中国药师2013年第16卷第6期ehinPhamraeis,2013,Vol.16No.6药学进展SNP基因分型检测技术及应用进展杨春晓张玉师少军(华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科武汉4302)关键词单核普酸多态性;基因分型;进展中图分类号:即68文献标识码:A文章编号:1008拱gX(2013)06刁811一6单核昔酸多态性(singlenueleotidepolymor-段长度多态性(restrietionfargmentlengthpolymor-phisln,SNP)是人类最普遍的遗传变异形式之一,指phism,RFLP)及简单序列重复(simplesequeneere-在基因组水平上由单个核普酸变异所引起的DNApeat,SR)之后的第三代遗传标记被越来越广泛的序列多态性SNP即指在种群中发生在给定的遗传应用于疾病遗传学!药物基因组学及生物多样性分区域内且频率最小为1%的核昔酸变异SNP广泛析中日益增多的研究也证实众多疾病的发生!进存在于人类基因组中,平均每500到1000个碱基对展与特异性基因SNP密切相关,研究两者的关系及中就有1个,目前发现其总数已达3700万: 爪随阐述其基本原理将有助于相关疾病的筛查!诊断!预着人类后基因组时代的开始,SNP作为继限制性片防及治疗{ ∀另一方面,利用SNP作为遗传标记阐基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:81273591);湖北省白然科学基金资助项(编号:2009CDB380);中央高校基本科研业务费专项资金资助(编号:201IJc039)通讯作者:师少军Tel:(027)85726073E一:1!ail:sj5lli#,1@163.con!众父久交久久久久二久交交久交交众公交交众久久父久众交久交久久久久父交交交众久交交众久久交交交久久久久交久久久父久久父久久众久久久久久久交交交久久久久久久久父会久众久久久久久会交久公久久(Pseudolyeorine)=rs.4Hz),3.19!3.41(ZH,m)以上数据与文2.2.10化合物10无色针晶,mpZlo一212∃献[ 报道基本一致,故鉴定为N一去甲基加兰他敏FAB一MSm/抖85[M+MNBA+l%+!332仁M+l%+(N一Demethylgalanthamine),H一NMR(DMso一d,sooMHz):2.39(3H,s,一NCH),3结论3.46(3H,s,一OCH),6.49(IH,s),6.85(IH,s),化合物3!8为首次从忽地笑中分离得到5.60!6.14(ZH,ABq),4.64!4.95(ZH,ABq),4.13参考文献(IH,br.t),5.89(ZH,s),2.86(IH,s),3.29!2.68(ZH,ABq)以上数据与文献(6服道基本一致,故秦卫华,周守标.石蒜药用价值{J%.植物杂志,2003;(3):28Abdallah,0.Min:alkaloids[ormLyoo∋5san即snea仁J].Phylo-鉴定为漳州水仙碱(Tazettine)ehom砧z叮,1995,39(2):477碑782.2.11化合物11无色针晶,mpZ12一214∃Kobayas}115,YuasaK,lmakuray,etal.Isolatio一1ofo一Demethyllyc(卜FAB一Msm/2274&M+一%十 H一NMR(DMso一d,arnlineformbulbsofLyeori!ladiata仁J].ChemPharnlBull,1980,500MHz):2.46(3H,,一NCH3),6.69(IH,d,J二28(11):3433一3436YangY,HuangSX,ZhaoYM,eral.Alkaloidsformthebul卜)5ofLy-8.12Hz),6.64(IH,dJ=8.12Hz),5.12(ZH,m),e∋,ri,aurea仁J%.Hel诫icaChimioaActa,20)(5,88(9):2550一5534.40(IH,br.s),4.16(IH,m),4.10!3.76(ZH,dd,JSeaoftr}一CE,Willian一5GS,TintoWF,AlkaloidsfornlHymerloeallis=一5.4Hz),3.19!3.38(ZH,m)以上数据与文tt,l,illora仁J].F蒯erraia,1998,69:7一12献!7一报道基本一致,故鉴定为O一去甲加兰他敏(o-洪山海,马广恩.石蒜科生物碱的研究m.紫花石蒜和其它两种石蒜中的生物碱及新生物碱紫花石蒜碱)JI.药学学报,!964,1De,:,e山ylgalar.l}lamine)(I):1一142.2.12化合物12无色针晶,mpl56一157∃K(一bayasllis,151一ikawaH,KiharaM,etal.lsolationof刃一Demethylga-FAB一MSm超74&M+一]∋ H一NMR(DMso一d,la,lthanlinefornlthebulbsofCrinu:,1aialioumvar.japanieumbaker500MHz):3.84(3H,s,一OCH3),6.73(IH,d,J=[JJ.ChelnPharmBull.1976,24(10):2553一2555aLbrafiaJ,ChoyG,SolansX,e∗al.I-Akaloids绪ormNareissusb川ei8.12Hz),6.65(IH,dJ=8.12Hz),5.12(ZH,ni),(A:n柳Ilidace,))J].尸勺望五emist,1999.50(I):一83一1584.40(IH,br.s),4.20(IH,m),4.10!3.76(ZH,dd,J(2012一12一14收稿2013一3城碎修回)J7丫 zgys.0诺药学进展因检测系统可在smin内完成96/384个样品的突变检测1.1.2动态等位基因特异杂交(dynamieallele-明基因多态性对机体因素!药物效应尤其是不良反应的影响也迅速成为临床医学!药物基因组学等相 关领域的焦点,对临床上个体化用药!减少药物不良反应具有革命性的意义{ ∀因此,发展稳定!快速! 灵敏!经济!高通量且可靠的SNP基因分型技术至关重要近年来,SNP基因分型技术不管是在新技specifichybridization,DASH)其原理是将PCR产物与标记有荧光染料的寡核昔酸探针杂交,荧光染料可特异性地插人DNA双链中,在激发光的作用下术的研究还是在其应用进展方面都取得令人瞩目的进展,临床检查SNP对实施个体化给药具有重要意 义,本文就近年来SNP基因分型技术的研究进展及应用前景介绍如下1等位基因识别原理SNP检测方法可分成两部分,即SNP特异位点的识别及数据的检测分析目前识别SNP的原理主要是基于等位基因特异性杂交!引物延伸!寡核昔发出荧光,单链DNA中则无此作用在DASH仪中,96孔板持续缓慢升温,伴随温度升高到变性温度时,荧光强度迅速减弱,存在错配碱基的异源双链的变性温度低于不含错配碱基的同源双链通过检测DNA双链荧光变化来确定P仁R产物的变性温度,从而检测基因变异其具有快速!准确!高通量!自动化程度高等优点,但对PCR扩增产物要求高,仪器设备复杂1.1.3基因芯片技术(genechiPs)基因芯片亦称DNA芯片,系指将大量的寡核昔酸探针高密度地集成在硅片载体上,形成多重寡核昔酸微阵列,通过与标记样品进行杂交,利用寡核昔酸与不同靶序列变异配对的杂交稳定性的不同导致杂交信号的差异来 酸连接反应以及侵人切割等4方面来实现1.1等位基因特异性杂交其原理为短的核昔酸探针与目的片段进行杂交时,根据完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体的热稳定性不同而将SNP位点检测出来DNA双链稳定性差异越大,检测的特异性就越高基于此原理已发展了多种SNP检测技术,传统方法主要有 进行检测的方法基因芯片由于高通量等优点在SNP检测中被大量应用,目前已有多家公司开展相关研究,如美国Afrmetrfix公司的GeneChipMapping500KArray可以检测500000SNP位点其开发的53芯片将PP53基因的全长序列及已知突变的序列制成探针集成在芯片上,可对P53基因突变相关的癌症进行早期诊断ReseachGernetics公司开发的集成有1500个SNP的DNA芯片涵盖了人类基因组全部24条染色体,检测时只需0.5林g的DNA样等位基因特异性寡核昔酸杂交反应(ASO),由于杂交过程中非特异性杂交常导致分辨率不高,从而导致假阳性及假阴性结果发生,因而已不多用实验室往往采用修饰过的核昔酸探针与样品DNA杂交,如引人一个错配碱基!PNA探针!LNAS探针!分子信标(moleelularbeaeons)!蝎状探针(seorpionprim- er)[4∀以及在此基础上的二聚体蝎状探针(d叩lexse甲ip五mer)L ∀等,均可提高杂交的特异性目前应用的较多的主要有基因芯片!动态等位基因特异杂交(DASH)!Taqman探针技术等此外,Quan- tmQbueadTM法将微球阵列技术与等位基因特异性杂交联合应用,实现了对sNP多重检测(6∀1.1.1HRM)高分辨率融解曲线(highresolutionmelting,HRM是在PCR基础上通过实时监测DNA品就可进行1次全基因组的扫描,但其成本较高除了基因芯片,蛋白芯片对免疫遗传学基因图谱也具有重要作用免疫芯片技术开发了集成有000200个SNP的基因芯片,且所需成本较小[8]1.1.4Taqman探针技术其原理为在Taqman探针的5 端和3∋端分别标记一个荧光报告染料和淬灭物质,正常情况下,报告染料发出的荧光被淬灭物质被淬灭,但当探针与扩增产物模板结合后,DNA多聚酶将探针5∋端荧光报告染料从探针上裂解出双链融解曲线变化来检测突变的新方法,将标记有荧光染料(仅结合双链DNA)的PCR扩增产物在一定的温度范围内进行变性,使DNA双链逐渐解链,荧光染料从局部解链的DNA分子脱落,荧光信号下降存在错配碱基的异源双链的变性温度低于不含错配碱基的同源双链,通过实时监测双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况即荧光强度来判 来,荧光报告染料一旦与淬灭物质分离即发出特有的荧光如果探针与模板存在错配碱基,即会影响DNA多聚酶的3 外切酶活性,导致释放荧光强度变弱通过测定荧光强度,来确定sNP的分型l )Taqman技术可以实现高密度的基因型SNP检测,速度快,但成本较高,定量时受酶性能的影响,目前该类技术应用广泛1.1.5CveleavePCR法CyeleavePCR法是一种断sNP[7%HRM因特异性高!高通量!成本低!操作简单及可闭管操作等优点而被广泛应用,美国Jdaho开发的Lightscanner高分辨融解曲线基因突变/基J丫沪 中国药师0123年第16卷第6期ChinaPharlnaeist2013.Vol.16Nu高特异性的变异检测方法,能够高效率地检出目的司的Gelome肠1)SNPstream将多重PCR技术与荧光基因Cychng探针是由DNA和RNA构成的杂合探针,一般为12个碱基左右,其5∋端标记荧光物质,3∋端标记淬灭物质,当探针与扩增产物杂交后,RNaseH在RNA部分切断探针,荧光物质发出荧光,通过测定荧光强度,能够实时监测扩增产物量如果探针的RNA部分或与RNA部分相邻的2一3个碱基与模板不互补,RNaseH就不能在RNA部分 将探针切断CyeleavepCR法在SNp分型解析方面具有强大的优势Yokotat o{等建立了利用eyeleavePCR法快速!准确地对结肠癌患者KRAS/BRAF基因分型的方法1.2引物延伸法标记的单碱基延伸分型技术结合,同时引人液相芯片杂交技术,在特制384孔板的每个微孔中可分析12个或48个SNP位点每天可检测多达3赵刃,(众)个SNP位点分型准确性可超过99%APEX反应是近年来发展的以DNA芯片为固相支持物,以CPE应为基础的检测手段,可对SNP位点多重检测1.2.2焦磷酸测序反应(pyrosequeneing)Pyrose-反qeuncing指一种基于引物引导的多聚酶延伸下的核酸合成的DNA测序方法dNTP(dNrPS!d竹P!dcTP!dGTP之一)在DNA聚合酶的存在下与模板配对,进行引物延伸反应,并释放出等量的焦磷酸集团,焦磷酸基团与反应底物APS在ATP硫酸化酶的催化引物延伸法通过加人不同类型的dNTP或dNTP进行延伸反应,在延伸产物中引入等位特异性核普酸,并依赖DNA聚合酶特异性来分辨碱基多态性位点根据探针是否为特异性可分为常规引物 延伸法(eommonprimerextension,CPE)和特异性弓1下形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号,并通过发光计的实时监测来检测ATP及未进行模板配对的dNTP由三磷酸腺昔双磷酸酶降解并最终形成dNMPS,碎灭光信号并再生反应体系然后加人下一种dNTP,继续反应焦磷酸测序技术对DNA序列的读序长度有限,通常可确定1个模板的20一30bp,改进后也仅可使读序长度增加一倍左右但其具有操作简单!通量高!反应特异性高!测 物延伸法(speeifieprimerextension,SpE)两类,前者主要有单碱基延伸技术(SBE)和焦磷酸测序(Pyro-sqeuencing)技术,后者包括等位基因特异性延伸法1.2.1单碱基延伸技术又称微测序法(minisequeneing),系基于引物单碱基延伸产生的检测方法经典CPE为PCR扩增后进行微测序反应,序准确度高!自动化程度高等优点,被广泛应用于DNA序列分析!遗传变异检测!SNP基因分型等领域1.2.3等位基因特异PCR(allele一speeifiepCR,AS-PcR)As一PcR技术也称为扩增阻碍突变系统(ampliieationreffraeto口mutationsystem,ARMS),利 加人检测引物,其3 末端碱基紧连SNP位点并在DNA聚合酶作用下进行延伸反应延伸引物可用多种检测技术来检测,如质谱分析法!变性HPLC法!荧光信号分发法等质谱检测技术方面主要有基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI一OFT)基因分型技术,该技术基于引物延伸法与质谱检测技术结合来进行SNP检测,具有快速!可靠!自动化程度高及高通量等优点,是目前测定SNP最准确的平台之一,具有广阔的应用前景利用该技术的方法主要有Pin- oint法!SPC一PSBE!GOODassay!MassEXTENDTM!用包含SNP位点的PCR引物特异性扩增,通过凝胶电泳等方法检测扩增产物的有无从而确定基因型中SNP其优点是快速!简便!经济传统方法由于特异引物的稳定性较差且容易导致非特异性扩增而没有被大量用于SNP的检测中目前主要通过改进以增加引物的特异性,包括在特异引物中引入人为错配碱基或增加阳性对照引物,应用巢式PCR进行SNP分型的方法该技术与毛细管微微列阵凝胶电泳(MADGE)技术结合可实现SNP检测的高通量[+)Tag一hTM是近年来发展的,基于荧光标记微 Mas!arrayTM等其中G00Dassay通过化学修饰去除了纯化的步骤,大大节约了检测成本(∋ ,+∀MassarrayTM法将MALDI一TOF同DNA芯片技术相结合,可提过通量,可快速进行基因型分析,减少成本,更适合大规模的sNP筛查[+,4 ∀,如美国Sequenom公司的球来捕获特异性标记延伸产物,并运用流式细胞仪来检测SNP的方法,具有高灵敏度,多重检测以及高通量等优点[∋6]King红+}等应用Lunline!Tag- SequenomMassARRAY可设计多达40重的基因型检测基于荧光检测方法主要有SNaPshot法!ltTM系统对细胞色素P4502C9即CY咫Cg,2!CYPZCg*3及维生素K环氧还原酶VKORCI1639/3673SNP快速分型,准确度高达99%].3寡核普酸连接反应()]igoneleotide11别tiona#!--SPNstearm!APEx反应等目前已发展了多种商业化产品美国ABI的MultiplexSN护shot瓦t基于引物延伸反应和荧光偏振原理的方法,可实现ro个SNP位点同时扩增!同时检测美国BeekmanCoulter公say,OLA)OLA技术是基于以下两步来完成的,首先进行∋JZ少Wwwzgysorg药学进展PCR扩增然后荧光标记,将扩增产物杂交并利用荧PCR扩增,将扩增产物变性为单链DNA,然后加人两条互补于待测SNP位点一侧序列的等位基因特异性探针和一条互补于待测SNP位点另一侧序列 光检测技术检测} +一22}MIP法具有灵敏性高!测定准确!通量高等有优点,适用于大规模SNP分析,可同时检测超过10000SNP1.4内切酶酶切技术的公共探针,在DNA连接酶的作用下,与目标DNA单链完全互补的ASO和LSO发生连接反应,连接反应只有在完全互补的情况下才能发生,特别是在3 限制性内切酶是一种可识别DNA特异位点,并在特异位点进行切割的酶类,其对特异DNA位点的端互补配对要求很高,如果存在错配则不会发生连接反应连接产物变性后作为探针的模板进人下一个循环 切割可产生特定相同的片段序列,当存在SNP时,碱基的替换可产生或消除限制性内切酶的位点从而使酶切产物的大小及数目存在差异基于酶切技术主要有PCR一限制性片段长度多态性(PCR一RFI刁P)!PCR一PIRA(PCR一primeri;!trodueedrestrietionanaly-1.3.1连接一滚环扩增技术(ligati(nr∀ollingeireleamplifieation,L一neA)该方法通过滚环技术与OLA技术相结合来检测碱基多态性位点,在连接酶的作用下,与目标序列完全互补的一对等位基因特异性开环探针OCP的5∋端和3 端发生连接反应,形成闭环的寡核昔酸链,然后引物RCAI和RCAn分别与闭环DNA序列退火,并在DNA聚合酶的作用 515)!引物人浸技术(invadeassay)及UCAN等PcR一RFLP为一种传统方法,拥有较成熟的技术,其操作简单!快速,但酶切位点的选择较复杂!缺乏效率,难以实现高通量检测,且对没有引起限制性酶切位点改变的sNP难以检测,changl+洲等构建了SNP一RFLPing及在此基础上进一步优化的SNP-下进行等温延伸反应RCA引物I的两端分别标记荧光剂和碎灭剂,当它与OCP形成双链时,荧光剂与碎灭剂分开而释放荧光( ∋;也可对RcA引物RFLPingZ数据库以用于PFLP关联研究及数据处I不作荧光标记,将RCA产物与荧光探针杂交后进行检测 1.3.2SNplexTM技术(SNplexgenot冲ingsysten,)理PcR一IRA可通过设计包含特定酶切位点的错P配引物来进行限制性内切酶酶切应用较广泛的为引物人侵技术和UCAN等1.4.1引物入侵技术(invaderas!ay)此反应中需是基于复合扩增及荧光检测的以寡核昔酸连接反应为特点的新型SNP检测技术检测原理如下:在dATP存在的条件下,连接酶将DNA模板与包括两个等位基因特异探针ASO和一个位点特异探针要两种探针,一对等位基因特异性探针和位于待测SNP位点上游的人侵探针,两种探针均与目标序列互补杂交,且等位基因特异性探针的5∋端和人侵探针3∋端在SNP位点处重叠,形成一个两叉状的折叠结构复合物,该结构可被特异切割酶识别并将等位基因特异性探针的5 端重叠部分切除被切除的5∋端常带有荧光标记,当它与共存的碎灭剂分离后可释放荧光,通过检测荧光信号来检测SNP,该技术也可用质谱分析来检测此方法操作简单,不依赖于PCR扩增,可直接从基因组DNA进行检测,消除LO的3个探针部分通过磷酸二醋键连接生成一条S半闭环结构的寡核昔酸链,再经酶切处理得到纯化的模板DNA连接产物,使用生物素标记的PCR引物扩增该连接产物,扩增产物结合到链霉素亲和素包被的杂交板孔中,通过碱变性的方法使生物素标记的单链PCR产物保留在杂交板中,然后与可与连接产物中等位基因特异性探针上zipCode序列严格互补的zipchute探针杂交,这些探针带有荧光标记,还包含有修饰部分,一条zipchute探针对应一个了PCR引人突变导致的假阴性的因素,但对DNA模板的需求量较大目前改进方法有固相插入切除法,在固相中进行人侵反应,减少对DNA模板的需待检测等位基因除去多余探针,将杂交捕获到iPzchute探针洗脱下来进行毛细管电泳,通过Gene-Mapper软件进行分型检测&∋,{1.3.3分子倒置探针技术(moleeularinversionprobe,MIP)分子倒置探针最初名为挂锁探针,由7个序列部分组成,包括2段目的DNA互补序列,2 求,该方法可从ng级的基因组DNA中实现SNP检测(+伙也有方法在两种探针重叠处引入一个错配碱基来提高SNP的检出率目前还建立了引物人浸技术与DNA芯片技术相结合的高通量SNP分析方法段通用引物序列,l段特异性标签序列,以及2个内切核糖核酸酶识别位点该技术应用修饰的分子挂锁探针,反应中探针通过连接反应形成一个环状的1.4.2UCAN此法采用插入一段RNA的DNA作为聚合酶反应的引物,引物的3∋端被化学集团封阻,当目的DNA和引物中的RNA完全配对时,RNaseH可切除引物中的RNA部分而去除3∋端的寡核昔酸链,再经酶切处理直线化得到倒置探针,J丫/ 中国药师0123年第16卷第6期ChinaPhallllaeist2013.Vol.16N).化学封阻,此时DNA聚合酶的延伸反应得以进行,而当目的DNA和引物中的RNA配对出现错配碱基时,RNaseH便不能切除RNA部分,此时延伸反应便不能进行根据延伸反应的进行与否可实现对SNP的检测1.5其他方法2等位基因检测方法目前已发展了多种特异性SNP检测方法,包括荧光检测!质谱检测!微球阵列技术!凝胶电泳!DNA芯片!HPLC检测!及平板读数仪等基于荧光信号检测的原理主要包括两种:荧光共振能量转移和荧光偏振荧光共振能量转移是基于荧光剂的发射光谱与碎灭剂的吸收光谱相互作用而进行荧光检测的技术平台,已成功应用于多种SNp检测方法,如TaqMan技术!蝎状探针!Cyeleave除上述方法外,目前应用较多的方法还有PCR- 单链构象多态性分析(single一strandeonformationpol- ymo甲hism,pCR一SSCp)!BeadArrayTM!变性高效液相色谱(denaturingHighperorfmaneeLiquidChron!a-tograph,DHpLC)等pCR一SSCp原理为序列不同的DNA单链片段空间构像不同,从而导致其在非变性聚丙烯酞胺凝胶中电泳时电泳迁移率的差别来实现PCR!分子信标技术!滚环扩增!引物人侵等荧光偏振是指荧光分子受平面偏振光激发后可发出偏振的荧光,发出偏振光的程度与荧光分子的大小成比列,通过监测荧光分子的荧光偏振检测荧光分子分子量的变化荧光偏振已被成功应用于引物延伸对SNP的检测该法简便!快速,但是检出率较低,只适用于SNP的初筛将SSCP与杂交双链分析法结合可大大提高其检出率 BeadArrayTM即微球阵列技术,又称为悬浮阵法!aqMaTn技术!引物入侵技术等检测方法中与荧光共振能量转移相比其不需使用碎灭基团,因而可大大降低成本荧光检测是目前SNP检测方法中最为常用的检测技术,具有自动化程度高!可实时列技术,是将探针固定在微球表面的技术,它同DNA芯片通常作为大规模高通量的基因分型检测方法的代表,该技术核心为用荧光染色法编码微球,通过调节两种荧光染料的比例来获得100种颜色不同的微球,然后将特定生物探针共价结合到不同颜 色微球表面形成微球阵列,将带有荧光标记的PCR产物与微球阵列进行特异性杂交,然后从反应液中监测等优点质谱检测技术的基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子间的荷质比的差异来分离并确定分子量目前常用方法为MALDI一TOF质谱技术,其代表方法主要有pinpoint法!SpC一SBE!Go0Dassay!MassarrayTM等凝胶电泳!DNA芯片!平板读数仪等也被广泛用于SNP检测,其中Nanochip电子微阵分离出微球,通过激光流式仪鉴定微球颜色来判断SNP类型 列技术大大缩短了杂交反应时间,极大提高了检测灵敏度和特异性3SNP检测意义DHPLC也称为温控高效液相色谱法(TmH-PLC),其利用在部分加热变性条件下同源!异源双链DNA解链特征的差异而实现变异检测,目的片段PCR扩增后,在部分变性温度下形成包含错配位点SNP标记已被广泛应用于疾病遗传学!法医生物学!药物基因组学以及新药开发等众多学科研究的杂合异源双链,由于异源双链DNA较同源双链DNA在相同的部分变性条件下更易变性,因而与固定相亲和力弱,故在DNA分离柱上保留时间短,易中,目前发现人类的许多疾病如乳腺癌{ ,!结肠癌!阿尔茨海默病!风湿性关节炎!2型糖尿病等都与SNP有着直接的联系因此,对于SNP的检测在疾被洗脱从而在色谱图上表现为两个或多个色潜峰DHPLC自动化高,可自动取样,并且能够纯化DNA片段,检测变异敏感性及特异性高达%%-病遗传学尤其是病理研究及临床诊断!治疗等方面具有重大意义随着大量疾病相关基因的发现,SNP检测将在疾病的诊断与治疗方面体现出非常重00%,更适用于低频率变异型的检测而同时选多个1温度条件进行分析还能进一步增加变异检出率但是,DNA分离柱非常精密,对PCR试剂及样品均有较高要求,所需费用较高此外,它只能检测到sNP的有无,无法确定SNP碱基突变情况及其所在位要的价值另一反面,越来越多的研究证实遗传多态性与机体对药物敏感性存在关联,遗传因素对药物的影响以及不同个体对药物反应性的差异对新药开发!药物的筛查与优化将具有很重要的引导意义此外,由于SNP稳定性强!突变率低,种族频率差异性强,在个体识别!种属识别!外形推断!地域区别等方面具有巨大的潜力,且与现有法医学S了,R相比,置,因而还需进一步的测序鉴定目前,随着DH-PLC功能被不断的开发和拓展,该技术也被不断的改进完善,主要为提高分离柱的分离性能,改善检测信号的强度与质量等其扩增片段短,在高度降解及微量检材的检定方面更具优势,因而有望成为法医实践中个体识别!DNAJZ夕 W!!wzgys.org药学进展11SauerS,肠ehnerD,BerlinK,etal.f ullflexibilitygenotyping∋)f 鉴定!刑事侦破的重要工具(+14结语与展望 singlenu∋leotidepolym呷hion!5by一hoCOOI)a!say)J].N二le,AoidSRe∋,2#洲X),28(23):El()X12Sa一lers,(;utlG.Ex一el一sionoftheG00Dassayfi)r罗notyl一1119sitlgl尸作为第三代遗传标记,SNP具有数量多!分布广!易于分型!便于检测且稳定性强等特点,其在疾病基因定位及关联研究!个体识别!个体疾病易感性!药物不良反应以及生物进化等研究中发挥着越来越重要的作用,尽管目前已发展了多种高效!稳定!经济的SNP基因分型技术,但仍远不能满足实际应用研究的需要,对此需要不断改进现有技术并开发新的方法当前,绝大多数SNP基因分型技术是基于PCR基因扩增后进行等位基因分型检测来 nu(leoti(lepolymo甲hismsbyn一atrix一ssistedla犯rdeso印tio可一a(一:一za- tionmass!peetromet叮)J].凡护∋dconounM记,占52祀ctom,2003,17:1265一1272 13CashmanJ,ZhangJ,LeushnerJ,e∋al.POp一lationdistribuli川.,fHumanflavin一eontainingmonooxyge:一aseforlll3:genepolymo甲hi*一11!(J−.Dr鳍Mla6olD即oes,2001,29:1629一163714TangK,OpalskyD,AbelK,etal.Singlepolymorphismanalyses卜)y MALDI一TOFMS仁J∀.InleratJMa占n551洲三etro,tr,20)3,226:37石4(巧陈吉宝,景蕊莲,员海燕,等.等位基因特异PCR技术的研究与应用[J∀.植物遗传资源学报,20(场,6(4):46947316BortolinS,BlaekM,Mo(liH,以∋:1.Analytiealvalida一tionof一卜let雌-ithigh一thr一)ughpurmi(fospherre一jalsedur一iversalarorfmygenotyp一ingplat- 实现的其主要的限制因素为PCR扩增步骤阻碍了高通量的发展,一些不需PCR扩增步骤的新技术如单分子DNA测序技术(如纳米孔测序!碳纳米管序列分析)在SNP基因型及单体型的分析上的优势便显而易见随着相关科学技术的深人研究,越来越多的高效!经济!高通量的SNP检测方法将不断为现代科学研究提供技术基础参I2:applieationtothemultiplexdeteetionofapanelofth八)mbophil- ia一ass!iatedsingle一nueleotidepolymorPhisms[J1.ClinChem,2(X科,50:2028一03617Ki一19CR,Porche一SorbetRM,CageBF,etal.Peromlan(∀feofco一1- Inercialplaiorfnlsfi)rrapid罗nolypingofpolymo甲hismsalfeetingwa卜 arindose)J].AmJCflinPathol,2()8,129(6):876一83X18QiXQ,BakhtS,DevosKM,tal.L一RCA(11护tion一olling01二leramplifi.alion):a罗neralmethodforgenorypingOfsinglenueleotide考文献 M面anAJ.Moleeulargenetiestudiesof00呷lexphenotypes)J].乃,IR,,2012,159(2):64一9CrawfbrdA,FassettRC,Ge哪htyDp,etal.Relarionshipsbetweensinglenueleotidepolymo甲hismsOfntioxidantenzynlesanddise韶eapo1ymoI)I hism,(SNPs)[J∀.NucleicAei山而,2()l,29(22):68-X7491于子辉,李彩霞,季安全,等.SNPlex系统检测方法及在法医遗传学中的应用前景)J].刑事技术,2008,3:41书20WangY,CottmanM,Sehi仰hlanJD.Moleeularr一ovelmi(,r()a附yreehnolo罗anditsapplieati∋)n 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