２００２年２月 重度大学学报（自然科学版） ｖ０ｌ ２５ ．２ 第２５卷第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏａｇｑ￣ｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａ￣＇ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅ出血ｎ） Ｆｅｂ．２∞２ 文章编号：１０００—５８２Ｘ（２００２）０２—００４５—０４ 冲击波对肺血管内皮细胞通透性影响的机制‘ 王建民 ，王正国 ，朱佩芳 ，李兵仓‘，徐世荣 （１．第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆４０００４２； ４０００４４） ２．重庆大学生物力学与组织工程教育部重点实验室，重庆摘要：采用不同压力梯度爆炸冲击波对培养单层肺微血管内皮细胞滤膜作用的模型，观察了不同 压力梯度爆炸冲击波对培养的肺微血管内皮细胞单层通透性的影响，并从一般病理学与细胞骨架结构角 度探讨了冲击波作用下内皮通透性变化的可能机制。结果表明，电导法测定时，１００ ｋＰａ左右的爆炸冲击 波压力砟用即可见到单层内皮通透性的显著增加；３５０ ｋＰａ以下的爆炸冲击波损伤主要以内皮细胞问隙 的增加为主要类型，而６００ ｋＰａ以上的爆炸冲击波损伤，则主要以内皮细胞的脱落性损伤为主。爆炸冲击 波作用下内皮通透性变化的发生机制与细胞骨架肌球蛋白结构的变化有关。 关键词：爆炸冲击波；内皮细胞单层；通透性；肌球蛋白 中图分类号：Ｏ ６６ 文献标识码：Ａ ４］。 ３）爆炸冲击波作用实验步骤： 爆炸性损伤是一种平时与战时均十分常见的损伤 类型，爆炸冲击波所引起的微血管通透性变化在伤后 肺水肿的发生中具有十分重要的意义…，但目前对于 爆炸冲击波所引起微血管通透性的变化尚缺乏研究。 爆炸冲击波的直接作用与爆炸冲击波引起的机体应激 等所致的间接性反映两者在作用方式、损伤机理及病 理生理特点上均存在明显的差异，所涉及到的处理对 策也因之而不同 Ｊ。因此，利用体外模型探讨爆炸冲 击渡对肺微血管内皮通透性的影响及其可能机理就十 分必要。本实验以培养有肺微血管内皮细胞单层的滤 膜与玻片为模型，采用白蛋白滤过法、电导测定法以及 ①实验水池（圆柱形，半径为ｌ ｍ，高为１．５ ｎ１）加 温至２０—２５℃。 ②将已备好的致密单层内皮细胞滤膜或玻片取 出，贴附于载玻片上后，放人自制的无菌薄层塑料袋 里，加入适量细胞液后封口，保持袋内无菌。 ③将封口塑料袋固定在泡沫板上，鼍于水池凹槽 内水深１０ ｃｍ处（水池内水深８５ ｃｍ）。内皮细胞面向 爆心。 免疫荧光法，探讨了不同爆炸冲击波压力对单层肺微 血管内皮细胞通透性的影响，并从一般病理学表现与 微球蛋白分布角度探讨了通透性变化的可能机制。 ④爆炸冲击波压力梯度模拟：在装有单层内皮细 胞滤膜或玻片的塑料袋表面覆盖不同厚度薄膜（５０ 层），模拟３６～ｌ ０００ ｋＰａ范围的压力梯度。 ⑤将装有８０ ｎｌｇ炸药的雷管，固定在水池正中． 水面下１０ ｃｍ处，引爆。 １材料与方法 １）大鼠肺微血管内皮细胞的培养：选取重１５０— ２００ ｇ健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，购自本所实验动物中心， １％戊巴比妥钠（０．５ ｍＬ／ｌＯ０ ｇ）腹腔麻醉。取肺脏，利 用组织块贴片法进行肺微血管内皮细胞的培养Ⅲ。 ２）单层内皮细胞滤膜与玻片的制备：参照文献 ⑥对照组细胞放入水池内同样时间，但不致伤。 ４）仪器与试剂：Ｌｅｉｃａ荧光显微镜（德国）。兔抗 鼠肌球蛋白抗体，上海华美生物工程公司。羊抗兔 ：Ｇ—ＦＩＴＣ，上海华美生物工程公司。 ５）荧光染色步骤：培养有肺微血管内皮细胞的玻 片致伤后（对照组不致伤），即用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ洗 ・收稿日期：２００１．１０－１４ 基金项目：教育部访问学者基金项目资助（教技司［２ＯＯＯ］１２３号） 作者简介：王建民（１９６２一），男，江苏南京人，第三军医大学副研究员，医学博士，重庆大学生物力学与组织工程教育部重点实 验室访问学者 主要从事创伤病理生理、细胞生物力学方面的研究。 重庆七学学报（自然科学版） ２００２卑 液洗涤三次，室温下４％的多聚甲醛溶液中固定１５ 性。伤后３０ ｍｉｎ时，流量法测定滤膜通透性与对照相 ｍｉｎ，按免疫组化法进行内皮细胞内微丝结构肌球蛋白 比增加不明显，电导法测定通透性有轻微增加，但无统 （ｍｙｏｓｉｎ）的荧光染色，２４ ｈ内荧光显微镜下进行检测。 计学差异，至２ ｈ时，电导法测定的滤膜通透性与对照 ６）病理观察：培养细胞用不同强度爆炸冲击波致 相比有显著性增高（Ｐ＜０．０５）。６ ｈ时，两种方法测定 伤后，１５ ｍｉｎ内于倒置显微镜下观察细胞形态变化并 的滤膜通透性均有明显增高，与对照相比，增高幅度均 拍照。 在２倍左右（见表３）。 ７）结果处理：实验数据用 ± 表示，采用Ｋｘｅｅｌ 表３不同时相单层内皮细胞通透性的变化（ｎ＝５） ２０００进行方差分析和组间ｔ检验统计处理。 伤前 ２结果 流量 ５．２７± ６．８５± ７．６５± １０．８１± ／ｌ止・ｍｉｎ～・ ０．４６ ２ ３０ ２．１０ ４．６０ ２．１不同程度的爆炸冲击波压力模拟 ， １２＿６±３＿４ｌ６．３＋４＿５ ２２．１±４＿７ ５±ｌ２ ｌ 为在有限的空间内模拟较大范围的爆炸冲击波压 力作用，本实验采用了不同厚度薄膜覆盖的方法。研 与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５，△Ｐ＜０．Ｏｌ 究表明，在水深１０ ｅｍ，爆源距传感器７６ ｅｎａ时，０～３２ 层（厚度０～１．６ ｍ１）塑料薄膜能较好地模拟３６～１ ０００ ２．４培养肺微血管内皮细胞损伤的镜下观察 ｋＰａ压力范围爆炸冲击波压力作用（见表１）。 在１６层以上（薄膜厚度＞０．８ ｎｑｆｎ）的塑料膜覆盖 表１不同薄膜覆盖时爆炸冲击波的压力值｛ｎ＝５） 下，爆炸冲击波压力值小于３５０ ｋＰａ时，细胞受伤后３ｏ ｍｉｎ内观察，均未见有明显的细胞脱落现象（见图１）。 在覆盖塑料膜减少到８层（薄膜厚度＜０．４ ｍｎ），爆炸 冲击波压力值达到６００ ｋＰａ以上时，细胞受伤后可见 到明显的细胞脱落现象（见图２）。 ２．５爆炸冲击波对内皮细胞内肌球蛋白结构的影响 本实验结果表明，正常情况下，荧光标记的抗肌球 蛋白抗体结合试验示肌球蛋白均匀分布于细胞浆中 （见图３），受ｌ１６．１５ ｋＰａ的爆炸冲击波压力致伤以后， ２．２不同爆炸冲击波强度对单层内皮通透性的影响 胞浆中的肌球蛋白发生了重分布，表现出向核周聚集 研究结果表明，单层内皮细胞的通透性随冲击波 的趋势（见图４）。 压力值的增高而增高，其中流量测定法在压力值大、损 伤严重、细胞大片脱落的情况下，增高异常迅速，而在 压力值小，损伤轻微时，增高不明显；而电导测定法则 呈平稳增高的趋势（见表２）。 表２不同冲击波强度作用下 内皮通透性的变化（ｎ＝５） 对照 流 量 ５．２７±６．１３±６．８５±１３ ４４±２７．５１±４９± ，ｌ止・ｍｉｎ～・ ０．４６ ０．８４ ２．３０ ４． ８ １７．２旷 电导 １２．６±１５．４±２０ ３±２７．８ ３６．２ ５４．６± １１０一。Ｓ ３ ４ ６．８ ４．５＊６． ２． １１． 与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５，△Ｐ＜０．０１ ２．３爆炸冲击波作用后单层内皮细胞通透性随时间 的变化 选用覆盖２４层（厚度１．６ ｎｑｆｎ）薄膜的单层内皮细 圈１ １６层薄膜覆盖致伤时的内皮细胞×１００ 胞，在爆炸冲击波作用后不同时相点测定滤膜的通透 第２５卷第２期 王建民等 冲击玻对肺血菅内皮细胞通透性影响的机制 ．４７ 图２ ８层薄膜藿盖致伤时的内皮细胞Ｘ １００ 图３正常肺血管内皮细胞内微丝结构分布均匀×４００ 为一种不可逆性的变化‘ 。因此，体外研究爆炸冲击 渡对肺徽血管通透性影响的机制及规律，对于阐明单 纯的爆炸性冲击波物理性因素的作用特点，从而更全 面地了解爆炸冲击波对肺微血管通透性影响的规律及 机制，具有十分重要的意义。 对流量法与电导法两种测定方法的比较可以发 现，流量法对单层内皮通透性的测定，在滤膜减少到 １６层，爆炸冲击波压力增高到３５０ ｋＰａ左右时，才可见 到滤膜通透性的显著增加。而电导法测定，在滤膜减 少到２４层，爆炸冲击波压力增高到１００ ｋＰａ左右时，就 可见到滤膜通透性的明显增加。结合两种方法测定原 理上的差异，我们可以看出，３５０ ｋＰａ以下的爆炸冲击 波损伤主要以内皮细胞间隙的增加为主要类型，而 图４伤后肺血管内皮细胞内微丝结构向核周聚集×４０７ ６（３０ ｋＰａ以上的爆炸冲击波损伤，则主要以内皮细胞的 脱落性损伤为主。细胞损伤的镜下观察结果，进一步 证实了这一点。本研究还表明，１００ ｋＰａ左右的爆炸性 冲击波压力值所引起的内皮单层通透性变化，可能主 要是由于内皮单层细胞间间隙的轻微增加所致。这一 结果与细胞内肌球蛋白结构变化的观察有较好的一致 性。有研究表明 】，多种细胞因子所致的内皮通透性 ３讨论 单层内皮细胞通透性模型的建立为体外研究各种 因子对其影响提供了有效的手段，利用该模型进行各 种因子对单层内皮细胞通透性的研究已有许多报 道 Ｊ．但尚未见有用爆炸冲击波为影响因素的实验报 道。 爆炸冲击波对肺微血管通透性的影响是多方面 的．包括有物理性与化学性的因素两类。两类因素对 肺微血管通透性的作用方式以及病理特点并不一致。 化学性的因素主要表现为一种去除致伤因素以后的可 逆性的变化，而物理性致伤因素，则在一定程度上表现 的变化，均与细胞骨架的收缩密切相关。主要依赖肌 球蛋白轻链（Ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ．ＭＬＣ）的磷酸化 。肌 球蛋白轻链激酶（Ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｋｍａｓｅ．ＭＬＣＫ）的激 活引起ＭＬＣ的磷酸化，活化重链头部的ＡＴＰ酶，细胞 骨架蛋白肌动微丝（Ｆａｃｆｉｎ）移动，细胞收缩。因此，爆 炸冲击波所致内皮通透性的变化，也与肌球蛋白结构 功能的变化密切相关，但其详细的机理尚有待进一步 ４８ 重庆犬学学报（自然科学版） ２００２虽 探讨。 ［６］ １９９７，１３３（Ｉ）：７—１４． ｝Ｅ怔Ｒ Ｊ Ｌ＿Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｎｄ ｔｈｍｍｂｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉ眦ｒｅａｓｅｓ ｉｎ 参考文献： ［１］郏怀恩．烧伤、冲击伤和烧冲复舍伤大鼠肺微血管超微 结搀病变［Ｊ］．中华整形烧伤外科杂志，１９９５，ｌｌ（５）：４２５— ４２９． ［２］ Ｂ科Ⅱ ｍＮ ｃＭ．ｃ，ｔｃ１ 一ｉｎ 。 ｉＩ．ｃ唧蚺ｉｎ朗 ｅｌｉａｌ∞ｅａ枷口。∞Ｉ｜ｒ ａＲ口ａｄ｝ ｉ∞ｒｒ 山ｅｘｐ ｍ［Ｊ］ ｅｎｄｏｔｈｅｌ￣ａｌ ｐｅｍ：ｅ￣ｉｌｉｔ－／（￣２Ｅｕｒ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ０ｆ ｐｈｃｅｐｈ￣ｐａｓｅ Ｃ ｂｕｔ Ｉｅ【 ｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｍａｓｅ Ｃ ａｅｆｉｖ￣ｏｎＥＪ］Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙ￣ｄ，１９９７， １７３（３）：３８７—３９６・ Ｅ７］ＨＯＲＤＩ．￣ＰＬ．ｖａ，Ⅻｋ岫ｊ０ｔ｝ ａｌ ｃａ ｒｉＩ１瑚 珊ｅＢ洲 咖ｒｄ宣 ９２３・ Ｔ ａｌ ‘ 叭ＪＪ＿Ｊ（柚ｓｃｉ，１９９９，１１２（１２）：１ ９１５—１ ． ｓ啪，１９９６，１２０：４¨一４１７． Ｌ８］ＭＡＲⅡ Ｂ ｃ．Ｃｙｔｏｌ￣ｉｎ 甜 ｍ ｉｎ ［３］谢崧大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定［Ｊ］．中国应用 删丑ｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］・Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９６，１２０ 生理学杂志，１９９７，１３（２）：１８９—１９０． （２）：４１１—４１７・ ［４］许蜀闽．血管内皮细胞的滤膜培养方法［Ｊｊ第三军医大 ［９］Ｇ０ＢＣⅪ岫Ｚ Ｍ，ｗＹｓ０Ｉ加强５ⅪＲ Ｂ・Ｍ ｎ ｃ 学学报，１９９７，１９（３）：２．６５—２６８． ｋｉｎａｓｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｄａｅｌ￣ｃｅｌｌ ｃ０｜ｒ ∞：ｔｈｅ￣ｄａｔｉｏｎｓｈｉｐ ［５］ ｃ唧Ｙ Ｌ＿Ｒｄ吐ｉ ｐ ｂｅｔ惭ｎ ｅｒ凼 ａｌ ｃｅｌｌ Ⅲ町ａ九ｄ 唧 ｊＢ０ 。眦 ， “ 衄，ａｎｄ“ ｉｎ ｐ口 哪ｂｄｉ竹 ｄ噼［Ｊ］．＾ 工ｏｓ ｓ，出唧 曲ｎＬＪ］・Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｄｔ１９９５ｔ１３０（３）：６１３—６２７ｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ 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