结直肠癌KRAS、NRAS和BRAF基因突变与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性

烟和饮酒之间的相关性

吴新新;马杰;任鹏飞;郭晓萱;郭永军

【摘 要】目的:探讨KRAS、NRAS和BRAF基因在结直肠癌中的突变率,分析3种基因突变与结直肠癌病理特征、吸烟和饮酒之间的关系.方法:用石蜡组织DNA提取试剂盒提取DNA,应用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织中KRAS 2号外显子的12密码子和13密码子常见的7个突变位点,检测NRAS2号与3号外显子的12密码子、13密码子与61密码子常见的12个突变位点,检测BRAF15号外显子的V600E位点的突变,分析KRAS、NRAS和BRAF基因在结直肠癌中的突变率与病理特征、吸烟和饮酒之间的相关性.结果:KRAS、NRAS和BRAF基因的突变率分别为38.0％ (93/242)、5.0％ (12/237)和2.1％ (5/237).在147例KRAS野生型病例中NRAS与BRAF的突变频率为6.8％ (10/147)和3.4％

(5/147).BRAF与KRAS、NRAS基因突变相互排斥.KRAS基因突变更倾向发生于Duke'S分期的C期(P =0.047)和淋巴结转移的患者(P =0.049),与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、癌结节及AJCC分期等病理特征无关(P均＞0.05).NRAS和BRAF基因突变与病理特征无关(P均＞0.05).KRAS、NRAS和BRAF基因突变与吸烟及饮酒史无关(P＞0.05).结论:该研究中KRAS基因突变更倾向发生淋巴结转移和Duke'S C期,说明KRAS基因突变对转移性结直肠癌有更重要的临床意义.

【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》 【年(卷),期】2016(051)001

【总页数】5页(P39-43)

【关键词】结直肠癌;基因突变;病理特征;KRAS;NRAS;BRAF;吸烟;饮酒 【作 者】吴新新;马杰;任鹏飞;郭晓萱;郭永军

【作者单位】郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州450003;郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州450003;郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州450003;郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州450003;郑州大学附属肿瘤医院分子病理科 郑州450003 【正文语种】中 文 【中图分类】R734.34

*河南省科技创新型人才工程资助项目

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，近年来应用基因检测的方法判断CRC预后及指导基因靶向治疗已成为重要手段。其中RAS基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路中的关键性靶点，在CRC演变过程中发挥了重要作用[1]。抗EGRE抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)主要与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断下游的RAS信号通路产生抗肿瘤效应。研究[2]显示只有携带KRAS野生型的CRC患者才能从抗EGRE治疗中获益。因此KRAS基因突变状态成为预示CRC患者能否从抗EGRE治疗中获益的有效指标,但是仍然有一部分KRAS野生型基因携带者无法从抗EGFR治疗中获益，这表明在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3-KAKT-mTOR信号传导通路中存在的其他突变基因(例如NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN基因突变)可能导致CRC患者无法从抗EGRE治疗中获益，因此，研究CRC中KRAS/NRAS/BRAF基因突变情况，将对临床治疗具有重要意义[3]。该研究应用实时荧光定量PCR方法

检测KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中的突变率，并分析其与CRC病理特征、患者吸烟和饮酒情况的相关性，明确中国人群KRAS、NRAS和 BRAF基因的突变特征，指导临床CRC的个体化治疗，为选择合适的临床治疗方案提供依据。 1.1 临床标本和资料 收集郑州大学附属肿瘤医院分子病理科2014年3月至6月确诊为CRC的242患者的甲醛固定的石蜡包埋组织。其中242例检测KRAS基因第2号外显子的12密码子和13密码子7个突变位点，237例检测NRAS基因 2号外显子和3号外显子的12、13和61密码子12个突变位点，237例检测BRAF 基因15号外显子V600E位点突变。查阅临床病例资料，收集患者的性别、年龄、病理诊断、吸烟和饮酒史。在收集病理特征时，部分病例数据缺失，在做相应基因突变与病理特征相关性分析时，去除缺失病例，只保留有效数据。 1.2 标本处理及检测方法 每例标本取3～5 μm厚的10卷石蜡组织，用二甲苯脱蜡，乙醇洗脱二甲苯后金属浴100 ℃烘干。采用TIANGEN 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取DNA。用NANO DROP 2000测定所提取的DNA浓度，调整最适质量浓度为20 μg/ L，OD(450)值1.8～2.0。采用实时荧光定量PCR方法检测基因突变， KRAS、NRAS和 BRAF 基因突变检测试剂盒购于北京雅康博公司。 1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0进行分析，应用χ2检验或Fisher精确概率法比较KRAS、NRAS和BRAF 基因突变率在不同年龄段、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、淋巴结转移、癌结节、AJCC分期和Duke′S分期等病理特征和吸烟、饮酒是否存在统计学差异，检验水准取α=0.05。

2.1 CRC患者KRAS 、NRAS和BRAF基因突变与病理特征之间的关系 见表1。242例CRC标本做了KRAS基因突变检测检测，其中突变型93例，野生型149 例，突变率为38.0%。237例CRC标本做了NRAS 基因突变检测，其中突变型12例，野生型225例，突变率为5.0%。237例CRC标本做了BRAF 基因突变检测检，其中突变型5例，野生型232例，突变率为2.1%。

*：Fisher精确概率法。

2.2 KRAS基因野生型中NRAS与BRAF基因的突变率 在149例KRAS基因野生型病例中共147例分别做了NRAS与BRAF基因突变检测，其中10例NRAS基因突变，突变率为6.8%，5例BRAF基因突变，突变率为3.4%，在KRAS基因野生型病例中NRAS与BRAF基因突变率与病理特征之间没有相关性(P>0.05)。 2.3 CRC患者KRAS、NRAS 和BRAF基因突变与吸烟和饮酒的关系 见表2。 在CRC中常见的突变位点位于2号外显子的12密码子与13密码子，突变率为30%～40%。该研究共检测了242例患者，KRAS基因突变率为38%，突变更倾向于发生Duke′S分期的C期和淋巴结有转移的患者，与其他病理特征之间没有明显的相关性。高静等[4]报道966例中国CRC患者KRAS基因突变率为38.8%，与该研究结果一致，并且认为KRAS基因在女性肿瘤分化程度好的右边结肠的突变率高，且与患者的年龄也有关。另外有研究[5]报道，KRAS基因突变率为40.4%，突变更易发生于女性患者，与其他病理特征无相关性。

有研究[6-7]已经证明携带有KRAS基因突变的CRC患者对抗EGFR治疗无效，然而并不是所有携带KRAS基因野生型患者都能够从抗EGFR治疗中受益，仍有40%～60%的KRAS基因野生型患者对抗EGFR治疗无效[8]，在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3K-AKT-mTOR的信号通路中存在NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN等一些其他突变基因。NRAS基因与KRAS基因一样同属于RAS家族，在国外的研究[9]报道中NRAS基因在CRC中的突变率为2.7%，突变频率在远端结直肠癌较高。而在Irahara等[10]的报道中NRAS的突变率2.2%，突变较易发生在女性患者的左半结直肠。该研究结果显示NRAS的突变率为5%，高于国外突变率；在KRAS野生型基因中NRAS突变率为6.8%，说明即使CRC患者检测KRAS基因为野生型，仍有6.8%的概率由于NRAS的突变而表现出对靶向治疗无效。BRAF基因在多种癌组织存在突变，最常发生于黑色素瘤、甲状腺癌

和CRC，BRAF基因在CRC中的突变往往与不良的预后有关[11]。高静等[4] 报道966例BRAF基因突变中，BRAF突变率为4.4%，在分化程度差和右半结肠中突变率高，与其他病理特征没有相关性。Kadowaki等[12]报道811例肿瘤患者中BRAF基因的突变率为5%，在近端结直肠、黏液癌和分化差的组织中突变率高。该研究结果显示BRAF基因突变率为2.1%，在KRAS野生型基因中的突变率为3.4%，与病理特征没有相关性，并且BRAF基因与 KRAS和NRAS基因突变相互排斥。BRAF基因突变率均低于国内外报道，可能与该研究的样本量小有一定的关系。

国内外关于KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中突变状态与病理特征之间关系的研究结果各有差异，这可能与检测方法、样本量和地区差异有关[4-5,7,13]。目前在国内关于NRAS基因在结直肠癌中的突变率的研究缺乏大样本量的研究，该研究中NRAS基因突变率为5.0%，明显高于国外，因此在行抗EGFR治疗前，有必要把 NRAS基因列入常规基因检测。虽然现在仍无证据表明可以根据BRAF的突变状态使用抗EGFR治疗，但有研究[4,12]显示BRAF突变伴有一些高危的临床病理特征，与近端CRC、分化差、T4期肿瘤有关，在 2015年的NCCN临床实践指南中推荐诊断为Ⅳ期的CRC患者行BRAF的突变检测。

该研究同时分析了CRC患者KRAS、NRAS和 BRAF基因突变与吸烟和饮酒之间的关系，未发现它们之间存在关联性，提示CRC患者KRAS 、NRAS 和BRAF基因的突变率可能不受吸烟与饮酒因素的影响，但该结论是否受样本量与质量的限制，仍需有待进一步去验证。

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