２０１４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ２ Ｆｅｂ ２０１４ ・６５・ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－－９６３８．２０１４．０２．００１ ．论著． 中美艰难梭茵Ａ—Ｂ＋株毒力编码区域转录及Ｂ毒素表达的研究 李先平，李，王晶，卢金星 １０２２０６） （中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，北京［摘要］ 目的研究中国艰难梭菌Ａ—Ｂ＋型分离株ＢＪ０８和美国艰难梭菌Ａ—Ｂ＋型暴发流行株ＵＳ１的毒力 编码区域ＰａＬｏｃ各基因转录及Ｂ毒素的表达，为预防和控制中国可能暴发的艰难梭菌感染提供理论支持。方法 每隔３ ｈ提取ＢＪ０８与ＵＳ１艰难梭菌和培养上清，用荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）法测定各时间段两菌株毒力编 码区域ＰａＬｏｃ各基因（ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｔｃｄＲ、ｔｃｄＥ）的表达；用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测ＢＪＯ８和ＵＳＩ各 时间段的细胞和培养液上清中Ｂ毒素的含量。结果ＵＳＩ的生长速率稍快于ＢＪ０８，衰退速率显著快于ＢＪ０８（Ｐ￣ ０．０５）；它们都不表达Ａ毒素，但是都检测到ｔｃｄＡ基因的转录，而且ｔｃｄＡ转录没有明显差异。ＢＪ０８的ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ 和ｔｃｄＥ基因的转录要比ＵＳ１早３ ｈ。Ｂ毒素在两种菌株的胞内和胞外合成或分泌没有明显差异。结论 中国艰 难梭菌Ａ—Ｂ＋型高分离株ＢＪ０８与美国艰难梭菌Ａ—Ｂ＋型暴发流行株ＵＳ１相比，有相似的毒力表达或更强的基 因能力，要警惕中国艰难梭菌ＢＪ０８暴发流行的可能。 ［关键词］艰难梭菌；毒力编码区；ＰａＬｏｃ；Ｂ毒素；抗生素相关腹泻；假膜性肠炎；医院感染 ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１６７１—９６３８（２０１４）０２—００６５—０６ ［中图分类号］Ｒ３７８．８ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｌｏｃｕｓ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｏｆ Ａ—Ｂ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｛｛ｔｃｉｌｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＬＩ Ｘｉａｎ—ｐｉｎｇ，ＬＩ Ｗｅ ｇｅ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ，ＬＵ Ｊｉｎ—ｘｉｎｇ（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆＯｒ ｌｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎｎｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅ— ｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊ ｉｎｇ １ ０２２０６，Ｃｈｉｎａ） ［－Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｌｏｃｕｓ（ＰａＬｏｃ）ａｎｄ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ 一 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉＪｆｉｃｉｌｅ Ｃ．ｄｉ｛｛ｔｃｉｌｅ）ｓｔｒａｉｎ ＢＪ０８ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ ＵＳ１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ ｃ．ｄｉ｛ｆｔｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｓｓｉ— ｂｌｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｃ ｄｉ ｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｅｖ— ｅｒｙ ３ ｈｏｕｒｓ，ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＰａＬｏｃ ｄｏｍａｉｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｃｄＡ，ｔｃｄＢ，ｔｃｄＣ，ｔｃｄＲ ａｎｄ ｔｃｄＥ ｇｅｎｅｓ，ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｂｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＵＳ１ Ｗ３Ｓ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｆａｓｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＢＪ０８，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＵＳ１ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｆａｓｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＢＪ ０８（Ｐ￣０．０５）；Ｎｏ ｔｏｘｉｎ Ａ ｗａｓ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｂｕｔ ｍＲＮＡ ｏｆ ｔｃｄＡ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｃｄＡ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＢ，ｔｃｄＣ ａｎｄ ｔｃｄＥ ｏｆ ＢＪ０８ ｗｅｒｅ ３ ｈｏｕｒｓ ｅａｒｌｉｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＵＳ１．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒａｉｎ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＵＳ１，ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｒ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＪ０８，ｐｏｓ— ｓｉｂｌｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｃ．ｄｉ厂ｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ａｌｅｒｔｅｄ． ［收稿日期］ ２０１３—１１—０５ ［基金项目］ 国家科技支撑计划课题（２０１２ＢＡＩｌ １ Ｂ【）５） 十二五国家科技重大专项课题（２叭３ｚｘ１０【）（】４２２１） ［作者简介］ 李先平（１９７５一），男（汉族），山东省临沂市人，助理研究员，主要从事厌氧菌致病机制研究。 ｌ：ｌｕｊｉｎｘｉｎｇ＠ｉｃｄｃ．ｃｎ ［通信作者］ 卢金星 Ｅ－ｍａｉ・６６・ ２０１４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ２ Ｆｅｂ ２０１４ ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｌｏｃｕｓ；ｔｏｘｉｎ Ｂ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｅａ；ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｌｉｔｉｓ；ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［Ｃｈｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏ１，２０１４，１３（２）：６５—７０］ 艰难梭菌是革兰阳性厌氧产孢梭菌。自从ＢＩ／ 医院分离的艰难梭菌Ａ—Ｂ＋株；菌株ＵＳ１是美国 从艰难梭菌感染暴发区域分离的Ａ—Ｂ＋株（美国 ＮＡＰ１／０２７型高毒株出现后，发生过多次艰难梭菌 感染暴发流行，ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７型高毒株（Ａ＋Ｂ＋） 一Ｔｕｆｔｓ大学冯汉平博士赠送）。 １．２ 实验方法 度成为研究艰难梭菌的热点［１－２］。近年来， Ａ—Ｂ＋型艰难梭菌引起的艰难梭菌感染暴发流行 １．２．１ 菌落生长曲线、菌落计数及其样本处理将 相继被报道 ，对Ａ～Ｂ＋型艰难梭菌的研究逐渐 成为艰难梭菌新的研究热点。艰难梭菌能引起很多 疾病，从轻度的腹泻到致命的假膜性肠炎，而且 ９５ 的抗生素相关的假膜性肠炎与艰难梭菌有关。 产毒艰难梭菌含有毒力编码区域——ＰａＬｏｃ （ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｌｏｃｕｓ）区域。Ａ＋Ｂ＋型艰难梭菌的 ＰａＬｏｃ区域是１９．６ ｋｂ的一个编码区域，Ａ—Ｂ＋型 艰难梭菌的ＰａＬｏｃ区域由于ｔｃｄＡ基因存在不同程 度的缺失，所以要短很多。Ａ—Ｂ＋型的ｔｃｄＡ ３ 末 端一般有１．８ ｋｂ的缺失，有些甚至有６ ｋｂ的缺失。 本研究中ＢＪ０８和ＵＳ１的ｔｃｄＡ ３ 末端有１．８ ｋｂ的 缺失。Ａ—Ｂ＋型艰难梭菌的ＰａＬｏｃ区域包括毒力 编码基因ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ以及毒力基因ｔｃｄＲ、ｔｃｄＣ 和ｔｃｄＥ５个基因。其中，ｔｃｄＡ基因由于存在不同程 度的缺失，不能编码Ａ毒素；ｔｃｄＢ基因编码２７０ ｋＤ 的Ｂ毒素。本研究中，我们研究和比较了中国高分 离株ＢＪ０８和美国艰难梭菌暴发流行株ＵＳ１在生长 速率和毒力编码区域ＰａＬｏｃ各基因转录及Ｂ毒素 表达的差异。 １材料与方法 １．１买验材料 １．１．１ 实验设备及试剂 厌氧罐及充气装置 ＭＡＲＫⅡ（荷兰Ｍａｒｋ １Ｉ）；Ｃａｒｙ ５０Ｂｉｏ紫外线可见 分光光度计（美国Ｖａｒｉａｎ）；台式高速冷冻离心机 （德国Ｓｉｇｍａ）；超声波细胞破碎仪（德国Ｂａｎｄｅｌｉｎ）； ＢｉｏＴｅｋ酶标仪（美国ＢｉｏＴｅｋ）；ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ荧光 定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）仪（美国ＡＢＩ）。细菌总 ＲＮＡ提取试剂盒、Ｆａｓｔ Ｑｕａｎｔ ｃＤＮＡ第一链合成试 剂盒和Ｓｕｐｅｒ Ｒｅａｌ荧光定量预混试剂ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ，均购自中国天根生化科技有限公司；艰难梭 菌Ａ／Ｂ毒素酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测试剂 盒（加拿大ＨＣＢ）。 １．１．２实验菌株菌株ＢＪＯ８是本科室从中日友好 保存的菌株ＢＪ０８、ＵＳ１接种于ＣＣＦＡ筛选平板，厌 氧３７℃培养４８ ｈ后，挑选单菌落接种于预还原的 ５ ｍＬ ＢＨＩ液体培养基，１８０ ｒ／ｍｉｎ震荡培养２４ ｈ， 再取１０ Ｌ接种于预还原的５ ｍＬ ＢＨＩ液体培养基 １８０ ｒ／ｍｉｎ震荡培养１２ ｈ。取一定量的菌液接种于 ２５０ ｍＬ预还原的ＢＨＩ液体培养基，使其含菌量达 到３×１０ ＣＦＵ／ｍＬ。３７。Ｃ厌氧环境下１８０ ｒ／ｍｉｎ 震荡培养，每隔３ ｈ，取１ ｍＬ菌液用紫外线分光光 度计ｉ贝０量６００ ｎｍ下的ＯＤ值，直到培养的第３０小 时［ ；同时取１ ｍＬ菌液梯度稀释，取１００ Ｌ涂布 于ＢＨＩ血平板，３７℃培养２４ ｈ，菌落计数。同时根 据细菌含量取５～２０ ｍＬ不等的菌液，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｒａｉｎ，取５００ Ｌ上清，一２０℃保存，用于Ｂ 毒素的测定。细菌沉淀物平均分成两部分：一部分 ２０￣Ｃ保存，用于Ｂ毒素的测定；另一部分一８０℃ 保存，用于提取ＲＮＡ，进行ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＣ、ｔｃｄＲ 及ｔｃｄＥ ｍＲＮＡ的测定。 １．２．２荧光定量ＰＣＲ从一８０℃冰箱取出保存的 细菌沉淀，ＰＢＳ洗涤２次，根据菌落计数，调整其细 菌含量，使每份样本含有１×１０ ＣＦＵ艰难梭菌。 然后根据天根细菌总ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行 ＲＮＡ的提取。取一定量的总ＲＮＡ进行逆转录反 应，然后进行荧光定量ＰＣＲ，各基因的引物见表１。 １６Ｓ为内参，反应体系为２０ Ｌ，具体为：２ Ｘ Ｓｕｐｅｒ— Ｒｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ Ｐｌｕｓ １０ Ｌ；正、反向引物（２０／￣ｍｏｌ／Ｌ） 各０．５ Ｌ；ｃＤＮＡ模板２ Ｌ；５０ Ｘ ＲＯＸ ０．４ Ｌ；无 ＲＮＡ酶水６．６ ＩａＬ。反应条件为两步法，预变性： ９５℃１５ Ｓ；反应（４０循环）：９５℃１０ Ｓ，６０℃３２ Ｓ；溶 解曲线反应：９５℃１５ Ｓ，６０℃６０ Ｓ，９５。Ｃ ３０ Ｓ，６０℃ １５ Ｓ。 １．２．３ ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养液上清和细胞内的 Ｂ毒素 从一２０￣Ｃ冰箱取出保存的细菌沉淀，ＰＢＳ 洗涤２次，根据菌落计数，调整其细菌含量，使每份 样本含有１ Ｘ １０ ＣＦＵ艰难梭菌。然后用超声波破 碎仪作用１５ ｒａｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，分别取 １４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖ０１ １３ Ｎｏ ２ Ｆｅｂ ２０１４ ・６７・ ５０ Ｌ上清进行Ｂ毒素的检测。具体检测方法见 ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书。加入终止液后，用酶标仪在 ４５０ ｎｍ波长检测ＯＤ值。 ｆ Ｒ Ｆ Ｒ枷一一一一一一 Ｆ Ｒ Ｆ册 Ｒ Ｆ Ｒ ｒ＇ ２结果 ２．１ ＢＪ０８和ＵＳ１生长曲线及其菌落计数 ＢＪ０８ 表１引物序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ 和ＵＳ１生长曲线的趋势相似。指数生长期从第３ 小时开始，１５ ｈ进入稳定生长期，稳定生长期持续 ６ ｈ左右。２１ ｈ后，ＯＤ值明显下降，细菌生长进入 ＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴ ＣＡＧＡＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＴＡ ＴＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＧ ＣＡＧＴＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣ ＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧ ＴＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴ ＴＴＧＡＣＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡ ＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＴＴＣＴＴ ＡＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＣ ＣＣＴＴＡＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＴ ＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＴＡＧＧ ＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡ 衰退期。图１Ａ显示，在指数生长期，ＵＳ１的生长速 率稍快于ＢＪ０８。两者在平台期的ＯＤ值没有明显 差异，进入衰退期后，ＵＳ１的ＯＤ值急剧下降，而 ＢＪＯ８的ＯＤ值下降较为平缓。在第３０小时，两者 的ｏＤ值有显著差异（Ｐ＜０．０５）。图１Ｂ表示的是 ＢＪ０８和ＵＳ１在不同生长阶段的菌落计数，两者在 生长的对数期及其平台期菌落计数没有明显差异， 在衰退期的第２７和３０小时，ＢＪ０８的菌落计数显著 高于ＵＳ１（Ｐ＜０．０５）。总体而言，两个菌株的菌落 计数和各自的生长曲线相一致。 Ａ Ｂ 三雪 邑 鱼 善 ； ｛ Ｕ 墨 Ａ：Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１；Ｂ：Ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｂ／０８ ａｎｄ ＵＳＩ（＊：Ｐ＜０．０５）． 图１ ＢＪ０８和ＵＳ１生长曲线及其菌落计数的比较 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１ ２．２ ＢＪ０８和ＵＳ１的ｔｃｄＡ及ｔｃｄＢ ｍＲＮＡ表达 就到达最高水平，一直持续到３０ ｈ。 ２．３菌株ＢＪ０８和ＵＳ１ ｔｃｄＣ、ｔｃｄＲ和ｔｃｄＥ ｍＲＮＡ 虽然ＢＪ０８和ＵＳ１的ｔｃｄＡ末端存在１．８ ｋｂ缺失， 但检测到ｔｃｄＡ的转录。为了更合理地比较，我们 通过菌落计数，把细菌调整到１０ ＣＦＵ。提取１０ ＣＦＵ细菌的总ＲＮＡ，进行逆转录和定量ＰＣＲｃ 。 图２Ａ所示：在培养的第１５小时，即菌株生长进入 稳定期后，ｔｃｄＡ的ｍＲＮＡ开始表达。２１ ｈ达到最 高水平，并且一直保持在较高的表达水平。ＢＪ０８和 的表达图３Ａ显示，ＢＪ０８从第１２小时开始，ｔｃｄＣ ｍＲＮＡ的转录显著下降；ＵＳ１从第１５小时起，其转 录开始下降。而且第２１、２４和２７小时，ＢＪ０８的转 录量显著低于ＵＳ１。图３Ｂ显示，ＢＪ０８和ＵＳ１的 ｔｃｄＲ ｍＲＮＡ都是从１５ ｈ开始转录，但是ＢＪＯ８表达 水平显著高于ＵＳ１，其余的时间段，两者表达水平 ＵＳ１在各个时间段ｔｃｄＡ ｍＲＮＡ的表达都无明显差 异。图２Ｂ所示，ＢＪ０８ ｔｃｄＢ ｍＲＮＡ的表达较早，第 １５小时就开始转录，１８ ｈ达到最高水平，一直保持 到３０ ｈ。ＵＳ１第１８小时才开始表达，并且一开始 无显著差异。ｔｃｄＥ和毒素的外分泌相关ｌ６］，图３Ｃ 显示，ＢＪ０８的ｔｃｄＲ ｍＲＮＡ从１５ ｈ开始转录，ＵＳ１ 从１８ ｈ开始转录。第１５小时，ＢＪ０８表达水平显著 高于ＵＳ１，其余时问段，两者表达水平无显著差异。 ・６８・ 中国感染控制杂志２０１４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｏｌ１ Ｅ Ｂ ∞岛∞ 皇Ｊｏ ０ 毋 ４ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ａ：ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＡ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１；Ｂ：ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＢ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳＩ（＊：Ｐ＜０．（）５）． 图２菌株ＢＪＯ８和ＵＳ１在不同培养时间ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ ｍＲＮＡ的表达 Ｆｉｇｕｒｅ ２ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＡ ａｎｄ ｔｃｄＢ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 盘 ％０ Ｊ０ ｏ ∞譬４ Ａ Ｂ 罟０ 日Ｐ Ｊ０ ０ ∞ 盘 Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ａ：ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＣ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１；Ｂ：ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＲ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１；Ｃ：ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＥ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１（＊：Ｐ＜０．０５）． 图３ ＢＪＯ８和ＵＳ１的ｔｃｄＣ、ｔｃｄＲ及ｔｃｄＥ在不同时间段ｍＲＮＡ的表达 Ｆｉｇｕｒｅ ３ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｃｄＣ，ｔｃｄＲ ａｎｄ ｔｃｄＥ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ２．４ ＢＪ０８和ＵＳ１细胞培养上清液及细胞中Ｂ毒 ２１小时检测到Ｂ毒素的表达，随着培养时间的延 长，Ｂ毒素的表达显著上升，第３０小时Ｂ毒素的表 达量是第２１小时的３５倍左右。两者在细胞中Ｂ毒 素的表达无显著差异。 素的表达图４Ａ显示，在细胞培养上清中，菌株 ＢＪ０８和ＵＳ１都在第２７小时检ｉ贝０到毒素Ｂ的表达， 两者在细胞培养上清中毒素Ｂ的表达无明显差异。 图４Ｂ是ＢＪ０８和ＵＳ１细胞中Ｂ毒素表达的比较，第 Ａ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ｈ） Ａ：Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１；Ｂ：Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳ１ 图４ ＢＪ０８和ＵＳ１细胞培养液上清及细胞中Ｂ毒素的表达 Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＢＪ０８ ａｎｄ ＵＳＩ 中国感染控制杂志２０１４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ２ Ｆｅｂ ２０１４ ・６９・ ３讨论 由于艰难梭菌感染的暴发和流行，艰难梭菌已 经成为欧美医院常规检测的项目。目前在中国大 陆，缺少系统的艰难梭菌的流行病学资料，对艰难梭 菌腹泻的严重性还没有系统地评价。根据有限的资 料，我们发现中国的艰难梭菌流行病学有自己的特 点，其中一个重要的特点是中国的艰难梭菌Ａ—Ｂ＋ 株分离率高，达２３．２ ～４８ ｌ７ ］，而欧美的分离 率偏低，加拿大Ａ—Ｂ＋菌株仅占３ ＿ｌｊ］。中国 Ａ—Ｂ＋型艰难梭菌的高分离率引起我们对Ａ—Ｂ＋ 艰难梭菌的研究兴趣。 本研究显示，ＢＪ０８和ＵＳ１生长曲线趋势相似。 但在衰退后期，ＵＳ１的ＯＤ值急剧下降，而ＢＪ０８的 ＯＤ值下降较为平缓；菌落计数也显示衰退后期 ＵＳ１的菌落计数显著少于ＢＪ０８。其原因可能是 ＢＪ（）８细胞比ＵＳ１细胞具有更强的环境耐受能力， 具体机制还需要进一步探讨。为了使不同时间段的 定量ＰＣＲ结果更具有可比性，我们参考了Ｇｅｒｂｅｒ 的方法ｌ５］并对其进行了改进，对每一个时间段的样 本取１０ ＣＦＵ细菌进行总ＲＮＡ提取，逆转录后进 行相对定量ＰＣＲ比较。ＢＪ０８和ＵＳ１虽然不分泌Ａ 毒素，但是检测到ｔｃｄＡ的转录。虽然转录的ｔｃｄＡ 不能表达Ａ毒素，但是不能排除其表达小的短肽来 参与毒力调节的可能性。因为早期的研究发现纯化 的Ｂ毒素在体外几乎没有毒力，只有在Ａ毒素的存 在下，在体外才有毒力，故认为艰难梭菌中的Ａ毒 素在调节Ｂ毒素的表达方面起主要作用＿１。］。后来， Ａ—Ｂ＋野生株的发现，以及Ａ—Ｂ＋株引起艰难梭 菌感染的暴发和流行ｌ１ ，使人们对Ａ、Ｂ毒素的作 用进行了重新定位。综合早期的研究成果以及我们 的实验结果，推测Ａ—Ｂ＋株的ｔｃｄＡ可能表达某种 短肽来Ｂ毒素。 菌株ＢＪ０８和ＵＳ１的ｔｃｄＡ ｍＲＮＡ表达在各个 时间段都没有明显差异，而且最高水平和基础水平 的差距较小，这可能与Ａ—Ｂ＋菌株不表达毒素Ａ 有关。虽然ＢＪ０８的ｔｃｄＢ ｍＲＮＡ表达比ＵＳ１提前 ３ ｈ，但是在上清液和细胞中，两者的Ｂ毒素含量都 无明显差别，可能是由于ＥＬＩＳＡ检测方法不够灵 敏。定量ＰＣＲ法能比ＥＬＩＳＡ法提前６ ｈ检测到Ｂ 毒素的表达。因为定量ＰＣＲ检测的灵敏性，所以临 床上多用定量ＰＣＲ来替代ＥＬＩＳＡ进行艰难梭菌相 关性疾病（ＣＤＡＤ）的初筛［１ 。一般认为ｔｃｄＣ对毒 素的合成有负作用＿１ ，但最近一篇文献ｌ１ 认为 ｔｃｄＣ对毒素的合成没有作用。我们的实验发 现，ＢＪ０８和ＵＳ１ ｔｃｄＣ的转录与ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ的转录 呈负相关，至少在转录水平上说明了ｔｃｄＣ对ｔｃｄＡ 和ｔｃｄＢ的转录有负功能。ＢＪ０８的ｔｃｄＣ比 ＵＳ１的下降早，且衰退期ＢＪ０８ ｔｃｄＣ的下降水平显 著低于ＵＳ１，但ＢＪ０８和ＵＳ１的ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ以及Ｂ 毒素的表达都没有显著差异。也许在不同的菌株中 ｔｃｄＣ的强度不一，ｔｃｄＣ的具体作用还待进一步 探讨。关于ｔｃｄＥ的作用也存在分歧，一般认为 ｔｃｄＥ和毒素的外分泌有关ｌｌ１ ，但也有研究证明ｔｃｄＥ 和毒素的分泌无关ｌ１ 。我们的实验结果表明，ｔｃｄＥ 与ｔｃｄＡ及ｔｃｄＢ的转录呈正相关。细胞中Ｂ１０８和 ＵＳ１的Ｂ毒素含量在衰退期显著升高，可能与衰退 期艰难梭菌毒素合成增加有关。 我们的实验证明，中国高分离株Ｂ．１０８和美国艰 难梭菌感染暴发区域分离的ＵＳ１的生长速率以及 Ｂ毒素的产量没有显著差异。既然ＵＳ１菌株能在 美国引起艰难梭菌感染的暴发流行，提示我们要密 切关注ＢＪ（）８可能在中国引起的艰难梭菌感染的暴 发和流行。 ［参考文献］ ［１］Ｗａｒｎｙ Ｍ，Ｐｅｐｉｎ Ｊ，Ｆａｎｇ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｕｔ— ｂｒｅａｋｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅ［Ｊ］． Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６６（９４９１）：１０７９—１０８４． Ｅ２］ ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｉ Ｃ，Ｋｉｌｌｇｏｒｅ Ｇ Ｅ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｐｉ— ｄｅｍｉｃ，ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ－ｖａｒｉａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ力≮ｃｉｌｅ ｌ＿Ｊ］． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０（／５，３５３（２３）：２４３３—２４４１． ［３］Ｄｒｕｄｙ Ｄ，Ｈａｒｎｅｄｙ Ｎ，Ｆａｎｎｉｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ— ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎ Ａ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ｔｏｘｉｎ Ｐｒｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆＪ）＇ｃｉｌｅ ｉｎ Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ＿Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２００７， １３（３）：２９８—３０４． ［４］Ｓｈｉｎ Ｂ Ｍ，Ｋｕａｋ Ｅ Ｙ，Ｙｏｏ Ｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｏｘｉｎ Ａ—Ｂ＋ ｖａｒｉａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｛｝ｔｃｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｐｓｅｕｄ ｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｔ ａ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｃａｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ Ｋｏｒｅａ［Ｊ］． Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２（３０８，６０（４）：３３３—３３７． ｒ５］Ｇｅｒｂｅｒ Ｍ，Ｗａｌｃｈ Ｃ，Ｌ６ｆｆｌｅｒ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＳＵｈ－ＭＩＣ ＣＯｎ－ ｅｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ，ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ，ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ ｏｎ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍｄｉ ｆｉｃｉ＆ＥＪ］． ＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８（Ｐｔ ６），５７：７７６— ７８３． ［６］Ｇｏｖｉｎｄ Ｒ，Ｄｕｐｕｙ Ｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｈｏｌｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，２０１２，８（６）：ｅｌ００２７２７． ［７］Ｈａｗｋｅｙ Ｐ Ｍ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ Ｃ，Ｌｉｕ Ｗ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉ ・７０・ 中国感染控制杂志２０１４年２月第１３卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ２Ｆｅｂ２０１４ ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｛｛ｔｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｊｏｒ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｒ１２］Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｌ Ｒ，Ｍａｎｓｏｎ Ｒ Ｕ，Ｐａｕｌｅ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌ：ａｎ ｕｎｄｅｒｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ Ａｓｉａ？［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏ１，２０１３，５１（１（））：３３０８—３３１３． ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎ ｓｔｏｏｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ－ａｓ— ［８３ Ｈｕａｎｇ Ｈ，ｗｕ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎ— ｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｓｈａｎｇｈａｉ ｈｏｓｐｉｔａｌ：ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｏｘｉｎ ｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｅａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００７，４５（９）：１１５２— １１６０． ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｒｉｂｏｔｙｐｅｓ＿Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ，２００９，３３ （４）：３３９—３４２． ［１３］Ｍａｔａｍｏｕｒｏｓ Ｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐ，Ｄｕｐｕｙ Ｂ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ ｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＴｃｄＣ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００７，６４（５）：１２７４—１２８８． ［９］ Ｍａｒｔｉｎ Ｈ，Ｗｉｌｌｅｙ Ｂ，Ｌｏｗ Ｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｛｝ｔｃｉｌｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｏｎｔａｒｉ ［１４］Ｂａｋｋｅｒ Ｄ，Ｓｍｉｔｓ Ｗ Ｋ，Ｋｕｉｊｐｅｒ Ｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＴｃｄＣ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｓｉｇ ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｐｒｅｓｓ ｔｏｘｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｝｛ｔｃｉｌｅ ６３０ＡＥｒｍ ｌＪ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（８）：ｅ４３２４７． ｏ，Ｃａｎａｄａ，ｆｒｏｍ ２００４ ｔｏ ２００６＿Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００８，４６ （９）：２９９９—３００４． ＥｌＯ２ Ｌｙｅｒｌｙ Ｄ Ｍ，Ｓａｕｍ Ｋ Ｅ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｄ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ｛｛ｔｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ ｇｉｖｅｎ ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ ｔｏ ａｎｉｍａｌｓ ［１５］Ｇｏｖｉｎｄ Ｒ，Ｄｕｐｕｙ Ｂ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｈｏｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴｃｄＥ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，２０１２，８（６）：ｅｌ｛）０２７２７． ＿ｌＪ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，１９８５，４７（２）：３４９—３５２． ［１１］Ａｌｆａ Ｍ Ｊ，Ｋａｂａｎｉ Ａ，Ｌｙｅｒｌｙ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｏｘｉｎ Ａ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ｔｏｘｉｎ Ｂ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ ｔ ｌｔ ［１６］Ｏｌｌｉｎｇ Ａ，Ｓｅｅｈａｓｅ Ｓ，Ｍｉｎｔｏｎ Ｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＴｃｄＡ ａｎｄ ＴｃｄＢ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｃｄｉ ６３０ ｉｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆ－ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｃｄＥ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ， ２０１２，５２（１）：９２ １ＯＯ． ｆｉｃｉｌｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｅａ口］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３８（７）： ２７０６—２７１４． ．学术动态． 抗菌蜂蜜预防腹膜透析相关感染：一项随机对照试验 陈玉华译，吴安华校 ４１０００８） （中南大学湘雅医院，湖南长沙背景 目前缺少指导预防腹膜透析相关感染策 略的研究证据。抗菌蜂蜜作为一种新型、廉价、有效 的局部预防性使用的药物，不会诱导细菌耐药。因 此，我们评估，对鼻内定植金黄色葡萄球菌的患者， 与同时进行腹膜管外出口部位常规护理加上鼻内莫 匹罗星去定植的方法相比，腹膜管外出口部位每日 使用蜂蜜，是否会延迟首次出现腹膜透析相关感染 的时间。 １８５人设为对照组。实验组［１６个月（四分位间距， 难以估计）］和对照组［１７．７个月（不可估计）］的平 均无腹膜透析相关感染生存时间比较，差异无显著 性，未调整风险比为１．１２，９５ 的置信区间０．８３～ １．５１，Ｐ＝０．４７。在亚组分析中，蜂蜜增加了糖尿病 患者的主要终点（１．８５，１．０５～３．２４；Ｐ＝０．０３）和 发生腹膜炎（２．２５，１．１６～４．３６）的风险。实验组和 对照组严重不良反应事件（分别为２９８例与３２７例， 此项非盲试验在澳大利亚、新西兰的２６ 方法Ｐ＝０．１）和死亡（分别为１４例与１８例，Ｐ＝０．９） 的发生率没有显著差异。实验组中１ １例（６ ）患 者发生局部皮肤反应。 个中心进行。研究对象是在进行腹膜透析的患者。 将这些患者用合适的分配算法按照１：１的比例随 机分为两组，实验组外出口部位每日局部使用抗菌 蜂蜜，并结合外出口部位常规护理；对照组采取外出 结论研究表明，不推荐常规使用抗菌蜂蜜进 行腹膜透析相关感染的预防。 摘译自：Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｄ Ｗ，Ｂａｄｖｅ Ｓ Ｖ，Ｐａｓｃｏｅ Ｅ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉ— ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｏｎｅｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ—－ｄｉａｌｙｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｅｃ—－ 口部位常规护理及鼻内使用莫匹罗星（仅针对鼻腔 内定植有金黄色葡萄球菌的患者）。试验的主要终 点为腹膜透析相关感染（出口处皮肤感染、窦道感染 或腹膜炎）。该试验澳大利亚、新西兰临床试验登记 处登记号１ ２６０７０００５３７４５９。 ｔｉｏｎｓ（ＨＯＮＥＹＰＯＴ）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２０１４，１４（１）：２３—３０． 结果共３７１名患者，其中１８６人纳入实验组，
