()JournalofHebeiUniversitNaturalScienceEditiony
河北大学学报(自然科学版)
Vol.39No.1
2019
:/DOI10.3969.issn.10001565.2019.01.011j
藤黄微球菌Rf因子对土壤细菌可培养p
物种分离效果的影响
李云琪,王宇辉,李小锦,孙健鹏,景凤霞,张秀敏
(河北大学生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用重点实验室,
)河北省微生物育种与保育工程实验室,河北保定 071002
通过在改良的V对采自Rf因子对细菌可培养物种多样性的影响.L55培养基中添加藤黄微球菌Rf因子,pp
河北涞水县上港村、青海三江源和云南无量山3个地区的3份土壤样品进行细菌的分离,并对所分离菌株进行1分析培养基添加藤黄微球菌R6SrRNA基因序列系统发育分析,f因子对土壤中可培养细菌物种分离p效果的影响.结果显示:河北土壤中不添加R添加Rf因子的对照组分离得到5个属,f因子的实验组分离pp得到8个属;青海土壤中对照组分离得到2个属,实验组分离得到6个属;云南土壤中对照组分离得到6个其中,青海三江源土壤中分离得到的菌株HBUM200161与多食鞘氨醇杆菌(Shinobacteriummultivo-pgT
亲缘关系最近,可能为鞘氨醇杆菌属(rum)IAM1431616SrRNA基因序列相似性为97.93%,Shinobac-pg()中图分类号:Q393.13 文献标志码:A 文章编号:10001565201901006306
属,实验组分离得到8个属.表明添加藤黄微球菌Rf因子的实验组分离得到的微生物物种较对照组丰富.p
摘 要:通过培养基添加藤黄微球菌Rf因子对3份土壤样品中的细菌进行分离以了解藤黄微球菌p
潜在的新种.terium)
;关键词:藤黄微球菌;细菌;分离Rfp
EffectsofRffactorofMicrococcusluteuspontheisolationofsoilculturableseciesp
(,EnineerinaboratorfMicrobialBreedinndPreservationofHebeiProvinceggLyoga
,CKeaboratorfMicrobialDiversitesearchandAlicationofHebeiProvinceolleeofyLyoyRppg
,H,LifeSciencesebeiUniversitBaodin71002,China)yg0themediumtounderstandtheeffectofRffactorontheculturableseciesdiversit.BddinheRfppyyagtp
factorofM.luteustothemodifiedVL55medium,thebacteriawereisolatedfromthreesoilsamlescol-p
:AbstractBacteriainthreesoilsamleswereisolatedbddinffactorfromMicrococcusluteustopyagRp
,WA,,,,LIYuniNGYuhuiLIXiaoinSUNJianenJINGFenxiaZHANGXiuminqjpgg
,,H,,Q,lectedfromShananillaeLaishuiCountebeiProvinceSanianuaninhaiandWulians-gggVgyjgygg
,hanYunnan.Thephloeneticanalsisofthe16SrRNAgeneseuencewascarriedoutontheisolatedygyq
收稿日期:20180525
;)国家自然科学基金资助项目(河北省自然科学基金资助项目( 基金项目:31270053)C2014201141,:李云琪(女,河北保定人,河北大学在读硕士研究生. 第一作者:1993—)E-mail1139539385@q.comq
:E-mailzhxiumin1106@126.com
,张秀敏(女,河北涞水人,河北大学教授,博士,主要从事微生物系统性及多样性研究. 通信作者:1970—)
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seciesinthesoilwasanalzed.Theresultsshowedthatfivegenerawereisolatedfromthecontrolgroupyp
,;inHebeisoilwithoutRffactorandeihtgenerawereisolatedfromthetestgrouithRffactortwopgpwp
,strainsandtheeffectofaddinffactortotheculturemediumonthesearationofculturablebacterialgRpp,enerawereisolatedfromthecontrolgrounQinhaisoilandsixgenerawereisolatedfromthetestgpig,,rouinthesoilofYunnansixgenerawereisolatedfromthecontrolrouandeihtenerawereisola-gp;gpgg
HBUM200161isolatedfromtheSanianuansoilinQinhaihastheclosestrelationshiithShinobac-jgygpwpgT,teriummultivorumIAM14316andthe16SrRNAgeneseuencesimilaritis97.93%,thestrainproba-qybleresentsanovelseciesofthegenusShinobacterium.yrpppg:;;KeordsMicrococcusluteus;Rfbacteriaisolatedpyw
tedfromthetestgrou.TheresultsshowthatthemicrobialseciesisolatedfromthetestgrouithM.pppw
luteusRfaddedwasmoreabundantthanthatofthecontrolgrou.Amonhem,thestrainppgt
[]
中发现了一种因子,它能使处于休眠、不1998年,Mukamolova等1在藤黄微球菌(Mcrococcusluteus)
[]2
,)分裂增长的细菌再次生长,被命名为复苏促进因子(resuscitation-romotinfactorRf.Rf为分子质量pgpp
]3
可以达到使休眠状态的细菌再次生长并加速细菌生长的作用[纯化的Ml16~17ku的分泌蛋白,..uteus[]
)有研究证明,添加Ml含天然R的Rf能够显著促进Ml.uteus休眠体的复苏生长4..uteus培养液上清(fpp
]5
分离培养基能够显著促进水样中可培养细菌的生长,增加可培养细菌的数量[.
组和对照组研究M.luteusRf因子对土壤细菌分离的影响.p
本实验通过培养、离心并过滤除菌得到M.并对其复苏活性进行检测,设置实验luteus的培养液上清,
1 材料与方法
1.1 菌株来源
藤黄微球菌(M.luteus)ACCC41016由中国农业微生物菌种保藏管理中心赠送.
1.2 样品采集
实验样品分别采自河北涞水县上港村、青海三江源和云南无量山3个地区,分别命名为土样1、土样21.3 Ml.uteusRf上清液的制备p和土样3.
[]
/将新活化的Ml.uteusACCC41016接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基6,37℃200rmin振荡培养18h
对数生长后期,将培养液离心,并用直径为0.获得Ml22μm的滤膜过滤,.uteusRf上清液.p
1.4 Ml.uteusRf上清液活性的测定p
[]后,以5%接种量转接到1测定O待培养至00mL的LMM液体培养基5中,37℃摇床培养,D600吸光度值,
[]7月,放置期间时常震荡混匀.将放置的Ml中,以加R.uteus菌液以5%接种量接种到Rf上p2A液体培养基
/将新活化的Ml室温放置3个.uteus接种到LMM液体培养基中,37℃200rmin振荡培养至稳定期,
清液与不加R测定O进而观察Mlf上清液的发酵管作对照,D.uteusRf因子对休眠期的细菌pp600吸光度值,1.5 土壤细菌的分离与培养
将上述3个土壤样品各称取1g分别加入盛有9含9gC的锥形瓶中,向其中加入9mL无菌水(aCO3)同时以不加Ml10mL过滤除菌后的Ml.uteusRf上清液以此样品作为实验组;.uteusRf上清液的样品作pp
/为对照组.处理完成后将实验组与对照组均置于摇床中进行培养,温度设置为3转速为2培养0℃,00rmin.
[-9]
,完成后在无菌条件下用无菌水进行稀释,分别选取1置于30-7~10-44个梯度涂布VL55平板80℃恒温
生长是否有促进作用.
培养箱.
初步观察菌落形态并选择不同形态单菌落,接种于5mLR0℃摇床振荡培养24h,2A液体培养基中3
第1期李云琪等:藤黄微球菌Rf因子对土壤细菌可培养物种分离效果的影响p
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1.6 细菌DNA的提取和16SrRNA基因扩增
基因组DNA使用康为世纪生物科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取.
[0][1]
和116SrRNA基因序列扩增采用通用引物27f1492r1.
]扩增体系及扩增条件参考文献[12-13.
纯化得到的菌种进行保藏,其他菌液离心收集用于提取基因组DNA.
1.7 16SrRNA基因测序及系统进化分析
:///扩增产物送通用生物系统(安徽)有限公司测序.将测序结果输入httswww.ezbiocloud.netidentifpy进行同源性分析.选择相关参考菌株序列,利用B然后使用MAGioedit进行排列对齐,E7.0系统发育和分子
14]
进化分析,以确认系统发育树的可靠性[bootstra00次,.p测试和重建被设置为10
2 结果
2.1 Ml.uteusRf上清液活性测定结果p
将休眠的Ml.uteus菌液以5%接种量接种到R2A液体培养基如图1.Ml.uteusRf因子活性,p
由图1可知,加M.luteusRf上清液的液体培养基较不加p说明Ml0.649,.uteusRf上清液对藤黄微球菌的复苏有促进作p]15
用[.2.2 分离所得菌株的种类
对河北涞水县上港村、青海三江源和云南无量山3个地区土样进行稀释分离,涂布V挑取单菌落后经PL55平板,CR检测与公司所示.
中,以加R从而测定f上清液与不加Rf上清液的发酵管作对照,pp
培养2Ml.uteusRf上清液的液体培养基更浑浊,4h测定其ODp600
值分别为1.培养4903和0.772,8h测定其OD.044和600值分别为2
:///测序,将测序结果使用httswww.ezbiocloud.netidentif.uteusRf上清液活性测定py网站图1 发酵液中Mlp对3个样品所分离菌株进行同源性分析,经统计,所得结果如表1Fi.1 DeterminationofMl.uteusRfgp
suernatantactivitinfermentationbrothpy
表1 分离自不同样品的细菌多样性
Tab.1 Diversitfbacteriaisolatedfromdifferentsoilsamlesyop
土壤样品土样1土样2土样3
分离菌株的种类对照组5个属实验组8个属对照组2个属实验组6个属对照组6个属实验组8个属
加入5%Mlb..uteusRf上清液.p
不加Mla..uteusRf上清液;p
2.3 土样1的分离结果
将土样1的实验组与对照组进行常规稀释,涂布在V将分离所得菌株的1L55基础培养基中,6SrRNA基因序列在E统计比对结果中所分离菌株的种类,得出土样1的分离效果,结zBioCloud中进行同源性比对,,,果如图2所示.对照组分离得到了无色小杆菌属(新鞘氨醇菌属(苍白Achromobacter)Novoshinobium)pg,,杆菌属(假单胞菌属(根瘤菌属(共5个属;实验组分离得到无Ochrobactrum)Pseudomonas)Rhizobium)
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,,,,柠檬酸杆菌属(贪铜菌属(肠杆菌属(勒克氏菌属(bium)Citrobacter)Curiavidus)Enterobacter)Le-p共8个属,其结果表明,添加藤黄微球菌培养液上清的实验组分离所得菌株比不添加的对照组微生clercia)2.4 土样2的分离结果
按照上述方法处理土样2,结果如图3所示.对照组仅分离得到无色小杆菌属(和寡养Achromobacter);,单胞菌属(实验组除对照组分离得到的2个属外,还分离得到芽孢杆菌属(伯Stenotrohomonas)Bacillus)p,,克霍尔德氏菌属(类芽孢杆菌属(假单胞菌属(共6个属,微Burkholderia)Paenibacillus)Pseudomonas)生物群落多样性较对照组丰富.物群落多样性丰富.
,,,色小杆菌属(苍白杆菌属(假单胞菌属(根瘤菌属(Achromobacter)Ochrobactrum)Pseudomonas)Rhizo-图2 土样1分离菌株的多样性分布
Fi.2 Diversitistributionofsoilsamle1isolatedstrainsgydp
图3 土样2分离菌株的多样性分布
Fi.3 Diversitistributionofsoilsamle2isolatedstrainsgydp
其中,菌株HBUM200161与最相近模式菌株多食鞘氨醇杆菌(Shinobacteriummultivorum)pgT
的1根据确定的细菌多相分类规则,菌株HIAM143166SrRNA基因序列同源性约为97.93%,BUM200161
可能为鞘氨醇杆菌属(潜在的新种,构建的系统发育树如图4所示.Shinobacterium)pg图4 菌株HBUM200161基于高同源性的16SrRNA基因序列构建的系统发育树
Fi.4 PhloenetictreeconstructedbtrainHBUM200161basedonhihlomolo6SrRNAgeneseuencegygysgyhgy1q
第1期李云琪等:藤黄微球菌Rf因子对土壤细菌可培养物种分离效果的影响p
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2.5 土样3的分离结果
按照土样1的方法处理样品3,结果如图5所示.添加藤黄微球菌培养液上清的实验组分离所得菌株的,,多样性较对照组丰富;对照组分离得到伯克霍尔德氏菌属(异地菌属(藤黄色杆Burkholderia)Inuilinus)q,,,菌属(甲基杆菌属(新鞘氨醇菌属(副伯克霍尔德氏Luteibacter)Methlobacterium)Novoshinobium)ypg,,,,新鞘氨醇菌属(罗尔斯通氏菌属(假单胞菌属(根瘤菌ia)Novoshinobium)Ralstonia)Pseudomonas)pg,,属(链霉菌属(黄色杆菌属(共8个属,但并未分离到对照组中的Rhizobium)Stretomces)Xanthobacter)py,,异地菌属(藤黄色杆菌属(甲基杆菌属(和副伯克霍尔德氏菌Inuilinus)Luteibacter)Methlobacterium)qy属(Paraburkholderia).
,菌属(共6个属;实验组分离得到伯克霍尔德氏菌属(马赛菌属(Paraburkholderia)Burkholderia)Massil-图5 土样3分离菌株的多样性分布
Fi.5 Diversitistributionofsoilsamle3isolatedstrainsgydp
3 讨论
Ml.uteusRf上清液活性测定结果显示Rf因子对培养在固体培养基和液体培养基中的微生物均有pp
[6]-17
复苏并促进生长的作用,该结果与Z的实验结果相符.hu及Mukamolova等人1照组丰富.其中,而目前认为划分细HBUM200161与其参比菌株的16SrRNA基因序列相似性为97.93%.
[8]菌新种的1因此,该菌株很有可能为潜在的新种.6SrRNA基因序列相似性阈值是98.65%1.
布于V结果表明添加藤黄微球菌培养液上清的实验组分离得到的微生物物种多样性较对L55基础培养基,被认为属于细菌的自分泌生长因子组分.在不可培养细菌的细胞壁Rf蛋白具有肽聚糖水解酶活性,p
19]
,中,新生肽聚糖被惰性肽聚糖所取代,使得其被膜成为一个“茧”样结构[在细胞壁进行复苏时,Rf蛋白p
20]
能作为信号物质参与了细菌的复苏过程[.
对在河北涞水县上港村、青海三江源和云南无量山3个地区采集的3份土样的微生物进行稀释分离涂
对细菌细胞壁进行溶解,从而促进V而RBNC状态的细菌复苏生长.f作用细胞壁后释放的小分子物质可p
加入信号分子后环境样本中微生物可培养细胞数量的提高,分析其原因可能是由于一些VBNC状态的
微生物恢复可培养性,分裂增殖的表现;另外一种可能是由于信号分子刺激某一类和少数几类相同种类的微生物的生长,从而表现出可培养数量的增加.
参 考 文 献:
[],,[]1 MUKAMOLOVAGV,KAPRELYANTSASYOUNGDIetal.AbacterialbtokineJ.ProceedinsoftheNationalAcad-yg
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河北大学学报(自然科学版)
,,()::/emfSciencesoftheUnitedStatesofAmerica199895158916-8921.DOI10.1073nas.95.15.8916.yop
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[]3 MUKAMOLOVAGV,TURAPOVOA,KAZARIANK,etal.TherfgeneofMicrococcusluteusencodesanessen-p
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2005.06.017.0002.2009.05.030.
(责任编辑:赵藏赏)
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