一种血液游离DNA的保护剂[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109055353 A(43)申请公布日 2018.12.21

(21)申请号 201810782686.2(22)申请日 2018.07.17

(71)申请人 无锡百泰克生物技术有限公司

地址 214171 江苏省无锡市惠山区经济开

发区惠山大道1719-5四层A区(72)发明人 周志图　

(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所

(普通合伙) 32204

代理人 张南南　肖明芳(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图3页

(54)发明名称

一种血液游离DNA的保护剂

(57)摘要

本发明公开了一种血液游离DNA的保护剂，包括以下组分，咪唑烷基脲；金精三羧酸；甘油醛；氟化钠；乙二胺四乙酸盐；甘氨酸；水。本发明提供的用于保存血液游离DNA的保护剂，能够在室温条件下稳定保存血液中游离DNA长达28天，模拟运输条件下能够稳定保存14天，避免游离DNA降解，同时特有的保护剂成分能够抑制溶血及白细胞破裂，降低溶血现象和基因组对下游游离核酸实验灵敏度的影响。

CN 109055353 ACN 109055353 A

权　利　要　求　书

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1.一种血液游离DNA的保护剂，其特征在于，包括以下组分：咪唑烷基脲、金精三羧酸、甘油醛、氟化钠、抗凝剂、甘氨酸和水。

2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，以1L计，所述各组分的含量为：

3.根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于，以1L计，所述各组分的含量为：

4.根据权利要求3所述的保护剂，其特征在于，以1L计，所述各组分的含量为：

5.根据权利要求1-4任意一项所述的保护剂，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾中的任意一种或几种的组合。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂和待保存样品的体积比为1:10-80。

7.权利要求1-4任意一项所述的保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将配方量的咪唑烷基脲、金精三羧酸、甘油醛、氟化钠、抗凝剂、甘氨酸加入一部分配方量的水中溶解，然后用剩余的水定容至1L，室温放置1-7天，滤膜过滤，即得。

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CN 109055353 A

说　明　书

一种血液游离DNA的保护剂

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技术领域

[0001]本发明涉及游离DNA保存液，具体涉及一种血液游离DNA的保护剂。

背景技术

[0002]游离核酸作为新型的医疗诊断标志物，与肿瘤学、产前遗传学诊断的发展有着非常密切的联系，研究发现，健康血浆样本中只有极少量的cfDNA(约5-30ng/mL)，外周血cfDNA水平的增加与许多临床疾病发生有关。在遗传诊断领域，通过采集孕妇外周血，并提取血液中游离脱氧核糖核酸(cfDNA)并进一步分离出游离的胎儿脱氧核糖核酸(cffDNA)，结合下一代测序技术(NGS)和相关生物信息分析，对胎儿的遗传信息进行分析达到无创产前诊断的目的。常规条件下，通常采用含有抗凝剂采血管进行新鲜血液采集，但在储存和运输过程中，血液中有核细胞容易破碎并释放出细胞基因组DNA及其他成分，导致血浆中游离DNA成分受到污染，或者受到核酸酶介导的降解等影响。[0003]现有采血管主要分为两类，一类是仅含有抗凝剂成分，如EDTA、肝素、枸橼酸钠等成分，虽可以防止血液凝集，但并没有抑制细胞破裂的作用，因此只能在采血后短时间内(6-48h)分离血浆，提取游离核酸保证其不被降解，且背景基因组干扰较小。由于没有防止细胞破裂的保护剂，并且要求分离血浆时间较为苛刻，因此此种方法不适用于边远地区的血液采样和运输。另一类采血管包含了抗凝剂以及细胞稳定剂，但含有甲醛成分，虽然甲醛能够在较长时间内固定细胞不破裂、保护血液不变质，但游离的甲醛会导致DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质、DNA与DNA之间的交联，同时有可能使核酸甲基化和磷酸二酯键断裂，从而影响提取和检测效果。

发明内容

[0004]发明目的：为了解决现有游离DNA保护剂中含有甲醛成分，影响提取和检测效果的问题，本发明提供了一种血液游离DNA的保护剂。所述游离DNA为cfDNA。[0005]技术方案：本发明所述一种血液游离DNA的保护剂，包括以下组分：咪唑烷基脲、金精三羧酸、甘油醛、氟化钠、抗凝剂、甘氨酸和水。[0006]其中，咪唑烷基脲作为防腐剂和稳定剂，保护血液在室温或37℃环境下不变质，提供醛基；金精三羧酸用于抑制细胞代谢；甘油醛作为防腐剂；氟化钠作为酶抑制剂；抗凝剂用于抑制血液凝固；甘氨酸用于猝灭游离醛基。[0007]优选地，以1L计，所述各组分的含量为：

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说　明　书

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[0008]

[0009]

更优选地，以1L计，所述各组分的含量为：

[0010]

[0011]

最优选地，包括以下组分，以1L计，所述各组分的含量为：

[0012]

优选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾

中的任意一种或几种的组合。[0014]优选地，所述保护剂和待保存样品的体积比为1:10-80。[0015]本发明第二方面提供所述的保护剂的制备方法，包括以下步骤：将配方量的咪唑烷基脲、金精三羧酸、甘油醛、氟化钠、抗凝剂、甘氨酸加入一部分配方量的水中溶解，然后用剩余的水定容至1L，室温放置1-7天，滤膜过滤，即得。[0016]有益效果：本发明提供的用于保存血液游离DNA的保护剂，能够在室温条件下稳定保存血液中游离DNA长达28天，模拟运输条件下能够稳定保存14天，避免游离DNA降解，同时特有的保护剂成分能够抑制溶血及白细胞破裂，降低溶血现象和基因组对下游游离核酸实验灵敏度的影响。

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[0013]

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附图说明

[0017]图1为实施例2Qubit检测各采血管中cf-DNA浓度结果；

[0018]图2为实施例2绝对定量检测Beta-actin检测各采血管中cf-DNA浓度结果；[0019]图3为实施例3Qubit检测各采血管中cf-DNA浓度结果；

[0020]图4为实施例3绝对定量检测Beta-actin检测各采血管中cf-DNA浓度结果；[0021]图5为实施例4Qubit定量cf-DNA震动测试结果；

[0022]图6为实施例4Beta-actin定量cf-DNA震动测试结果。

具体实施方式[0023]实施例1

[0024]称取如下试剂于1L无酶无菌烧杯中，量筒量取700mL milipore超纯水于烧杯离心管中，并加入以下组分，[0025]咪唑烷基脲400g[0026]金精三羧酸5g[0027]甘油醛20g[0028]氟化钠2g

[0029]乙二胺四乙酸三钾200g[0030]甘氨酸40g

[0031]对上述溶液进行充分混匀，加超纯水定容至1L，混匀后，室温放置3天，采用40μm一次性过滤器进行过滤灭菌，即得Protective Reagent A。每支10mL采血管添加250μL。[0032]实施例2

[0033]分别准备EDTA二钠、实施例1制备得到的Protective Reagent A、Streck cf-DNA采血管各一支，采用标准静脉穿刺技术从同一志愿者体内各采集血液10mL，上下颠倒混匀15次，置于22℃环境保存，分别于第0、3、7、14天时分离血浆，提取游离核酸，提取试剂盒为QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit。其中，EDTA二钠采血管和Streckcf-DNA采血管为市场购买得到。[0034]使用Qubit 2.0对所提游离核酸进行定量的结果如表1和图1。[0035]表1 Qubit定量游离核酸结果(ng/mL血液)

[0036]

 0d3d7d14dEDTA二钠采血管4.125.936610000(超出Qubit检测上限)Protective Reagent A采血管2.533.103.314.49Streck采血管3.002.9010.66600[0037]22℃条件下，EDTA二钠采血管仅在刚采集血液时，基因组基本无释放，3天、7天和14天三个检测时间点的核酸量随时间延长，基因组释放量增加极为明显，第14天的核酸检测量是第0天的至少2500倍。Streck采血管7天之内能够保持cfDNA稳定，基本无基因组释放，但第14天检测量剧增，是第0天的2200倍。Protective Reagent A采血管的保存效果在14天之内，能够抑制基因组的释放，第14天的检测结果为第0天的1.77倍。

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Beta-actin绝对定量结果见图2，Beta-actin绝对定量结果趋势与Qubit结果基本

一直一致，室温22℃保存3天，3种保存管的差异不显著；保存第7天时，EDTA二钠采血管与Protective Reagent A采血管的P Value<0.01，差异极显著，Ptotetive Reagent A采血管与Streck采血管的P value<0.05且P value＞0.01，差异具有显著性；保存第14天时，Pretective Reagent A采血管与Streck采血管的P value<0.01，差异极显著。[0039]以上实验证明，Protective Reagent A保护剂在保存血液cf-DNA方面，在室温22℃保存条件下，7天内与Streck采血管效果类似，14天时，效果远超于Streck采血管。[0040]实施例3

[0041]分别准备K公司的游离核酸采血管(PK)、Streck cf-DNA 采血管各一支(PS)，实施例1制备得到的Protective Reagent A采血管2支(P1B、P2B)、采用标准静脉穿刺技术从同一志愿者体内各采集血液10mL，上下颠倒混匀15次，置于25℃环境保存，分别于第0、3、7、14、21、28天时分离血浆，提取游离核酸，提取试剂盒为QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit。其中，K公司游离核酸采血管和Streck cf-DNA采血管为市场购买得到。[0042]使用Qubit 2.0对所提游离核酸进行定量的结果如图3。三种保存管7天内保存效果无明显差异，14天时，K公司采血管与Streck采血管均出现明显的游离核酸浓度上升，分别是第0天的15.27倍和10.21倍，21天时，上升最为明显，分别是第0天的22.46倍和13.84倍。Protective Reagent A保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，均无明显的变化。荧光定量Beta-actin的结果与Qubit定量结果一致，见图4。[0043]实施例4

[0044]分别准备K公司的游离核酸采血管(SK)、实施例1制备得到的Protective ReagentA(SB)、Streck cf-DNA(SS)采血管各一支，采用标准静脉穿刺技术从同一志愿者体内各采集血液10mL，上下颠倒混匀15次，置于25℃摇床，转速设置130rpm保存，分别于第0、3、7、14天时分离血浆，提取游离核酸，提取试剂盒为QIAamp Circulating NucleicAcid Kit。其中，K公司游离核酸采血管和Streck cf-DNA采血管为市场购买得到。Qubit定量cf-DNA结果见图5，荧光定量Beta-actin结果见图6。[0045]震动测试方面，三种采血管在0-7天内Qubit和荧光定量结果无明显的区别，第14天时，K公司采血管Qubit定量结果游离核酸浓度为第0天的2.37倍，与荧光定量结果一致。Streck采血管0-14天的Qubit定量结果游离核酸变化不明显，但荧光定量结果显示了在第14天时，Beta-actin拷贝量出现了明显的上升。本发明含有Protective Reagent A保护剂的保存管无论Qubit定量与荧光定量结果，在0-14天内均含量稳定，两者结果一致。

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图1

图2

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图3

图4

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说　明　书　附　图

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图5

图6

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