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枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵培养基优化

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食品与发酵,14技 Food and Fermentation Technology 第47卷(第4期)Vo1.47,No.4 枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵培养基优化 胥海东,王永泽,王金华 (湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,武汉430068) 摘要:在摇瓶发酵条件下,采用Plackett—Bun'nan设计法和响应面分析法对枯草芽孢杆菌BDT一3菌株的培养基配 方进行优化,确定了影响BDT一3菌株发酵液含菌量的3个重要因子依次为玉米粉、蛋白胨和淀粉;对这3个因子进 行爬坡路径试验,通过响应面分析法确定了主要影响因子的最佳条件。优化后的发酵液酶活力为55.9OU/mL,相比 采用初始发酵培养基提高了11.49%。 关键词:枯草芽孢杆菌;发酵培养基;响应面法;蛋白酶 中图分类号:Q939.97 文献标识码:A 文章编号:1674—506X(2011)O4—0077—0005 Optimization of Fermentation Medium for Protease of Bacillus Subtilis XU Hai—dong,WANG Yong—Ze,WANG Jin—hua (Hubei University ofTechnology Key Laboratory fFeromentation Engineering,Ministry fEducaotion,Hubei University f oTechnology,Wuhan 430068,China) Abstract:Plaekett—Burman design and response surface analysis were used to optimize the fermentation medium of Bacillus subtilis BDT-3.Based on the results of Plackett-Burman design,important factors affecting the yield of Bacillus subtilis BDT-3 were COIIl flour,peptone,starch.Then,the three factors were further optimized using response surface analysis.the three factors were further optimized using response surface analysis.The enzyme activity after optimization for 55.90U/mL,which was 1 1.49%higher than initial medium. Key words:Bacills subtiulis;fermentation medium;response surface methodology;protease doi:10.39696.issn.1674—506X-201 1.04—021 在国内外蛋白酶研究领域中,在不同发酵工艺 下,不同菌株或同一菌株的酶活也有较大的差异,酶 活的高低直接影响着酶的应用效果。因此,提高蛋白 酶酶活的研究是很有必要的,最近几年,国内对提高 蛋白酶酶活的研究有了较大进展,卓林霞等 艮道的 枯草芽孢杆菌,其发酵酶活力可达648U/g;郭继平等 囟报道的某种米曲霉,其摇瓶酶活可达1032.94U/g。 验、最陡爬坡试验及Box—Behnken试验来得出培养 基的最优组合,最后用单因素方法优化了发酵条件, 从而最大程度地提高酶活,为后续实验中酶的应用 提供了依据。 1试验材料 I.1菌种 产蛋白酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BDT一 3菌株是湖北工业大学201实验室由B2F片烟表面 自行分离获得的菌种。 1.2原料 从报道中可以看出,菌株产蛋白酶的工艺的优化是 提高酶活的主要途径之一。 本试验先通过单因素方法对不同的碳源、氮源 进行了优化,然后采用SAS—JMP软件设计了PB试 收稿日期:2011—04—21 1.3培养基 基金项目:中国烟草总公司郑州烟草研究院项目“多菌种耦合发酵及复合酶降解烟叶纤维素及果胶质的研究” 作者简介:胥海东(1984一),男,在读硕士。研究方向:生物技术研究。 米通讯作者:王金华(1964一),教授,硕士生导师。研究方向:生物技术及生物质能研究工作。 78 食品与发酵,14技 2,011年第4期 (1)斜面培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 (2)种子培养基:玉米粉1.5%,磷酸氢二钠 0.2%,硫酸镁0.01%,氯化钙0.02%。 2试验方法 2.1菌株BDT一3的发酵培养基优化 2.1.1不同碳源对菌株BDT一3产酶影响 用4.5%的豆粕粉、牛肉膏、蔗糖、葡萄糖分别代替 出发发酵培养基中的碳源:玉米粉;然后进行摇瓶液态 发酵,每个做三组平行试验,并测定三组平行试验的蛋 白酶的酶活力,研究不同碳源对菌株的产酶影响。 蛋白酶活力测定:按文献I3I 测定蛋白酶活性。在 此反应条件下定义:每1rain生成1 g酪氨酸所需酶 量定义为一个酶活(U),三个平行样测定。 2.1.2不同氮源对菌株BDT一3产酶影响 用蛋白胨、钾、豆饼粉、硫酸铵、氯化铵、水 解酪蛋白分别代替出发发酵培养基中的氮源:酵母 粉;然后进行摇瓶液态发酵,每个做三组平行试验, 然后测定发酵液中蛋白酶酶活力,来研究不同种类 含氮物质对菌株的产酶影响。 2.1.3 P]ackett—Burman试验设计 采用SAS软件进行试验设计及数据分析。在前 面氮源和碳源优化的基础上,通过采用N=12 P 设 计,来研究产蛋白酶发酵培养基中的8个 著因素, 它们分别为玉米粉(P。)、酵母粉(P2)、淀粉(P])、硫酸 铵(P4)、NaC1(P )、氯化钙(P6)、氯化铵(P )、磷酸氢二 钠(Ps),每个因素取两个水平,蛋白酶活(U)作为响 应值,试验设计见表1。 2.1.4爬坡试验设计 根据PB试验的结果分析得出显著因素后,再 根据各个显著因素的正负效应值来确定最陡爬坡试 验路径,找出最高值,以便更快地逼近最大产酶响应 区域,为优化节约时间和降低工作量。 2.1.5 Box—Behnken试验设计 根据PB试验和爬坡试验结果,采用BB进行试 验设计研究,试验结果由SAS软件处理和分析。 2.2 菌株BDT一3的产酶条件的研究及优化 2.2.1初始pH值对产酶的影响 将发酵培养基初始pH值分别调到5.0、5.5、 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接种量约为2.0%,发酵时间为 5d,其他条件均不变,每组三个平行,测定发酵液的 酶活力,检测出不同初始pH值对产酶的影响。 2。2.2培养温度对产酶的影响 在上述优化的基础上,分别以20℃、30℃、 40%、50 、60%为发酵温度进行发酵,每组三个平 行,测定发酵液的酶活力,检测出不同温度对产酶的 影响。 2.2.3发酵时间对产酶的影响 在优化后的发酵培养基基础上,分别选择ld、 2d、3d、4d、5d为发酵培养时间,而后按2.2.1培养条 件进行发酵,每组做三个平行试验,测定发酵液酶活 力,检测出不同发酵时间对产酶的影响。 2.2.4不同接种量对产酶的影响 在前述条件情况下,产蛋白酶发酵按l%,2%, 3%,4%的接种量进行摇瓶发酵,每组做三个平行试 验,测定发酵液酶活力,检测出不同接种量对产酶的 影响。 3结果与分析 3.1发酵培养基优化 3.1.1出发发酵培养基的选择 先取用于细菌的五种发酵培养基,接种培养 3d,pH值为7.0。 (1)干酪素2%、葡萄糖4%、磷酸氢二钾0.1%、 硫酸镁0.01%。 (2)玉米粉4.5%、酵母粉2.0%、淀粉0.2%、硫 酸铵0.4%、NaCI l%、氯化铵0.13%、氯化钙0.27%、 磷酸氢二钠O.4%。 (3)牛肉膏0.5%、蛋白胨l%、酵母浸膏0.5%、 NaC1 0.5%。 (4)可溶性淀粉4%、酵母浸膏0.5%、牛肉膏 l%、蛋白胨1.5%、NaC1 0.5%、磷酸氢二钾0.53%、 磷酸二氢钠0.O3%。 (5)豆饼粉2%、麸皮3%、玉米粉4%、磷酸氢 二钠0.4%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钙0.1%、碳酸 氢钠0.1%。 由图1可知,第二组培养基产酶能力最强。第四 组次之,因此,选择第二组作为产蛋白酶的出发发酵 培养基。 50 45 40 孟35 30 皿25 鲫20 15 培养基编号 图1五种产蛋白酶出发培养基酶活比较 Fig.1 The comparison of medium activity with Five kinds of protoaso production 第47卷(是第164职) 胥海东等:枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵培养基优化 79 3.1.2不同的碳源对菌株BDT一3产酶的影响 60 ,、30 盗 : o 玉米粉 豆粕粉 牛肉膏 蔗糖 葡萄糖 碳源 图2五种碳源对产蛋白酶活的影响 Fig.2 Effect of Five kinds of carbon source on protease production 由图2可知,菌株BDT一3在碳源为玉米粉时酶 活力最高,为50.14U/mL,其次为葡萄糖,而在以豆 粕粉、牛肉膏、蔗糖为碳源时的酶活力均较低,因此, 选用的玉米粉作为发酵培养基的碳源是最合适的。 3.1.3不同的氮源对菌株BDT一3产酶的影响 由图3可知,菌株BDT一3以蛋白胨作为氮源, 其酶活力均明显高于其他氮源。选择蛋白胨为氮源 时蛋白酶产酶量最高为50.08U/mL,其次为水解酪 蛋白,再次为豆饼粉,因此,选用蛋白胨为该菌产酶 的氮源。 6O ・5O ]40 3o 20 1O O 由表2分析可知,产蛋白酶发酵培养基的显著 因素依次为玉米粉、蛋白胨、淀粉。其中,玉米粉、蛋 白胨浓度对产酶影响为正效应,而淀粉浓度对产酶 影响为负效应。为了提高产酶量,需要逐步提高玉米 粉、蛋白胨浓度,并且降低淀粉浓度。其他因素对酶 活影响不大,因此浓度不变。 表2产蛋白酶Plackett—Burman试验设计回归分析结果 Tab.2 Experimental design of Placke ̄一Burman test and results of regression 3.1.5爬坡试验设计及结果 由表3可见,随着玉米粉、蛋白胨、淀粉的变化, 蛋白酶酶活先上升后下降。当玉米粉浓度定为 4.5%,蛋白胨浓度为1.4%,淀粉为0.18%时,蛋白酶 酶活达到了最大,即以此为试验优化的中心,来进行 下一步优化试验。 表3最陡爬坡试验设计及其结果 Tab.3 Steepest ascent experiment design and results 3.1.6 Box—Behnken试验设计发酵优化 表4 Box.behnken设计各因素及其编码值 Tab.4 Design of Box-behnken and coded values of each factor 以玉米粉、蛋白胨和淀粉为显著因素,各因素设 计水平如表4所示。Box—Behnken试验设计及结果 如表5所示。 80 食品与发酵科技 2011年第4期 表5 Box—Behnken设计及结果 Tab.5 Design and Results of Box—Behnken 根据Box—Beheken设计表中玉米粉、蛋白胨、淀 粉为变量,应用SAS软件进行多元回归分析,得到 蛋白酶活力依玉米粉、蛋白胨、淀粉为变量的三元二 次方程如下: U=55.8967+0.4575 xP】+0.3475 xP,一0.3 100 xP 一 2.1008xP1xP1-1.2308xP2xP2—0.7658xP3 ̄P3—0.1200x PlxP2+0.5300xP1xP3—0.2650xP2xP3 R =98.86%.Adi.R =96.8O% 表6回归方程的方差分析 l ab.6 Analysis fo variance for the regression equation 由表6回归方程的方差分析可知,P=0.0020<a= 0.05,则该模型显著,模型拟合度R =0.98,说明该模 型在一定程度上可准确的反应响应值的变化,拟合 程度较高,失拟合不显著(P=0.143)。 :5. 2一 ; 浓度为0.178%时,响应值U达到最大,即蛋白酶酶 活为55.90U,mL。 3.1.7试验验证 为了检验模型的可靠性,在培养基优化条件下, 进行了5组平行发酵试验,所测得酶活分别为 55.62U/mL,55.97U/mL,55.80Ul,mL,56.14U/mL,55.68U/ mL,平均酶活力为55.84U/mL,与模型预测值基本一 致,这进一步表明该模型能很好地预测实际发酵产 酶的情况。 3.2发酵条件研究 3.2.1初始pH对发酵产酶的影响 E 3 一 燠 瞎 pH 1直 图5不同起始pH值对产蛋白酶活的影响 Fig.5 Effect of diferent pH on protease production 由图5可知,起始pH值低于6时,酶活力很低, 这说明该菌在偏酸条件下生长较慢;而在pH值在 6.5和7.5之间产酶活力较强,而且变化平缓,因此 确定最适初始pH值为7.0—7.5。 3.2.2培养温度对发酵产酶的影响 —J E 3 一 燠 龌 温度(LC) 图6不同温度对产蛋白酶活影响 Fig.6 Effect fo diferent temperature on protease production 由图6可见,发酵温度在20℃一50℃时,该菌产 酶活力呈逐步升高的趋势,而在50℃一6OqC范围产酶 活力迅速下降。故此,该菌发酵的最适温度为40℃一 50℃。 3.2_3 发酵时间对发酵产酶的影响 由图7可见,菌体发酵培养ld时产酶活极低, 在2d一3d产酶快速上升,到第3d左右时,酶活力达 第47卷(昆第164醐) 胥海东等:枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵培养基优化 81 58 56 54 52 足,造成发酵液中菌体代谢产酶能力较低;而接种量 约2%时产酶活基本与对照组持平,当接种量高于 2%,酶活下降,可能是由于菌体密度过大而产生竞 争抑制,导致大量菌体抱团,使得产酶活力降低。故 此,接种量确定为2%。 4小结 发酵时 J(d) 50 48 蓉4464 42 40 4.1通过单因素实验、PB实验及BB试验,确定了 该菌株产酶的最优营养条件,其组成为玉米粉 4.544%、蛋白胨1.43%、淀粉0.178%、硫酸铵0.4%、 NaC1 1.O%、氯化钙0.27%、氯化铵0.13%、磷酸氢二 钠0.4%。 图7不同发酵时间对产蛋白酶活的影响 Fig.7 Effect of fermentation time on protease production 到最大,为55.61U/mL;当继续培养酶活逐渐下降, 因此最适发酵培养时间为3d。 3.2.4不同接种量对发酵产酶的影响 4.2通过单因素实验确定了最适发酵条件,即初始 pH7.0—7.5,发酵温度40qC一5O ,发酵时间3d,接种 量为2%。 在最佳培养基和最适发酵条件下,菌株BDT一3 产酶活力为55.90U/mL,与优化前相比酶活提高了 l1.49% 参考文献 [1]卓林霞,吴晖,刘冬梅,等.枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白 酶优化试验研究Ⅲ,粮食与饲料工业,2009,(2):32-35 [2】郭继平,马光,等.响应面法优化米曲霉酸性蛋白酶的固 图8蛋白酶发酵接种量的产酶影响 Fig.8 Effect of inoculum volume on protease production 态发酵培养基[J】,中国酿造,2009,(8):125-128 【3]董晓燕,生物化学实验[M].北京:化学工业出版社,2007 【4】(德)B.施特尔马赫,钱嘉渊.酶的测定方法【M】.北京:轻工 业出版社,1992 如图8显示,当发酵培养基中的接种量为1% 时,发酵产酶活明显较低,说明培养基中生物量不 ;行业动 态 中外科学家绘制出马铃薯基因图谱 一国际研究小组近日在《自然》杂志上发表论文称,他 单。除此之外,研究人员还对另一种杂合二倍体变异马铃薯 的部分基因进行了测序。此两种马铃薯基因组图谱,将极大 地帮助科学家了解整个马铃薯家族的基因面貌。而通过对基 因数据的初步分析,科学家们已经确认了800多个马铃薯抗 病基因,这将有助于科学家培育新的抗病马铃薯品种。 苏格兰詹姆斯・赫登研究所的格伦・布莱恩博士是参与 该项目的英国科学家小组领导人,他指出,该项基因组测序 工作使科学家在理解马铃薯生物学方面迈出了重要一步, 不仅会加速培育马铃薯新品种的速度,更有助于培育出抗 病虫害能力强、营养价值高的马铃薯新品种。 詹姆斯・赫登研究所主任伊恩・戈登教授则表示,马铃 们成功绘制出一种马铃薯的基因图谱。该基因测序工作的 完成,将大大加快马铃薯新品种的繁育进程,未来的新品种 马铃薯无论是产量还是营养价值以及抗病虫害能力都将大 大提升,马铃薯也将会成为未来人类粮食安全的重要保证。 马铃薯的基因组包含39000多个蛋白编码基因,而且 是高度杂合的同源四倍体,这意味着它有四个染色体副本, 且常会变异。马铃薯基因图谱的复杂性使得该作物的基因 测序工作一直没有很好地开展。为了更好地推动马铃薯研 究,2006年,来自l4个国家的29个机构联合成立“国际马 铃薯基因组测序协作组(PGSC)”,其中包括中国农业科学 院蔬菜花卉研究所、深圳华大基因研究院等。 研究人员使用最先进的基因测序技术,对一种产自南美 洲的栽培种马铃薯进行基因测序。虽然该种马铃薯与超市常 见的马铃薯十分相似,但其基因组是二倍体基因组,相对简 薯是世界上最重要的非谷类作物,尤其对发展中国家来说 更是如此。2050年全球人口预计将达到90亿,对粮食的需 求极大。马铃薯基因图谱的绘制,有助于提升马铃薯的产 量,这会更好地保证未来的粮食安全。 

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