Ｄ Ｐ，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｏｃｉａ— ｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｆｏｒｃｅｓ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ— ｔｒｙ，１９８１，２０：３０９６—３０９９． 复合物，荧光猝灭作用符合静态猝灭特征，结合 常数为８．４２１ Ｘ １０ ｔｏｏｌ・Ｌ～，热力学参数ＡＨ。、 △ｓ。和ＡＧ。分别为一３．５９５ｋｊ・ｍｏｌ、６３．２６Ｊ・ ［６ 曹团武，杨季冬．孔雀石绿与牛血清白蛋白的相互作用 ［Ｊ］．物理化学学报，２００８，２４（４）：７１５—７１９． ［７］Ｈｕ Ｙ Ｊ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｘｉａｏ Ｘ Ｈ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅ・ ｔｗｅｅｎ Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｍｎ Ａｌｂｕｍｉｎ『Ｊ］．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏ１． Ｋ 和一２２．７３ｋＪ・ｍｏｌ～，结合位点数为０．９７０。 ＰＳＳ与ＢＳＡ的作用位置主要在ＢＳＡ的Ｓｉｔｅ Ｉ（ｓｕｂ —ｄｏｍａｉｎ ＩＩＡ）位。在水溶液中ＰＳＳ改变了ＢＳＡ ｅｃｕｌｅｓ，２００９（１０）：５１７—５２１． 疏水腔内的微环境，使色氨酸和酪氨酸残基所处 微环境的极性增强、疏水性减弱，同时改变了 ［８］周宏，陈昌云，谢安建．光谱法研究盐酸非那吡啶与牛血清 白蛋白的结合作用［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００７，２７ （９）． ＢＳＡ的构象，使ＢＳＡ大分子的伸展程度增加。 参考文献： ［１］王箴．化工词典（第四版）［Ｍ］．北京：化学工、 出版社， ２０００：１０１２． ［９］李晓晶，王志强，陈继，等．稀土离子（ｍ）与牛血清白 蛋白作用的紫外光谱［Ｊ］．应用化学，１９９８，１５（１）：５— ８． ［１Ｏ］Ｒｏｙｅｒ Ｃ Ａ．Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉ— ｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００６，１０６： １７６９—１７８４． ［２］Ｈｕ Ｙ Ｊ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｓｕｎ Ｔ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉ—ｉｒｄ］ａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ ｃｒｏｍｏｌｙｎ ｓｏｄｉｕｍ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎ— ａｌ Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｅｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６，３９：２８０—２８５． ［１１］Ｙａｈ Ｃ Ｎ，Ｍｅｉ Ｐ，Ｇｕａｎ Ｚ Ｊ ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｅｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｍｉｄａｅｌｏｐｒｉｄ ａｎｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒ－ ［３］吴刚珂，颜承农，刘义用特征研究２】３９—２】４３ 头孢呋辛酯与牛血清白蛋白相互作 Ｈｉｌｌ Ａｌｂｕｍｉｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２５（８）：１０８５ 一［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００８，２８（９）： 】０８９． ・址 — —址—址— Ｌ — —址—址 —址 ・ 欢迎投稿！ ｌ —疗— —｝ — — —ｒ — — — —一
