人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109929799 A(43)申请公布日 2019.06.25

(21)申请号 201910104132.1(22)申请日 2019.02.01

(71)申请人 浙江清华长三角研究院

地址 314006 浙江省嘉兴市南湖区亚太路

705号

申请人 南京医科大学

(72)发明人 吴庭鹤　李晶　张婧　杨玮杰　(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限

公司 32200

代理人 唐循文(51)Int.Cl.

C12N 5/0775(2010.01)C12N 5/075(2010.01)A61K 35/28(2015.01)A61P 15/08(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图4页

(54)发明名称

人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用(57)摘要

人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：采集人脐带组织，并提取得到脐带间充质干细胞；得到的脐带间充质干细胞进行离心处理，以提取得到外泌体。本发明HucMSC外泌体可以激活原始卵泡并促进新生小鼠卵泡发育，卵泡发育成熟后获得的成熟卵母细胞，其质量未受到影响。HucMSC外泌体可以改善老年小鼠生育功能，老年鼠卵巢包囊内注射外泌体后，与公鼠交配后，实验组小鼠产仔数明显高于对照组。

CN 109929799 ACN 109929799 A

权　利　要　求　书

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1.一种外泌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：采集人脐带组织，并提取得到脐带间充质干细胞；得到的脐带间充质干细胞进行离心处理，以提取得到外泌体。

2.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于步骤为：将剥离动脉和静脉的脐带洗净，剪成1mm3组织块，均匀平铺在培养皿中，每皿加入2mL培养基，放置培养于37℃，5%CO2的培养箱中6小时后，向皿内加入5mL培养基，每2-3天换液一次，当细胞生长至汇合度达到70%-80%时，用0.25%EDTA-胰酶消化，1:3传代至P3至P7代细胞，得到外泌体。

3.根据权利要求2所述外泌体的制备方法，其特征在于所述脐带间充质干细胞生长至汇合度达到60%-70%时，吸去原培养液，用PBS缓冲液清洗，加入10mL条件培养基，培养48小时后收集条件培养上清，在4℃环境下，把收集到的条件培养基用500g离心10分钟以去除细胞，用2000g离心20分钟以去除死细胞和细胞碎片，用10000g离心30分钟以去除大囊泡及凋亡小体，然后用120000g的相对离心力离心90分钟，吸去上清，用1mL PBS重悬离心管底部外泌体沉淀后，将所有离心管中的液体混合至同一离心管中，加入PBS至液体充满离心管，再次以120000g离心90分钟以清洗外泌体，吸去上层液体，用150-200μL PBS重悬外泌体以供后续实验使用。

4.权利要求1-3任一所述制备方法制得的人脐带间充质干细胞外泌体。5.权利要求4所述外泌体在非诊断治疗目的原始卵泡体外激活中的应用。6.权利要求4所述外泌体在制备原始卵泡体外激活试剂中的应用。7.原始卵泡体外激活试剂，其特征在于有效成分为权利要求4所述的人脐带间充质干细胞外泌体。

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人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

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技术领域

[0001]本发明属于外泌体领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞来源外泌体及其制备方法和其在原始卵泡体外激活中的用途。

背景技术

[0002]外泌体是细胞外囊泡中研究最为广泛的一个亚群，它由Pan和Johnstone在1983年首次发现。外泌体是一类来源于早期细胞内体，具有膜结构的细胞外小囊泡，它的直径介于50-150nm之间。目前多项研究表明外泌体可以被大多数细胞所分泌，同时可以在血液、尿液、脑脊液、腹水、卵泡液、羊水、关节液等大多数体液中被检测到。外泌体的表面及内部含有大量蛋白质，脂质，核酸等多种物质，而且不同细胞来源的外泌体，其内部的成分各不相同。间充质干细胞(MSC)来源的外泌体，由于与来源细胞本身具有相似的特性，因此在创伤修复、组织重建，以及心血管病、脑损伤、炎症等方面表现出丰富的潜在治疗能力，具有广泛的应用前景。来源于间充质干细胞的外泌体作为一种新兴无细胞(cell-free)治疗方式，具有较低的免疫原性，不存在潜在的致瘤性，并且与来源细胞相比，其在体内半衰期较短，能够更好的被受体细胞摄取。此外，外泌体可以在被分离后冻存备用，在较长时间内都不降低其本身原有的生物活性，后期经过修饰等方式处理后还可以作为包裹药物的载体靶向输送至特定部位。因此，外泌体临床应用安全性较高，伦理风险低，具有较高的应用潜能和价值。[0003]在雌性哺乳动物体内，卵泡是构成卵巢的基本功能单位，由位于中央的卵子及外围一层或多层颗粒细胞构成。按照卵泡中卵母细胞的不同生长发育阶段，可以分为原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，腔卵泡，排卵前卵泡。原始卵泡是卵巢中处于静息状态的卵泡库，在哺乳动物出生前或出生后形成，其数量是固定的，人每个卵巢中的原始卵泡大约有400，000左右。在卵泡生长发育过程中，原始卵泡库中不停有原始卵泡被激活而进入生长期，这个过程被称为初始招募(initial recruiment)。随着初始募集的不断进行，原始卵泡的数量逐渐变少，当人类卵巢中原始卵泡数量低于1000时，卵泡将不在发育，而女性也进绝经期。女性的绝经年龄在50岁左右，然而，在一些病理条件下，由于卵巢中原始卵泡储备不足而令女性提前进入绝经期(40岁之前)从而引发卵巢早衰。卵巢早衰是一种非常常见的不孕不育症，在育龄女性中的发病率大概在1-2％。目前，关于卵巢早衰并没有十分有效的治疗方法，大多数病人通过激素替代疗法实现人工月经周期，需要供卵来满足生育需求。原始卵泡体外激活技术(IVA)，是将卵巢组织体外处理以激活其中原始卵泡的新兴技术，对于治疗卵巢早衰病人具有重要意义，是世界上首个针对原始卵泡提出的治疗性技术。2011年，世界首例IVA婴儿于日本出生，2015年中国首例IVA婴儿出生，标志着该技术临床应用成功。现有IVA技术主要通过信号通路激活剂激活卵母细胞中的PI3K/mTOR信号通路实现激活原始卵泡的目的。关于来源于人脐带间充质干细胞(HucMSC)外泌体是否具有激活原始卵泡的作用则未见报道，然而，这项研究对于卵巢早衰的治疗将具有非常重要的意义。

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发明内容

[0004]解决的技术问题：本发明提供一种人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，本发明的外泌体是人脐带间充质干细胞的外泌体，可以在卵巢储备降低的情况下激活原始卵泡，改善生育功能。[0005]技术方案：一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：采集人脐带组织，并提取得到脐带间充质干细胞；得到的脐带间充质干细胞进行离心处理，以提取得到外泌体。[0006]上述外泌体的制备方法，步骤为：将剥离动脉和静脉的脐带洗净，剪成1mm3组织块，均匀平铺在培养皿中，每皿加入2mL培养基，放置培养于37℃，5％CO2的培养箱中6小时后，向皿内加入5mL培养基，每2-3天换液一次，当细胞生长至汇合度达到70％-80％时，用0.25％EDTA-胰酶消化，1:3传代至P3至P7代细胞，得到外泌体。

[0007]上述脐带间充质干细胞生长至汇合度达到60％-70％时，吸去原培养液，用PBS缓冲液清洗，加入10mL条件培养基，培养48小时后收集条件培养上清，在4℃环境下，把收集到的条件培养基用500g离心10分钟以去除细胞，用2000g离心20分钟以去除死细胞和细胞碎片，用10000g离心30分钟以去除大囊泡及凋亡小体，然后用120000g的相对离心力离心90分钟，吸去上清，用1mL PBS重悬离心管底部外泌体沉淀后，将所有离心管中的液体混合至同一离心管中，加入PBS至液体充满离心管，再次以120000g离心90分钟以清洗外泌体，吸去上层液体，用150-200μL PBS重悬外泌体以供后续实验使用。[0008]上述制备方法制得的人脐带间充质干细胞外泌体。

[0009]上述外泌体在非诊断治疗目的原始卵泡体外激活中的应用。[0010]上述外泌体在制备原始卵泡体外激活试剂中的应用。[0011]原始卵泡体外激活试剂，有效成分为上述的人脐带间充质干细胞外泌体。[0012]有益效果：HucMSC外泌体可以激活原始卵泡并促进新生小鼠卵泡发育，卵泡发育成熟后获得的成熟卵母细胞，其质量未受到影响。HucMSC外泌体可以改善老年小鼠生育功能，老年鼠卵巢包囊内注射外泌体后，与公鼠交配后，实验组小鼠产仔数明显高于对照组。附图说明

[0013]图1人脐带间充质干细胞形态学及诱导分化鉴定图。A:P5HucMSC细胞形态学特征；B：钙结节茜素红染色；C：脂滴油红O染色；D：软骨酸性黏多糖阿利新蓝染色。标尺＝50μm。[0014]图2人脐带间充质干细胞表面标志物流式细胞学鉴定图。A：HucMSC阳性标志物CD44,CD73,CD90,CD105表达情况；B：HucMSC阴性标志物CD11b，CD19,CD34,CD45,HLA-DQ/DR表达情况。

[0015]图3外泌体的特征鉴定图。A：Wester blotting检测外泌体阳性蛋白Alix，Tsg101，CD9，阴性蛋白Gm130，内参蛋白Gapdh；B：透射电镜观察外泌体形态；C：NTA检测外泌体粒子直径分布。

[0016]图4HucMSC外泌体处理新生小鼠卵巢激活原始卵泡结果示意图。A：卵巢培养24h后Foxo3a免疫组化染色；B：外泌体处理后Foxo3a出核比例增加；C：卵巢培养24h后p-rps6免疫组化染色。PBS，PBS处理对照组，Exo，外泌体处理组。标尺＝50μm。

[0017]图5新生小鼠卵巢于HucMSC外泌体处理后肾被膜下移植14天后的发育情况图。A：卵巢成对培养后移植，14天后卵巢形态学，处理组体积大于对照组；B：卵巢形态学HE染色，

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可见处理组发育状态更好；C：各级卵泡计数统计学分析；D：卵巢PCNA染色，可见处理组卵巢及颗粒细胞增殖情况更好。A图标尺＝1mm，B图，D图标尺＝50μm。[0018]图6HUCMSC外泌体改善老年小鼠生育功能图。A：对照组及实验组老年鼠生仔小鼠与非生仔小鼠统计；B：老年小鼠交配实验曲线；C：老年小鼠取卵数统计。具体实施方式

[0019]下面将结合实施例详细地描述本发明，但在此提供的实施例仅出于说明目的，而并不意欲限制本发明。[0020]实施例1：HucMSC的分离及培养[0021]取下约15cm长脐带后，将新鲜的脐带组织放置于含有1％青霉素/链霉素双抗的PBS缓冲液中，冰上运输至生物安全柜中，用前述溶液反复冲洗，至无明显残留血液后，用常规手术器械机械剥离脐带动脉及静脉，再次反复冲洗脐带组织。将冲洗干净的脐带用眼科剪小心剪成1mm3大小左右的小组织块，均匀平铺在直径为10cm培养皿中，每皿加入2mL培养基，放置培养于37℃，5％CO2的培养箱中6小时后，向皿内加入5mL培养基，每2-3天换液一次，当细胞生长至汇合度达到70％-80％时，用0.25％EDTA-胰酶消化，1:3传代。P3至P7代细胞用于实验(图1：A)。

[0022]细胞培养基配方(50mL)

[0023]

成分用量DME/F1244.25mLFBS5mL双抗750μL[0024]实施例2：HucMSC的多向诱导分化

[0025]P5代细胞培养至汇合度达到70％-80％时，用0.25％EDTA-胰酶消化，进行成骨及成脂诱导分化实验时，需将细胞接种于6孔板中，进行成软骨诱导分化时，细胞以悬浮球的方式培养于15mL离心管底部。[0026]成骨诱导分化实验：当细胞生长至汇合度达到70％-80％时，吸去原有培养基，更换成骨诱导分化培养基，按照说明书诱导，每2-3天换液一次，21天后使用4％PFA固定细胞后，用茜素红染液染色观察(图1：B)；[0027]成脂诱导分化实验：当细胞生长汇合度达到100％时，吸去原有培养基，更换成脂诱导分化培养基，按照说明书诱导，每2-3天换液一次，21天后使用4％PFA固定细胞后，油红O染液染色观察(图1：C)；

[0028]成软骨诱导分化实验：当细胞生长汇合度达到90％-100％时，用0.25％EDTA-胰酶消化后，以悬浮球方式将细胞置于15mL离心管底部，吸去原有培养基，更换成软骨诱导分化培养基，按照说明书，每2天换液一次，28天后将细胞球固定，待脱水包埋切片后，用阿利辛蓝染液染色观察(图1：D)。[0029]可见，分离的HucMSC具有良好的成骨、成脂、成软骨分化能力。[0030]实施例3：HucMSC的流式细胞学检测[0031]P5代细胞，当细胞生长至汇合度达到70％-80％时，用0.25％EDTA-胰酶消化，然后

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用PBS清洗2次离心并重悬细胞，按抗体说明书计算用量，加入FITC标记的CD19，CD34，CD44，CD45，HLA-DQ/DR抗体和PE标记的CD11b，CD73，CD90抗体，APC标记的CD105抗体避光孵育，15分钟后加入PI共染以标记死细胞，共染15分钟后用400g，4℃离心5min去除未结合的抗体，用200μL PBS重悬细胞于流式检测管中，上机检测。如图2：A所示P5代细胞表达HucMSC阳性标志物CD44,CD73,CD90,CD105，不表达HucMSC阴性标志物CD11b，CD19,CD34,CD45,HLA-DQ/DR(图2：B)。

[0032]实施例4：HucMSC外泌体的提取及鉴定[0033]当细胞生长至汇合度达到60％-70％时，吸去原培养液，小心用PBS缓冲液清洗细胞3遍，加入10mL条件培养基，培养48小时后收集条件培养上清。然后把收集到的条件培养基用500g离心10分钟以去除细胞，用2000g离心20分钟以去除死细胞和细胞碎片，用10000g离心30分钟以去除大囊泡及凋亡小体等，然后将所得培养上清用0.22μm无菌滤器过滤，暂时存放于4℃。超速离心时，将处理完的条件培养基小心转移至超速离心管中，配平后，用120000g的相对离心力离心90分钟，吸去上清，用1mL PBS重悬离心管底部沉淀后，将所有离心管中的液体混合至同一离心管中，加入PBS至液体充满离心管，再次以120000g离心90分钟以清洗外泌体，吸去上层液体，用150-200μL PBS重悬外泌体以供后续实验使用，以上各步离心均在4℃环境下进行。

[0034]条件细胞培养基配方(50mL)

[0035]

成分用量DME/F1244.25mLFBS5mL双抗750μL[0036]实施例5：外泌体纳米粒径的检测(Nanosight)[0037]采用纳米粒子跟踪分析的技术，使用纳米颗粒跟踪分析仪，按照机器说明书操作，将需检测的外泌体样品稀释50-100倍后上机运行，检测样品的粒径分布范围及粒子数目。如图3：C，所检测的粒子直径为62.7-146.1nm符合外泌体的直径范围，平均粒子浓度2.7×1010particles/mL,蛋白为0.79mg/mL。[0038]实施例6：透射电镜观察外泌体

[0039]将超速离心获得的外泌体沉淀用100μL 2.5％的戊二醛溶液重悬，4℃固定过夜，吸取20μL样品置于干净铜网上，用无尘纸小心吸干液体，室温干燥1-2分钟后，然后用2％的醋酸双氧铀在室温下染色2分钟，随后在室温干燥，再将铜网小心转移至超纯水小滴中，2分钟后，用无尘纸小心吸去液体，等待室温干燥后将样品上机观察。如图3：B所示，透射电镜下分离的囊泡具有典型的外泌体圆杯状的结构，直径为100nm左右。[0040]实施例7：外泌体荧光标记[0041]超速离心后，小心吸取上层培养基，使用PKH67荧光标记试剂盒，将外泌体沉淀重悬于0.5mL Diluent C中。同时，将4μLPKH67染液添加到0.5mL Diluent C中，将两者混匀，常温避光孵育4min后，迅速加入1mL 1％BSA/PBS溶液中止染色反应，然后将样品转移至超速离心管中，用120000g在4℃离心90分钟，小心吸取上层液体，将底部外泌体沉淀重悬于200μL PBS中，在-20℃条件下避光保存备用。

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实施例8：新生小鼠卵巢体外外泌体培养后免疫组化染色

[0043]取新生3天ICR雌性小鼠15只，采用冰冻法处死，酒精喷洒消毒后置于直径10cm的培养皿中。在细胞培养间内操作，从乳鼠背部肋脊角开一小口，取出双侧卵巢，置于L15平衡液的微滴中，在体视镜下小心剥除卵巢的包膜以暴露卵巢组织。将游离的卵巢组织在干净的L15平衡液中清洗2遍后，随机分成2大组，每大组随机分成6组，成对培养在24孔板中的内置培养小室中，在每孔内加入卵巢组织培养液400μL，各组孔内分别加入基础培养液、PBS和外泌体。培养24h后收取卵巢组织，固定包埋切片。[0044]如图4：A所示，应用原始卵泡激活的标志分子Foxo3a进行标记，外泌体处理组卵巢可见明显的Foxo3a出核情况。卵泡计数结果也表明激活的原始卵泡数明显增多(图4：B)。此外，应用PCNA染色，也能发现外泌体处理组增殖细胞增多(图4：C)。可见，外泌体处理能够激活原始卵泡并促进卵巢内细胞的增殖。[0045]实施例9：新生小鼠卵巢经外泌体培养后肾被膜移植[0046]选取5-6周龄ICR雌鼠作为受体鼠，腹腔内注射240mg/kg的阿弗丁麻醉至小鼠无反应后，剃去小鼠背部腰侧附近毛发，酒精消毒皮肤，横置于手术台上，用手指确认肾脏位置，剪出一个1cm长小口，小心暴露皮下组织，逐层进入腹腔，找到肾脏后，小心牵拉出肾脏，将肾脏卡于切口位置处，用尖镊在肾被膜上撕开一个小口，将培养的卵巢小心塞入其中并固定位置，防止卵巢漏出。移植卵巢完成后，沿肾脏附近脂肪组织找到受体鼠自身卵巢组织，用高温加热消毒后的眼科剪剪去卵巢，利用高温凝血，确认无流血后，将暴露在体外的组织按顺序小心还纳体内，逐层缝合伤口，用碘酒消毒后将小鼠放置在温台上复苏。送回动物中心饲养，每隔1天腹腔注射10IU FSH，并观察伤口恢复情况。移植14天后，取回部分小鼠，二氧化碳法处死，暴露腹腔，小心剪下肾脏，剥去肾被膜，暴露移植的卵巢，于体视镜下拍照后，固定包埋切片，记录各级卵泡数目，免疫组化检测PCNA蛋白表达情况。[0047]如图5：A、B、C所示，外泌体处理组的卵巢明显变大，形态学分析和卵泡计数结果显示，卵泡发育增加，有腔卵泡数目明显增多。另外，PCNA标记也可见外泌体卵巢处理组内颗粒细胞增殖情况良好。可见，外泌体处理能够促进卵泡的发育。[0048]实施例10：HucMSC外泌体改善老年小鼠生育功能[0049]选用30只50周龄老年小鼠，随机分成2组进行卵巢包囊内注射。一组注射PBS，一组注射外泌体，3周后合笼进行交配实验。我们连续监测了14周各组小鼠的生仔情况，并绘制交配曲线。与对照组相比(4只小鼠)，实验组产仔小鼠数目明显增多(9只小鼠)。通过交配曲线的绘制，可见，实验组每只小鼠平均产仔5.40只，对照组平均每只产仔2.13只。因此，外泌体在改善老年小鼠生育功能方面也发挥作用(图6)。

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