２０１３年１２月ＡｃｔａＭｅｄＵｎｉｖＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌＨｕａｚｈｏｎ０１３Ｄｅｃ． ２ｇ
转化生长因子－β不同亚型对前软骨干细胞
增殖分化的影响
丁 然， 王 庆△， 蔡贤华
广州军区武汉总医院骨科，武汉 ４３００７０
（））摘要：目的 通过观察转化生长因子－对前软骨干细胞（的增殖分化及细ＴＧＦ３种不同亚型（ＰＳＣｓ－１、２和β３）ββββ
胞外基质合成的影响，为构建组织工程学软骨组织寻找理想的细胞因子。方法 通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和／分别用含有浓度为１纯化的ＰＳＣｓ细胞，０ｎｍＬ的３种亚型的重组ＴＧＦＳＣｓ进行培养。ＰＳＣｓ培养后第－ｇβ培养液对Ｐ／采用ＭＴ采用Ｒ０、３、６、９天，Ｔ法与ＢｒｄＵＰＩ双参法测细胞增殖及ＤＮＡ合成水平，Ｔ－ＰＣＲ法测定ＣｏｌＡｒｅｃａｎ基因Ⅱ、ｇｇ的表达。采用免疫组化法测定培养２周后各组细胞ＳＯＸ９蛋白表达情况。结果 培养３ｄ后，ＴＧＦＳＣｓ的增殖活－１组Ｐβ），。６ｄ后，性明显较对照组下降（而ＴＰ＜０．０５ＧＦＴＧＦＰ＞０．０５）－－２、３组增殖活性与对照组相比差异无统计学意义（ββ）；与对照组相比，而Ｔ增殖活性较对ＴＧＦＰ＜０．０５ＧＦＴＧＦ－－－１组细胞增殖活性明显降低（２、３组则显示了相反的结果，βββ）。Ｄ照组明显增强，且Ｔ随着时间的延长，ＧＦＧＦＰ＜０．０５ＮＡ合成呈同样趋势。ＲＴ－ＰＣＲ分析显示，－－３组高于Ｔ２组（ββ与对照组相比，ＴＧＦＴＧＦＴＧＦｏｌＴＧＦＧＦｒｅｃａｎ的表达亦较对－－－Ⅱ基因表达均呈上升趋势；－－ｇｇ１、２、３组Ｃ１与Ｔ３组Ａβββββ照组增加，但ＴＧＦｒｅｃａｎ的基因表达无明显改变。免疫组化检测结果显示，ＴＧＦＴＧＦＯＸ９蛋白合－－－ｇｇ２组Ａ１、３组的Ｓβββ），。结论 Ｔ而Ｔ成高于对照组（Ｐ＜０．０５ＧＦＰ＞０．０５）ＧＦＳＣｓ增殖－－２组与对照组相比差异无统计学意义（１能抑制Ｐββ而Ｔ而Ｔ活性，ＧＦＧＦＳＣｓ增殖的作用，ＴＧＦＧＦＳＣｓ细胞分化，ＧＦ－－－－－２和Ｔ３具有促进Ｐ１与Ｔ３均能促进Ｐ２对于分βββββ化的诱导作用不明显。
；关键词：前软骨干细胞； 转化生长因子－ 增殖； 分化β
：／中图分类号：Ｒ３２９．２ ＤＯＩ１０．３８７０．ｉｓｓｎ．１６７２０７４１．２０１３．０６．００８－ｊ
ＥｆｆｅｃｔｏｆＴｈｒｅｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢｅｔａＳｕｂｔｅｓｏｎ ｇｙｐ
ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＰｒｅｃａｒｔｉｌａｉｎｏｕｓＳｔｅｍＣｅｌｌｓ ｇ
ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏＯｒｔｈｏｅｄｉｃｓ，Ｗｕｈａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＨｏｓｉｔａｌｏＧｕａｎｚｈｏｕ ＭｉｌｉｔａｒＣｏｍｍａｎｄ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ ｐｆ ｐｐｆ ｇｙ
ｒｏｌｉｆｅｒａＡｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴＧＦｉｓｏｆｏｒｍｓ（ＴＧＦＴＧＦｎｄＴＧＦｏｎｔｈｅ Ｏ Ｔ －－－ － －ｐ１，２ａ３）ｊββββ
（）ｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｃａｒｔｉｌａｉｎｏｕｓｓｔｅｍｃｅｌｌｓＰＳＣｓｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｅｅｋａｎｉｄｅａｌｃｔｏｋｉｎｅｆｏｒｔｉｓｓｕｅｅｎｉｎｅｅｒｉｎｃａｒｔｉｌａｅ ｐｇｙｇｇｇ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＳＣｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｍｅａｎｓｏｆｉｍｍｕｎａｎｅｔｉｃａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒ Ｐ －ｍ －ｐｙｇ
，／，，，ｔｉｎ．ＴｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎＴＧＦＧＦｒＴＧＦｔ１０ｎＬ．Ａｔ０３６９ｄａｓａｆｔｅｒｃｕｌ －－ － －ｇｇｇｍｙ１Ｔ２ｏ３ａ βββ
，／ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｔｕｒｅｔｈｅａｎｄＤＮＡｓｎｔｈｅｓｉｓｏｆＰＳＣｓｉｎｒｅｓｏｎｓｅｔｏＴＧＦｉｓｏｆｏｒｍｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂＭＴＴａｎｄＢｒｄＵＰＩｄｏｕｂｌｅ － ｐｙｐｙ β
，ｓｔａｉｎｉｎｎｄｔｈｅｍＲＮＡｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｏｌⅡａｎｄＡｒｅｃａｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＯＸ９ｗａｓｉｍｍｕｎｏｈｉｓ －ｇａｐｇｇｙｐ
，ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｔ２ｗｅｅｋｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｈｒｅｅｄａｓａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｔｈｅｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＰＳＣｓｗａｓｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｄｅ Ｔ －ｙｙｐｐｇｙ
（），ｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅＴＧＦｒｏｕｒｅｌａｔｉｖｅｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕ．０５ｂｕｔｉｔｈａｄｎｏｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｅｓｉｎｂｏｔｈＴＧＦｎｄＴＧＦ － － －ｐｇｐＰ＜０ｇｇ１ｇ２ａ ββ
（），．０５．ＳｉｘｄａｓｌａｔｅｒｔｈｅＰＳＣｓｃｏｎｔｉｎｕｅｄｔｏｄｅｃｌｉｎｅｉｎｔｈｅＴＧＦｂｕｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅＴＧＦｒｏｕｓＰ＞０ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｏｕ － －ｙｐｐｐ３ｇ１ｇ２ βββ
（）ｒｏｕｓｒｏｕａｎｄＴＧＦｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｉｎｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｗｈｅｎｃｏｍａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．０５．ＲＴ－ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈｅ － ｐｇｐＰ＜０ｇｇｐ３ｇ β
ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｏｌⅡｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｉｍｅｉｎａｌｌｔｈｅｔｈｒｅｅｒｏｕｓ．ＴｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｒｅｃａｎｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｒｏｕｓｅｘｍＲＮＡ －ｐｇｐｐｇｇｇｐ
ｒｏｕｒｏｕ．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｃｅｔｔｈｅＴＧＦｗａｓｍｕｃｈｓｔｒｏｎｅｒｔｈａｎｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓｎｔｈｅｓｉｓｏｆＳＯＸ９ｐｒｏ － －ｐｇｐｙｐｇｙ２ｇ β
）ｔｅｉｎｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｂｏｔｈＴＧＦｎｄＴＧＦｒｏｕｓｗｈｅｎｃｏｍａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕＰ＜０．０５．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＧＦ － － Ｔ－ｐｐｇｐ（１ａ３ｇ１βββ
，ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｏｍｏｔｅｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｏｆＰＳＣｓｗｈｉｌｅＴＧＦｎｄＴＧＦａｎｉｔ．ＢｏｔｈＴＧＦｎｄＴＧＦｎｓｔｅａｄｏｆＴＧＦａｎ － － － － －ｐｐ２ａ３ｃ１ａ３ｉ２ｃβββββ
ｒｏｍｏｔｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＰＳＣｓ． ｐ
）；；；ｒｅｃａｒｔｉｌａｉｎｏｕｓｒｏｗｔｈｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｅｗｏｒｄｓｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＰＳＣｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆａｃｔｏｒｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐ － ｐ ｄｇｇｇｙ β
△
，ＤｉｎＲａｎ，ＷａｎＱｉｎＣａｉＸｉａｎｈｕａ ｇｇｇ
尽管传统的手术 软骨自我修复能力极为有限，
但实际上髓腔及血液治疗可以起到一定修复作用，
：＿丁 然，男，医学博士，１９７９年生，Ｅ－ｍａｉｌｄａｎａｄｏｃｔｏｒｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ＠ｈ
△通讯作者，，：＿ＣｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎａｕｔｈｏｒＥ－ｍａｉｌｗａｎｉｎ６３．ｃｏｍｋ＠１ｐｇｇｑｇｇ
中的成软骨细胞无法到达损伤部位，进而增殖分化
１］
，最终损伤部位将形成具有一定强度的软骨组织［
为纤维疤痕组织所替代，无法恢复关节正常的生理构造和功能。故软骨损伤的治疗一直困扰着临床工
·６６０·
华中科技大学学报（医学版）０１３年１２月第４２卷第６期 ２
作者，而利用组织工程的手段治疗软骨及骨骺损伤），也成为目前研究的热点。前软骨干细胞（因ＰＳＣｓ其具有定向增殖分化为成熟软骨细胞的能力而有望成为一种较为理想的组织工程学种子细胞，为越来越多的研究者所重视。转化生长因子－ｔｒａｎｓｆｏｒ－β（，）是一种多功能蛋ｒｏｗｔｈｍｉｎｆａｃｔｏｒｂｅｔａＴＧＦ －ｇｇ β白质，可以影响多种细胞的生长、分化、凋亡及免疫调节等功能。ＴＧＦ－β家族在调控胚胎源性干细胞它能通过提增殖与分化中也起到极为重要的作用，
高Ｃｏｘ９基因转录而上调骨髓间充质干细胞软骨基因的表达，通过抑制Ｒｕｎｘ２基因转录而阻止骨髓间
］２３－。Ｔ充质干细胞向成骨细胞分化［ＧＦ－β包括５个４］
，其中Ｔ亚型［ＧＦＴＧＦＧＦ－－－１、２和Ｔ３存在于哺βββ
５］
。３种亚型均具有介导不同来源的间乳动物体内［
即新生动物骺板周围骨膜环形组织结ＬａＣｒｏｉｘ环，
３
。Ⅰ型胶原构，仔细分离该环，剪成小块（＜１ｍｍ）酶消化１ｈ，密度梯度离心法去除死细胞，将收集到的细胞接种于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液中，３７．５℃、５％ＣＯ２４ｈ后使用２培养箱中培养。将原代细缓冲液（ＰＢＳ０．５％ＢＳＡ２ｍｍｏｌＥＤＴＡ）－－
胞悬浮，用３０μｍ孔径过滤器去除聚集的细胞团，制备成单细胞悬液。用兔多克隆抗体ＦＧＦＲ３室温－７
，离心，缓冲液洗涤２遍。按每１×１孵育１５ｍｉｎ０
个细胞加入２室０μＬ羊抗兔ＩＧ－免疫磁珠复合物，ｇ
。缓冲液洗涤细胞２次，温孵育１离心，按每１５ｍｉｎ
７
ｍＬ细胞加５００μＬ缓冲液制备成细胞悬液，×１０
移入细胞分离阳性选择柱，按照说明书操作得到
。将Ｐ即ＰＦＧＦＲ３阳性细胞，ＳＣｓＳＣｓ加入含１０％－胎牛血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液中置于５％ＣＯ２细胞培养箱中培养，每３ｄ换液１次，当贴壁细胞覆盖满瓶底时，以０取第３．５％的胰蛋白酶消化液传代，代细胞用于下一步的体外实验。
１．３ 实验分组
充质细胞分化形成软骨细胞的能力，但对不同类型
］６８－，的细胞其诱导效应存在很大的差异［对于ＰＳＣｓ
细胞的诱导效应尚未见相关报道。本实验旨在观察３种ＴＧＦＳＣｓ细胞增殖与分－β亚型细胞因子对于Ｐ
并对三者的诱导能力加以比较，以寻找能化的影响，
高效促进种子细胞分化增殖的细胞因子。１ 材料与方法
１．１ 实验材料
，取生长状态良好的第３代Ｐ以０ＳＣｓ．５％的胰蛋白酶消化液３用含１７℃下消化２ｍｉｎ，０％胎牛血弯头吹打，将悬清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液终止消化，调整细胞密度约浮细胞分别种植于数块９６孔板中，置于５％Ｃ１０００个／孔，Ｏ ２细胞培养箱中培养过夜，
待细胞贴壁后，实验组分为３组（ＴＧＦＴＧＦ－－１组、β，分别在９ＴＧＦ６孔板中加入重组－２组、３组）ββ
调整每孔ＴＴＧＦＴＧＦＴＧＦＧＦ－－－－１、２、３，ββββ浓度为
／这一浓度被证实能诱导其它干细胞向软１０ｎｍＬ，ｇ
９］
，空白对照组只使用含１骨分化［０％胎牛血清的
１．１．１２ｈ内新生的纯 实验动物 实验动物选用１
体重８ｇ左右。由华中科技系清洁级雌性ＳＤ大鼠，大学同济医学院实验动物学部提供，实验动物许可，证号：鄂）乳鼠饲养在保持恒温ＳＹＸＫ（２００９００２８－恒湿（的清洁动物饲养房内。２３℃，５０％）
１．１．２ 试剂与仪器 重组ＴＧＦＴＧＦＴＧＦ－－－１、２、ββ，，，ＦｉｔｚｅｒａｌｄＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＣｏｎｃｏｒｄＭＡ）ＤＭＥＭ培 ｇ３（β
，，优质胎牛血清（，养液（ＨｃｌｏｎｅＵＳＡ）Ｇｉｂｃｏｙ，羊抗兔ＩＵＳＡ）ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁珠细胞分选系统、Ｇｇ
，），免疫磁珠（兔多克隆抗体ＦＭｉｌｔｅｎｉＧｅｒＧＦＲ３－ｙ（，，ＳａｎｔａＣｒｕｚＵＳＡ）Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ， ｇ
，，反转录试剂盒（ＵＳＡ）ＴＯＹＯＢＯ，ＪＰＮ）ＰＣＲ引物（，由武汉Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司代为合成）ＴａＭｉｘＤＮＡ ｇｑ，聚合酶（鼠抗人ＢＴＯＹＯＢＯ，ＪＰＮ）ｒｄＵ单克隆抗体（，，ＳｉｍａＵＳＡ）ＦＩＴＣ荧光标记的二抗（Ｄａｋｏｇ，、，噻唑蓝（二甲基亚砜（ＤＥＮ）ＭＴＴ）ＤＭＳＯ，ＳｉｍａｇＵＳＡ）流式细胞仪ＦＡＣＳｏｒｔ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｓｏｎ， ，。上海富众生物公司）ＵＳＡ）ＳＡＢＣ试剂盒（
分离、纯化与培养１．２ ＰＳＣｓ的提取、
实验组各组按ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液。每日换液１次，照上述浓度重新添加含有重组ＴＧＦ０％胎牛－β的１血清的ＤＭＥＭ－空白对照组换液使用Ｆ１２培养液，含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液。
／１．４ ＭＴＴ法及ＢｒｄＵＰＩ双参法测定细胞增殖活性
１．４．１ ＭＴＴ法 分别取培养后第０、３、６、９天的
各组细胞，每孔加入ＭＴ孵育４ｈ，吸弃孔内Ｔ溶液，培养上清液。每孔加１脱色摇床振５０μＬＤＭＳＯ， 在酶联免疫监测仪上测定各孔在波长５荡，７０ｎｍ处的吸光度（值。Ａ）
／向目１．４．２ ＢｒｄＵＰＩ双参法 取培养６ｄ的细胞，
／的细胞培养液内加入Ｂ浓度为５μ消化ｒｄＵ，ＬｍＬ，收集细胞，取固７０％乙醇固定，－２０℃条件下过夜，／定后的细胞，再加入２ｍＰＢＳ洗涤２遍，ｏｌＬ盐酸作用３成分为００ｍｉｎ，ＰＢＳ．１％ＢＳＡ，０．２％Ｔｗｅｅｎ－Ｔ（），洗３遍，加鼠抗Ｂ２０ｒｄＵ一抗（１∶１００）３７℃条件
由于ＦＧＦＲ３可作为ＰＳＣｓ细胞特殊的表面标－志物而被鉴定，故可通过免疫磁珠法进行分选纯化。新生Ｓ低倍显微镜视野下环行切取Ｄ大鼠处死后，
丁 然等．转化生长因子－β不同亚型对前软骨干细胞增殖分化的影响
·６６１·
下孵育２ｈ。Ｐ加入ＦＢＳ洗２遍，ＩＴＣ标记的羊抗鼠），二抗（室温放置１ｈ，上流式细胞仪检测。１∶２０
１．５ ＲＴＰＣＲ检测ＣｏｌＡｒｅｃａｎ基因的表达－Ⅱ、ｇｇ
２ 结果
２．１ ＴＧＦＴＧＦＴＧＦＳＣｓ增殖及ＤＮＡ合成－－－１、２、３对于Ｐβββ的影响
分别在培养第０、３、６、９天收集细胞。采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测不同组ＰＳＣｓ细胞ＣｏｌⅡ、Ａｒｅｃａｎｇｇｒｉｚｏｌ法提取ＲＮＡ。ＰＣＲｍＲＮＡ表达情况。采用Ｔ各引物序列如下：上游引物５ＣｏｌⅡ（２２５ｂ′－ｐ），下游引物５ＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＡ３′′－－；（）ＣＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＧＧＴＣＣＴＡ－３′Ａｒｅｃａｎ２７６ｂｇｇｐ，上游引物５′ＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＡ３′－Ｇ－。下游引物５′－ＧＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＡ３′－按以下条件进行反转录反应：９５℃预热５ｍｉｎ；９５℃，，，变性３循环３０ｓ５７℃退火３０ｓ７２℃扩增１０ｍｉｎ５。反应结束后取５μ次；７２℃延伸１０ｍｉｎＬ扩增产
物在２％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像，采用图像分析系统（检测条带的积分吸光ＡｌｈａＩｍａｅｒ２０００） ｐｇ度值，以与内参βａｃｔｉｎ的比值反映ｍＲＮＡ表达水－平。
１．６ 免疫组化法测定ＳＯＸ９的表达情况
Ｔ法检测细胞增殖活性结果见图１。培养３ ＭＴ
ＴＧＦｄ后，－１组细胞的增殖活性较对照组明显下β降，ＴＧＦＴＧＦ－－２、３组与对照组相比较差异无统计ββ。培养６ｄ后，学意义（与对照组相比，Ｐ＞０．０５），而ＴＧＦＰ＜０．０５）－１组细胞增殖活性明显降低（β
其细胞的ＴＧＦＴＧＦ－－２、３组则显示了相反的结果，ββ，增殖活性较对照组明显增强（且第９天Ｐ＜０．０５）
时Ｔ差异具有统计学意义ＧＦＧＦ－－３组高于Ｔ２组，ββ（）。Ｐ＜０．０５
／ＢｒｄＵＰＩ双参法流式细胞术检测结果见图２。其中Ｒ２区域内红点代表正进行ＤＮＡ合成活动的细胞，与空白Ｒ２为ＢｒｄＵ阳性细胞率。培养６ｄ后，对照组Ｒ２（２４．８８±２．１７）％相比较，ＴＧＦ２－１组Ｒβ
明显下降，为（提示细胞Ｄ７．３５±１．５９）％，ＮＡ合成显著下降，而Ｔ分别为ＧＦＴＧＦ２升高，－－２、３组Ｒββ（提示细胞３３．２５±４．０８）％和（３９．１８±５．９１）％，ＤＮＡ合成增加。
可ＳＯＸ９是由成熟软骨细胞合成的一种蛋白，
间接提示细胞的分化成熟程度。取培养９ｄ后的各使用Ｓ组细胞，ＡＢＣ试剂盒检测各组细胞ＳＯＸ９的按厂家说明书指示进行操作。结果判定表达情况，
方法：ＳＯＸ９阳性表现为细胞膜或者细胞质出现明确的棕黄色反应物，无胞膜或胞质染色为阴性，每组选取细胞分布均匀的２作为观察０个视野（２００倍）区，由２位观察者先后判断同一视野ＳＯＸ９蛋白表求出２达阳性或阴性的细胞数，０个视野内各种细胞计算阳性细胞的百分比。的平均值，
１．７ 统计学分析
采用ＳＰＳＳ１１．０软件进行统计学分析。计量资 料以ｘ多组间均数比较采用Ｏｎｅａ珚±ｓ表示，－Ｗｙ
．０５为差异有统计学意义。ＡＮＯＶＡ检验。以Ｐ＜０
＊＃与对照组比较，与ＴＰ＜０．０５；ＧＦ０．０５－３组比较，Ｐ＜β
图１ ＭＴＴ检测各组细胞增殖活性
ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｏｕＦｉ．１ＭＴＴａｓｓａｓｈｏｗｉｎｔｈｅｏｆＰＳＣｓｉｎｅａｃｈ ｙｇｐｇｐｇ
／图２ ＢｒｄＵＰＩ双参法测定各组细胞ＤＮＡ合成情况
／Ｆｉ．２ＤＮＡｓｎｔｈｅｓｉｓｉｎｅａｃｈｒｏｕｅｘａｍｉｎｅｄｂＢｒｄＵＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎ ｙｇｐｙｇｇ
·６６２·
华中科技大学学报（医学版）０１３年１２月第４２卷第６期 ２
２．２ ＴＧＦＴＧＦＴＧＦｏｌⅡ、Ａｒｅｃａｎ基因表达－－－１、２、３对Ｃｇｇβββ的影响
）。增加（图５
２．３ 免疫组化法检测ＳＯＸ９的表达
、、、ＴＰＣＲ检测培养０３６９ｄ各组细胞Ｃｏｌ 通过Ｒ－Ⅱ
）。随着时间的延长，基因的表达情况（图３与空白对照组相比，ＴＧＦＴＧＦＴＧＦｏｌⅡ基因表达－－－１、２、３组的Ｃβββ）；图４在培养９ｄ时Ｔ均呈上升趋势（ＧＦＴＧＦ－－１、２组ββ）。的Ｃ基因表达均明显低于Ｔ均Ｐ＜ｏｌＧＦ０．０５Ⅱ－３组（β免疫组化检测结果如图６所示。对照组及ＴＧＦＴＧＦＴＧＦ－－－１、２、３组的阳性细胞率分别为：βββ
（（（１０．５±１．２）％、５３．６±５．６）％、１１．４±２．５）％、）（６２．５±５．９％。ＴＧＦ－２与对照组相比差异无统计β
），学意义（而ＴＰ＞０．０５ＧＦＴＧＦ－－１、３组均明显高ββＴＧＦ－β１与ＴＧＦ－β
３组Ａｇｇｒｅｃａｎ的表达随培养时间延于对照组（Ｐ＜０．０５
）。长而增加，但ＴＧＦ－β
２组Ａｇｇｒｅｃａｎ的基因表达无明显Ａ：对照组；Ｂ：ＴＧＦ－β１组；Ｃ：ＴＧＦ－β２组；Ｄ：ＴＧＦ－β
３组；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；１～４：培养０、３、６、９ｄ图３ ＲＴ－ＰＣＲ检测各组ＣｏｌⅡ的表达
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣｏｌⅡｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ＲＴ－ＰＣＲ与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５；与ＴＧＦ－β３组比较，＃Ｐ＜０．０５与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５；与ＴＧＦ－β
３组比较，＃Ｐ＜０．０５图４ 各组ＣｏｌⅡ基因表达水平比较
图５ 各组Ａｇｇ
ｒｅｃａｎ基因表达水平比较Ｆｉｇ
．４ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＣｏｌⅡｇｅｎｅ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐＦｉｇ
．５ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ａｇｇｒｅｃａｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐＡ：对照组；Ｂ：ＴＧＦ－β１组；Ｃ：ＴＧＦ－β２组；Ｄ：ＴＧＦ－β
３组图６ 免疫组化法测定ＳＯＸ９的表达（×２００
）Ｆｉｇ
．６ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＳＯＸ９ｐｒｏｔｅｉｎ（×２００）丁 然等．转化生长因子－β不同亚型对前软骨干细胞增殖分化的影响
·６６３·
３ 讨论
）前软骨干细胞（是来源于哺乳动物骺板ＰＳＣｓ周围的Ｌ具有定向ａＣｒｏｉｘ环内的一种软骨母细胞， 且Ｐ增殖分化为成熟软骨细胞的能力，ＳＣｓ细胞膜可被分表面存在特异性表面标记物ＦＧＦＲ３受体，－离纯化，故ＰＳＣｓ是一种理想的组织工程学种子细胞，为越来越多的研究工作者所重视。
）、ＴＧＦＢＭＰ’ｓ－β超家族主要包括骨形态蛋白（）生长分化因子（以及３种ＴＧＤＦ’ｓＧＦ亚型ＴＧＦ－［１０］
。３种亚型在调控细胞增殖ＴＧＦＴＧＦ－－１、２、３βββ
１１］
。近年来分化和发育中起到十分重要的作用［
亚型对细胞软骨形成过程的诱导分化作用主要通过与细胞膜表面Ｔ进而激活多ＧＦ－１、２、３等受体结合，β种细胞内信号途径的传导，其一主要为依赖信号分
［８］
子Ｓ传导，其二主要涉及活化蛋白激酶ｍａｄ家族１１９］
。研究表明成熟软骨分化时通过Ｔ信号路径［ＧＦ－ｔ路径在调控上存在β激活的信号级联放大和Ｗｎ２０］
。Ｔ交联关系［ＧＦ－β超家族生物活化的调控是通过和细胞外基质蛋白（如蛋白聚糖）等相结合产生的
］２１２２－，通过改变细胞因子和相应相互作用来实现的［
细胞表面受体的结合来调控细胞生物活性。
综上，ＴＧＦＴＧＦＧＦ－－－１、２与Ｔ３对体外培养βββ的ＰＳＣｓ细胞增殖和分化的影响具有显著差异，ＴＧＦ－３较另２种亚型对于增殖和分化的正向调节β
作用更为显著。但由于细胞的增殖分化作用极为复杂，且具有上述功能的细胞因子种类繁多，进一步探寻其作用机制，寻找并比较其它相关细胞因子的作用效应还需要我们更加广泛、深入的研究。
参 考 文 献
［］ Ｋ，１ｏｍáｒｅｋＪＶａｌｉＰ，ＲｅｋｏＭ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｅｃａｒｔｉ －ｐｐ
ｌａｅｄｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｋｎｅｅｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｏｕｓｃｈｏｎｄｒｏｃｔｅｔｒａｎｓ －ｇｇｙ
：［］ｌａｎｔａｔｉｏｎｌｏｎｔｅｒｍｒｅｓｕｌｔｓＪ．ＡｃｔａＣｈｉｒＯｒｔｈｏＴｒａｕｍａ－ －ｐｇｐ ，，（）：ｔｏｌＣｅｃｈ２０１０７７４２９１２９５． －［，２］ ＰｅｉＭ，ＣｈｅｎＤ，ＬｉＪｅｔａｌ．Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｌａｓｅ４ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｙ
ＴＧＦｂｅｔａ１ｉｎｄｕｃｅｄｓｎｏｖｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｃｈｏｎｄｒｏｅｎｅ－－ －ｙｇｓｉｓｂｕｔｉｎｈｉｂｉｔｓｃｈｏｎｄｒｏｅｎｉｃａｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｈ － －ｇｙｙ
［］，，（）：ｅｒｔｒｏｈＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ２００９７８５２６０２６８．－ｐｐｙ
［］ Ｍ３ｅｍｏｎＭ Ａ，ＡｎｗａＭ Ｄ，ＣｏｖｅｒｔＴＲ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ ｙｇ
（，ｆａｃｔｏｒｂｅｔａＴＧＦｂｅｔａ１ＴＧＦｂｅｔａ２ａｎｄＴＧＦｂｅｔａ３）ｒｏｗｔｈ ｇ
ｈｅｎｏｔｅｓｏｎａｄａｌｎｕｌｌｕｔａｎｔｉｎｅｍｂｒｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ－ｍ ｐｙｐｙｇｐ
［］，（／）：Ｊ．ＭｏｌＣｅｌｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ２００８，２９４１２７０８０． －［］ Ｍ，４ａｓｓａｕｅＪ．ＲｅｃｅｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅＴＧＦｂｅｔａｆａｍｉｌＪ］．Ｃｅｌｌ － ｇｐｙ［
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［］，，，９ ＸｕＹＢａｌｏｏｃｈＧＣｈｉｏｕＭｅｔａｌ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌ ｙｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｅａｒｌｃｈｏｎｄｒｏｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄａｄｉｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄ －ｐｐｙｇｐ
ｃｅｌｌｓ（ＡＳＣ）ｕｓｉｎａｎｉｎｖｉｔｒｏｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｍｉｓｔｒｏｍａｌ － －ｇ
［］，ｃｒｏｍａｓｓｃｕｌｔｕｒｅｓｓｔｅｍＪ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｈｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ ｙｐｙ
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ｄｕｃｔｉｏｎｏｆＴＧＦｂｅｔａ１ｐｒｏｍｏｔｅｓｍｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ － －ｙ
［］ｔｉｏｎｏｆｎｅｏｎａｔａｌｌｕｎｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪ．ＡｍＪＰｈｓ －ｇｙｙ
，，（）：ｉｏｌＬｕｎＣｅｌｌＭｏｌＰｈｓｉｏｌ２０１０２９８６７３５７４３． －ｇｙ
［１３］ａｒｋＫ Ｈ，ＮａＫ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆａｃｔｏｒｓｏｎｃｈｏｎｄｒｏｅｎｉｃｒｏｗｔｈ Ｐ ｇｇ
ＴＧＦ对各种来源的间充质干细胞增殖分化的影响
［２］
作用为越来越多的学者所关注。Ｐ研究ｏｏｖａ等１ｐ发现来源于人类婴儿支气管的间充质干细胞能自分泌Ｔ并通过ＴＧＦＧＦ－－１，１诱导细胞分化成为肌纤ββ
［３］
的研究发现Ｔ维母细胞。Ｐａｒｋ等１ＧＦ－３能够显β
著促进兔间充质细胞增殖并诱导其向软骨细胞定向
［４］
分化。Ｓ比较骨形态蛋白２、ｈｉｎｔａｎｉ等１７和ＴＧＦ－３１对滑膜来源的间充质细胞诱导分化能力发现，β种ＴＧＦ－β超家族细胞因子均具有诱导间充质细胞向软骨细胞分化的能力，其程度呈时间依赖性，且ＴＧＦ－１较其它二者的诱导能力更强。β
［５］
观察ＴＪａｍｅｓ等１ＧＦＴＧＦ－－１、３对人类胚胎ββ颅骨囟门处间充质细胞增殖分化的影响，结果发现但能促进其向成熟ＴＧＦ－１可抑制间充质细胞增殖，β
软骨细胞分化，并能促进细胞外基质的合成，而且不ＴＧＦ－３对间充质细胞的增殖则起到抑制作用，β
１６］
具有诱导分化的能力。陈建国等［发现ＴＧＦ－α对于人表皮干细胞的增殖也有促进作用。
间充质细胞的聚集是软骨形成的先决条件，Ｔｕｌｉ等
的研究发现ＴＧＦ－１能够上调间充质细β
）及聚糖蛋白（的胞钙粘素（ｃａｄｈｅｒｉｎ）ｌｃｏｒｏｔｅｉｎｓｇｙｐ表达，而以上２种物质具有引发细胞聚集的作用，并且能够影响细胞外基质成分ＣｏｌⅡ、Ａｒｅｃａｎ的表ｇｇ达和成熟软骨细胞标志物ＣｏｌⅩ的表达。
以上研究结果提示ＴＧＦ－β具有调控不同来源间充质细胞增殖分化的能力，但其效应因细胞种类的不同而存在很大的差异性。为寻找一种高效的细胞因子以促进ＰＳＣｓ增殖并诱导其向成熟软骨细胞，分化，本实验选用３种亚型Ｔ比较其对ＰＧＦＳＣｓ－β增殖分化的影响，结果发现ＴＧＦＳＣｓ的－１能抑制Ｐβ而Ｔ增殖，ＧＦＴＧＦ－－２、３在作用６ｄ后能促进细胞ββ
增殖。ＴＧＦＴＧＦＳＣｓ细胞分化的－－１、３具有诱导Ｐββ能力，而ＴＧＦＧＦ－－２无明显诱导作用。不同Ｔββ的
［１７］
·６６４·
华中科技大学学报（医学版）０１３年１２月第４２卷第６期 ２
ｃｅｌｌｓｏｆｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉａｍｅｎｔｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｒｏｅｎｉｔｏｒ － ｐｇｐｇ
］ｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｈＳｍａｄ－ａｎｄ３８ＭＡＰＫｄｅｅｎｄｅｎｔｓｉｎａｌｓ［Ｊ． － ｇｐｐｇ
，，（）：ＪＢｉｏｌＳｃｉ２０１２８７１０６２１０７４．Ｉｎｔ －［］，，１９ ＴｕｌｉＲＳｅｈａｔｏｌｅｓｌａｍｉＭ ＲＴｕｌｉＳ，ｅｔａｌ．３８ＭＡＰｋｉｎａｓｅ ｇｐ
ｏｆＡＰ２ｂｉｎｄｉｎｉｎＴＧＦｂｅｔａｌｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｃｈｏｎｄｒｏｒｅｕｌａｔｉｏｎ － －－ －ｇｇ
］ｏｆｈｕｍａｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒｂｏｎｅｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｓ［Ｊ．ＡｎｎＮＹｅｎｅｓｉｓ － ｇ
，，：ＡｃａｄＳｃｉ２００２９６１１７２１７７． －［］，，２０ＺｈｏｕＳＥｉｄＫＧｌｏｗａａｃｋｉＪ．ｏｒｅｒａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴＧＦａｎｄ Ｃ －Ｂ ｐ
ａｔｈｗａｓｄｕｉｎｃｈｏｎｄｒｏｃｔｅａｎｄａｄｉｏｃｔｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｎｔ ｐｙｇｙｐｙ
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ａｃｔａｓａｄｕａｌｍｏｄｕｌａｔｏｒｏｆＴＧＦｂｅｔａａｃｃｅｓｓｔｏｓｉｎａｌｉｎｃａｎ － ｇｇ
：ｒｅｃｅｔｏｅｓｍａｉｎｏｆｌｉａｎｄｂｉｎｄｉｎａｎｄＧＡＧａｔｔａｃｈｍｅｎｔｓｉｔｅｓ ｐｐｇｇｇ
［］，，（）：Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９４１２４４５５７５６８． －［］杨述华，冯勇，等．２２ＴＧＦ１ 禹虔，－β短时间干预间充质干细胞可
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（）：医学版，２０１２，４１５５２３５２８．－（２０１３０６２０－－ 收稿）
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［］ｎｉａｌｓｕｔｕｒｅｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＪ．ＰｌａｓｔＲｅ － －ｙ －，，（）：ｃｏｎｓｔｒＳｕｒ００９１２３１３１４３． －ｇ２
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ｔａｅｄｉａｔｅｄｃｈｏｎｄｒｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｒｏｅｎｉ－ｍ －ｏ －ｇｙｐｇｔｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｏｌｖｅｓＮｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄｍｉｔｏｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｏｔｅｉｎ － ｇｐ
［］，ａｎｄＷｎｔｓｉｎａｌｉｎｃｒｏｓｓｔａｌｋＪ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００３，ｋｉｎａｓｅ － ｇｇ
（）：２７８４２４１２２７－４１２３６．
［］１８ｏｓｈｉｄａＭ，ＯｋｕｂｏＮ，ＣｈｏｓａＮ，ｅｔａｌ．ＴＧＦｏｅｒａｔｅｄｒｏｗｔｈ Ｙ －－ ｐｇβ
ａｎｄｔｒａｎｓｌｉｎｅａｅｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔｉｎｔｏｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｇ
上接第６５８页） （
［］ Ｃ５ａｌｉｎＧ Ａ，ＣｒｏｃｅＣ Ｍ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎａｔｕｒｅｓｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃ －ｇ
［］，，（）：ｅｒｓＪ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００６６１１８５７８６６． －［］ Ｇ，，，６ｕａｎＨＷｅｉＧＷｕＪｅｔａｌ．ＤｏｗｎｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ２１８２ －ｇ －－ｉｔｓｈｏｓｔｅｎｅＳＬＩＴ３ｃｏｏｅｒａｔｅｔｏｒｏｍｏｔｅｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄａｎｄ ｇｐｐ
［］，ｏｆｔｈｒｏｉｄｃａｎｃｅｒＪ．ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂｒｏｒｅｓｓｉｏｎ ｙｐｇ
（）：２０１３，９８８Ｅ１３３４１３４４．－Ｅ
［］ Ｔ，７ｉｅＪＰａｎＹ，ＺｈａｏＬ，ｅｔａｌ．ｍｉＲ２１８ｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅ － －［］ｔａｓｔａｓｉｓｏｆａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｂｔａｒｅｔｉｎｔｈｅＲｏｂｏ１ｒｅｃｅｔｏｒＪ． ｇｙｇｇｐ
，，（）：Ｇｅｎｅｔ２０１０６３ｅ１０００８７９．ＰＬｏＳ
［］ Ｌ，，，８ｉｕＹＹａｎＷＺｈａｎＷｅｔａｌ．ｍｉＲ２１８ｒｅｖｅｒｓｅｓｈｉｈｉｎｖａ － －ｇ ｇ
ｓｉｖｅｎｅｓｓｏｆｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｓｂｔａｒｅｔｉｎｔｈｅｏｎｃｏｅｎｉｃｔｒａｎ －ｇｙｇｇｇ
［］，，（）：ｓｃｒｉｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＬＥＦ１Ｊ．ＯｎｃｏｌＲｅ０１２２８３１０１３ －ｐｐ２
１０２１．
［］ Ｌ９ｅｉｔｅＫ Ｒ，ＳｏｕｓａａｎａｖｅｚＪＭ，ＲｅｉｓＳＴ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｎｅｉｎｅｘ －Ｃ －ｇ
，ｏｆｍｉＲｌｅｔ７ｃｍｉＲ１００，ａｎｄｍｉＲ２１８ｆｒｏｍｈｉｈｒｅｓｓｉｏｎｒａｄｅ －－ － ｇｐｇ
［］，ｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｔｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓＪ．ＵｒｏｌＯｎｃｏｌ２０１１，ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｐ
（）：２９３２６５２６９．－［］１０ｈｉａｖａｃｃｉＥ，ＤｏｌｆｉＬ，ＶｅｒｄｕｃｉＬ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ２１８ｍｅｄｉ Ｃ －ａｔｅｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＴｂｘ５ａｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｈｅａｒｔ － ｐ
［］，，（）：ＰＬｏＳＯｎｅ２０１２７１１ｅ５０５３６．ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔＪ． ｐ
［］／／１１ｉｓｈＪＥ，ＷｔｈｅＪＤ，ＸｉａｏＴ，ｅｔａｌ．ＡＳｌｉｔｍｉＲ２１８Ｒｏｂｏｒｅ Ｆ － －ｙｇ
ｕｌａｔｏｒｌｏｏｉｓｒｅｕｉｒｅｄｄｕｒｉｎｈｅａｒｔｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｚｅ －ｙｐｑｇ
［］，，（）：ｂｒａｆｉｓｈＪ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ２０１１１３８７１４０９１４１９．－ｐ
［］，，，１２ＨｅＸＤｏｎＹＷｕＣＷｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ２１８ｉｎｈｉｂｉｔｓｃｅｌｌｃ － －ｇｙ
ｃｌｅａｎｄａｏｔｏｓｉｓｉｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｂｒｏｒｅｓｓｉｏｎｒｏｍｏｔｅｓ ｐｐｙｐｇｐ
［］ｄｏｗｎｒｅｕｌａｔｉｎＢＭＩ１ｐｏｌｃｏｍｂｒｉｎｆｉｎｅｒｏｎｃｏｅｎｅＪ．Ｍｏｌ ｇｇｙｇｇｇ
，，：Ｍｅｄ２０１２１８１４９１１４９８．－［］，，１３ｉＪＰｉｎＺＮｉｎＨ．ｍｉＲ２１８ｉｍａｉｒｓｔｕｍｏｒｒｏｗｔｈａｎｄｉｎ Ｌ － －ｇｇｐｇ
［］ｃｒｅａｓｅｓｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｔｏｃｉｓｌａｔｉｎｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＪ．Ｉｎｔ － ｙｐ
，，（）：ＪＭｏｌＳｃｉ２０１２１３１２１６０５３１６０６４． －［］，，１４ＫｉｎｏｓｈｉｔａＴＨａｎａｚａｗａＴＮｏｈａｔａＮｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｓｕｒｅｓ ， －ｐｐ
ｓｉｖｅｍｉｃｒｏＲＮＡ２１８ｉｎｈｉｂｉｔｓｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｉｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ － ｇｔｈｒｏｕｈｔａｒｅｔｉｎｌａｍｉｎｉｎ３３２ｉｎｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｓｕａｍｏｕｓｃｅｌｌ － ｇｇｇｑ
［］，（）：ｃａｒｃｉｎｏｍａＪ．Ｏｎｃｏｔａｒｅｔ２０１２，３１１１３８６１４００．－ｇ
［］，，，１５ ＺｈａｏＹＬｉＹＷａｎＬｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｒｅｓｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓ －ｇｐ
ｒｅｕｌａｔｅｄＴＲＡＩＬｅｘｒｅｓｓｉｏｎｓｈｏｗｓｓｅｃｉｆｉｃｓｕｒｖｉｖａｌｓｕ －－ｇｐｐｐ
［］ｒｅｓｓｉｎａｃｔｉｖｉｔｏｎｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒＪ．ＪＥｘＣｌｉｎＣａｎｃｅｒ ｐｇｙｐ
，２０１３，３２：１０．Ｒｅｓ
［］１６ａｍａｓａｋｉＴ，ＳｅｋｉＮ，ＹｏｓｈｉｎｏＨ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ２１８ｉｎｈｉｂ Ｙ －－ｉｔｓｃｅｌｌｍｉｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｉｎｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｔｈｒｏｕｈ ｇ ｇ
］ｃａｖｅｏｌｉｎ２ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎａｔｈｗａＪ．Ｊｔａｒｅｔｉｎ－ ｐｙ［ｇｇ
，，（）：Ｕｒｏｌ２０１３１９０３１０５９１０６８．－［］，，１７ ＺａｎｅｔｔｅＤＬＲｉｖａｄａｖｉａＦＭｏｌｆｅｔｔａＧ Ａ，ｅｔａｌ．ｍｉＲＮＡｅｘｒｅｓ －ｐ
ｓｉｏｎｒｏｆｉｌｅｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｍｈｏｃｔｉｃａｎｄａｃｕｔｅｌｍｈｏｃｔｉｃ ｐｙｐｙｙｐｙ
［］，（）：ｌｅｕｋｅｍｉａＪ．ＢｒａｚＪＭｅｄＢｉｏｌＲｅｓ２００７，４０１１１４３５１４４０． －［］，［］１８ ＨｏｗｅＬＲＢｒｏｗｎＡ Ｍ．ＷｎｔｓｉｎａｌｉｎａｎｄｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒＪ． ｇｇ
，（）：ＢｉｏｌＴｈｅｒ２００４，３１３６４１．Ｃａｎｃｅｒ －［１９］ｅａＴ，ＣｌｅｖｅｒｓＨ．Ｗｎｔｓｉｎａｌｌｉｎｉｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｃａｎｃｅｒ Ｒ ｙｇｇ
［］，，（）：Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ２００５４３４７０３５８４３８５０．－［］，，，２０ＤｅｈｎｅｒＭＨａｄｉｈａｎｎａｓＭＷｅｉｓｋｅＪｅａｌ．Ｗｎｔｓｉｎａｌｉｎｉｎ ｔ －ｊｇｇ
ｈｉｂｉｔｓｆｏｒｋｈｅａｄｂｏｘＯ３ａｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｎｄａｏｔｏｓｉｓ － ｐｐｐ
ｕｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍａｎｄｉｎｄｕｃｉｂｌｅｔｈｒｏｕｈｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ － － －ｐｇｇｇ［］，，（）：ｋｉｎａｓｅ１Ｊ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００８２８３２８１９２０１１９２１０． －［］ｒｏｔｅｉｎｓｒｅｖｅｎｔ２１ｌｍｅｉｄａＭ，ＨａｎＬ，ＢｅｌｌｉｄｏＴ，ｅｔａｌ．Ｗｎｔａ Ａ －ｐｐｐ
ｒｏｅｎｉｔｏｒｓｏｔｏｓｉｓｏｆｂｏｔｈｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄｏｓｔｅｏｂｌａｓｔａｎｄｄｉｆ －ｐｇｐ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｂｂｅｔａｃａｔｅｎｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔａｎｄｉｎｄｅ －－ －－ｙｐ
／ｓｉｎａｌｉｎｃａｓｃａｄｅｓｉｎｖｏｌｖｉｎＳｒｃＥＲＫａｎｄｅｎｄｅｎｔｈｏｓｈａｔｉ ｇ ｇｇｐｐｐ－
／］：ｄｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅＡＫＴ［Ｊ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００５，２８０（５０） － ｙ４１３４２４１３５１．－［］，２２ ＷａｎＨＦａｎＬ，ＸｉａＸ，ｅｔａｌ．ＳｉｌｅｎｃｉｎＷｎｔ２ＢｂｓｉＲＮＡｉｎ －ｇｇ ｙ
ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｉｎｈｉｂｉｔｓｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ ｐｙ
［］，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒＪ．ＩｎｔＪＧｎｅｃｏｌＣａｎｃｅｒ２０１２， ｙｙ
（）：２２５７５５７６１．－［］，，、饶玉梅王鸿雁范良生，等．２３ＭＴＡ１通过βｃａｔｅｎｉｎＭＭＰ９ －－］调节Ｈ侵袭、转移［华中科技大学学报：医ｅＬａ细胞粘附、Ｊ．
，，（）：学版２０１１４０１３２３６．－（２０１３０６１７－－ 收稿）
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