偶氮胂Ⅲ分光光度法测定生物样
品血清中的钙
The Spectrophotometric Determination of Calcium in Biological Samples with ArsenazoⅢ
化学与环境工程学院 化学工程与工艺系 （0507113班）
学生：王 喆 导师：胡伟华 翟庆洲
摘 要
研究了偶氮胂(ASAⅢ)与Ca2+的显色反应最佳实验条件。在pH 10.4 NH3-NH4Cl缓冲介质中，Ca（Ⅱ）与偶氮胂（ASAⅢ）形成蓝色络合物，该络合物的组成比为Ca（Ⅱ）：（ASAⅢ）＝1：1，最大吸收波长位于654nm处，表观摩尔吸光系数ε654nm ＝ 3.92×104 L·mol-1·cm-1，钙量在2～10μg/10 mL范围内遵守比耳定律。工作曲线回归方程： A = 0.0428 C + 0.148（C：μg Ca2+ /10 mL），相关系数γ = 0.9934。本法用于生物样品中钙的测定，6次测定相对标准偏差小于2%，加标回收率为98.0%～100.5%.
关键词：钙 分光光度法 偶氮胂 血清.
ABSTRACT
Calcium(Ⅱ) reacts with DBM-arsenazo to produce a 1:2(M:R) blue complex in NH3-NH4Cl buffer solution medium at pH 10.4. The maximum absorption wavelength of the complex locates at 628 nm. The apparent molar absorptivity of the method is ε628nm ＝ 3.92×104 L·mol-1·cm-1. Beer’s law is followed over the range of 2 ～ 10 μg of calcium in 10 mL of solution. The method was used in the determination of calcium in biological samples. The relative standard deviations of six replicate determinations were less than 2% and the recoveries of the standard addition were 98.0%～100.5%.
Key words: calcium， spectrophotometry， arsenazoⅢ，biological sample
目 录
摘 要…………………………………………………………… Ⅰ ABSTRACT……………………………………………………Ⅱ 第一章 分光光度法概述……………………………………… 1 1.1 引 言 ………………………………………………………1 1.2 基本原理……………………………………………………1 1.3 分光光度分析新方法………………………………………6 1.4分光光度法测定与其他方法联用……………………………9 第二章 钙 ………………………………………………………15 3.1 钙的性质……………………………………………………15 3.2 钙的应用……………………………………………………15 3. 3 钙对人体的影响 ……………………………………………16 3. 4 钙的生产工艺 ………………………………………………17 3. 3 分光光度法测定钙的进展 …………………………………18 第三章 偶氮胂分光光度法测定生物样品中的钙……………22 4.1 前言 …………………………………………………………22 4.2 实验部分………………………………………………………22 4.3结果与讨论 ……………………………………………………23 4.4样品分析 ………………………………………………………28 结 论………………………………………………………………31 致 谢………………………………………………………………32 参考文献……………………………………………………………33
第一章 分光光度法概述
1.1 引 言
分光光度法是获得物质吸收光特性及定性、定量信息的重要手段，在冶金、地质、生物、医学、农业、环境监测、食品卫生等领域得到了广泛应用[1]。随着研究的深入，现代光度分析应用范围已从传统的无机分析领域扩大到生命活性物质（核酸、蛋白质、氨基酸等）、环境污染物和形态分析，其中在生物分析方面的应用呈明显上升之势[2]。目前，在中国国家标准中，光度分析方法超过70种，此外，一些部颁标准或行业标准涉及大量光度法,这些标准的确定极大地推动了光度分析在实际工作中的广泛应用[3]。
1.2 基本原理
分光光度法依据的是物质对光的吸收特性[4], 1729年和1760年布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后阐明辐射强度和吸收层厚度的关系，1852年比耳（Beer）又提出辐射强度和吸收物浓度也有类似的关系，布格-朗伯-比耳定律的数学表示式为：
A = log（I0/It）= εbC
式中， A为吸光度， b为吸收层厚度(cm)，C为吸收物的摩尔浓度（M），ε为摩尔吸光系数(L · mol-1 · cm-1)。此定律应用于紫外－可见－红外光谱区吸收测量[5]，实际应用时，研究吸收与物质浓度的关系更为重要，因而习惯上简称比耳定律。
摩尔吸光系数(ε)在特定波长及溶剂情况下，是吸光分子（或离子）的一个特征常数。它是物质吸光能力的量度，可作定性分析的参数。
1.2.1 灵敏度的表示方法 灵敏度的表示方法一般有三种： （1）摩尔吸光系数
有色化合物的摩尔吸光系数ε（L· mol-1· cm-1），是衡量显色反应灵敏度最重要的指标。一般认为，ε﹥105的方法是超高灵敏度的方法，ε = （6 – 10）×104的方法是高灵敏方法，ε = （2 – 10）×104的方法是中等灵敏的方法，而 ε＜2×104则是不灵敏的方法[6]。 （2）比吸光系数 α
α值相当于浓度为1 mg/L的待测物质溶液，用1 cm长的吸收池测得的吸光度，以mL·g-1·cm-1表示，α与ε的关系为：
α = ε/原子量×1000
α值便于比较原子量（式量）不同的物质的显色反应灵敏度[7]。 （3）桑德尔（Sandell）指数 s
s值表示用1 cm吸收池测得吸光度为0.001时，每毫升溶液中待测物质的微克数，以 µg·cm-1表示，s与ε的关系式为：
S = F/ε
式中F表示待测物质的式量。
1.2.2 提高分光光度法灵敏度的有效途径 （一） 合成新的高灵敏有机显色剂 （1） 增大有机显色剂分子的共轭体系
理论已经说明，增大有机显色剂分子的共轭体系，不仅使π电子流动性增大，π→π*跃迁的能量降低，最大吸收峰红移；电子跃迁的纪律也可能增大，使吸收强度增加；而且也增大了显色剂分子的有效截面积[8]，从而提高了显色剂的灵敏度。但是共轭体系也不能无限度扩大，因为分子的共轭体系过大，导致试剂本身的颜色很深，对比度降低，也可能导致分子中某些基团的空间为阻效应破坏分子的平面结构而降低显色反应的灵敏度。
（2）在有机显色剂分子中引入取代基[9]
在有机试剂分子中引入适当的取代基，由于取代基吸电子或给电子
性质而产生的电子效应（诱导效应和共轭效应），使分子的电子云密度发生变化，引起试剂分子的酸碱性质，成络能力的变化。从而提高显色剂的灵敏度
（3）高灵敏显色剂
最近几年发表了许多金属二元配合物的摩尔数达到105数量级的有机显色剂的报告，这些高灵敏有机试剂主要有三中类型： （1）不对称变色酸双偶氮类试剂； （2）吡啶及噻唑偶氮衍生物； （3）卟啉类试剂。
1.2.3 多元配合物灵敏显色体系
由三种或三种以上不同组分参与形成的配合物，称多元配合物，由多元配合物显色反应一般都有很高的灵敏度，一方面由于三元或四元配合物分子比相应的二元配合物有更大的分子截面积；另一方面可能由于第二或第三配位体的引入，引起配位体与配位体之间，配位体与中心金属离子间的协同作用，使有色分子的电子云密度发生更大的变化，共轭ε电子的流动性和电子跃迁几率增大。周期表中绝大多数元素均可形成多元配合物，从目前情况看，摩尔吸光系数达105以上，较有价值的多元配合物显色体系有5种：
（1）金属－三羟基荧光酮－表面活性剂三元配合物显色体系； （2）金属－变色酸双偶氮胂衍生物－阳离子表面活性剂显色体系； （3）混配胶束四元配合物显色体系；
（4）金属络阴离子与碱性染料阳离子形成的离子缔合显色反应； （5）三元混合配化合物显色体系。
1.2.4 改变反应条件以改变反应产物的组成和产率
有色化合物的组成和结构与反应条件有关，如溶液的pH值、介质性质（溶剂性质）及试剂过量程度等。在显色反应中，有机溶剂的作用主要是与金属离子、显色剂分子、表面活性剂、配合物等发生溶剂化效应或形成氢键，从而抑制金属离子的水解聚合，提高了金属离子的反应活
性，有利于使反应向生成配合物方向移动，增加有色配合物的产率，从而提高显色反应的灵敏度。
1.2.5 放大反应的应用
所谓放大反应（或倍增反应）是指通过适当的途径使待测组分转变为更有利于测量的等当量物质，是一种间接分光光度法，Belcher等对这类反应的分析应用作过评述，如测定碘化物时，可将I-氧化成碘酸盐，再在酸性溶液中使碘酸盐与KI反应生成I2。然后使碘与淀粉反应成深色化合物，在590 nm处测定，摩尔吸光系数为1.08×105 L·mol-1·cm-1。或者在氧化成I2后，于0.15 ～ 0.05 mol/L H2SO4中用苯萃取I2 —I—孔雀绿缔合物，摩尔吸光系数为2.74×105 L·mol-1·cm-1。此类方法可在很多领域中应用[10]。
1.2.6 有机试剂和显色反应的选择性
有机试剂的选择性是指在给定条件下，能与某种有机试剂反应的金属离子种类的多少；某种试剂在一定条件下只能与有限种金属离子起反应，或者在和某种金属离子反应时，可允许共存的其它离子的种类愈多，相对浓度愈大，则称该试剂为高选择性试剂，反之，则是选择性不好的试剂。试剂的选择性或专属性，取决于试剂本身的结构、性质和反应条件。
（一） 有机试剂分子的整体结构对反应选择性的影响
有机试剂研究和在分析上的应用经历了较长的发展过程，早在1928年，Feigl 提出了特效基团的概念，认为决定有机试剂与金属离子放映特性的是试剂分子中直接与金属离子作用的原子或原子团，即成盐或配位基团，后来 Kyheuob 和Kjibepr作了大量补充，总结了20多种元素的分析功能团。方法日益完善。
（二） 配位原子性质及其空间配置对试剂选择性的影响[11] 在鳌合显色反应中，鳌合剂分子中的配位原子通常是指O，S，N，P，As，Se，卤素等，其中最常见的配位原子是O，N，S。配位原子通常以酸性基团（成盐基团）如-COOH，-OH，-AsO3H2，-PO3H2，=SH
等或者配位基团如-N=N-，=N-，=O，=S，-NH-的形式连接在分子的碳骨架上，一个有机试剂分子可以含有一个或者多个同种或不同种的配位原子，各配位原子间应有一个适当的空间位置，以满足与金属离子配位具有反应趋势，可由路易斯酸碱理论予以说明。
在显色过程中，有机试剂分子中的配位原子与金属离子间形成化学键，配位原子把它的一个未共有电子队供给中心金属离子，因此，有机配位体就相当于路易斯碱，而中心金属离子则相当于一个路易斯酸，有机试剂分子中的其余部分可能影响配位原子向金属离子提供电子对的能力，而配位原子又反过来影响分子中的其它部分的性质。根据软硬酸碱的概念，具有体积小、正电荷多、不易极化、不易失去电子而又容易形成离子键物质，称为“硬酸”。体积小、正电荷少、易极化、易失去电子而又容易形成共价键的物质则称为“软酸”。各类酸碱相互作用大致遵循“软亲软”和“硬亲硬”的原则 （三） 取代基对试剂选择性的影响 （1） 取代基的空间位阻效应
当配位体积较大，又必须有多个配位体与金属离子配位才能满足其配位数的要求时，配位体在中心离子周围的排布就会受到阻碍；如配位体含有取代基，受阻的情况就会更严重，此时，空间配位阻效应与取代基的体积及分子中所处的位置有关，取代基体积愈大，并处于取代基临位时，位阻效应越大。
（2） 取代基增强试剂的酸性 取代基增强试剂的酸性
试剂分子中引入吸电子基，将使分子中的电子云向吸电子基方向移动，导致试剂分子中酸性基团离解度增加，提高了试剂的酸性，螯合显色反应就可以在较强的酸性介质中进行，从而提高了反应的选择性[12]。
1.2.7 反应条件对显色反应选择性的影响 （1） 反应酸度
大多数显色剂是一中螯合剂，在螯合显色反应中，酸度是形成螯合物的最重要条件，酸度的影响表现为显色剂的酸效应和金属离子水解效
应和成络能力随溶液酸度改变，可能导致某种配合物不能形成和产率很底。同一种显色剂可在不同的酸度下与不同的金属离子反应。
（2） 掩蔽剂
在分光光度分析中，加入适当的掩蔽剂，利用金属离子与显色剂、掩蔽剂生成配合物稳定性差异以提高显色反应的选择性，是行之有效的方法。在选择掩蔽剂时，应依据软硬酸碱规则，并尽可能采用配位体竞争反应。
1.3 分光光度分析新方法
新方法的的研究也是光度分析的一个重要内容[13]，近年来出现了许多新方法并得到迅速的应用[14], 如浮选技术、多波长及多元回归、流动注射光度法、固相光度法、褪色光度法等。下面将对动力学光度法、流动注射光度法、固相光度法和计算光度法加以介绍。
1.3.1 动力学光度法
动力学光度法是基于显色反应的动力学特性而建立起来的光度分析新方法，包括速差动力学光度法、胶束介质动力学光度法、催化动力学光度法等。近20多年来发表了不少动力学分析法的研究报告和综述，并出版了专著，在很多的分析化学著作中都列有专章。与热力学方法相比，动力学具有下述优点[14]：
（1）反应选择性较好，适于混合物中性质十分相似组分的同时测定,如有机化合物中的异构体和同系物等。
（2）催化动力学分析法灵敏度高。
（3）扩大了可利用的化学反应范围，很多反应由于达到平衡很慢，或者平衡常数太小，或者有副反应，而不能采用热力学分析法，但可采用动力学分析法，因为后者并不要求反应完全，只需测定反应起始阶段的数据即可。
（4）由于动力学分析法是以时间为变量的，便于计算机与分析仪器的联机使用，容易实现流程控制、样品检测、数据采集和处理的自动化。
催化动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度法中占有重要地位。近年来，利用催化光度法测定研究呈上升趋势，其涉及的元素有汞、锡、银、铁、铜、锌、钙、锇、铝等, 涉及的阴离子有SCN－、BrO3－、NO2－、NO3－。
1.3.2 固相光度法
尽管现在已有很多的化学方法和仪器设备可以应用在痕量分析中，但光度分析法因其仪器设备简单和高灵敏度、高选择性显色试剂的不断出现而受到广大分析工作者的青睐。固相光度法集分离、富集、测试于一体，不仅简化了实验过程，而且灵敏度和选择性比相应的溶液光度法有显著的提高。固相光度法目前普遍采用的是透射法测量[15-17]，这就要求固相有一定的透光性，对于不透光的固相介质，透射法测量就无能为力了。以树脂相光度法为例，为了让入射光较好地透过树脂相，比色皿不能太厚, 目前大多采用0.5 cm比色皿, 树脂用量增多会导致灵敏度降低, 因此也有人使用制作复杂的1 mm比色皿[18, 19]，薄的比色皿给装样带来了很大的不便，同时，树指相中的水分不容易去掉，需要在比色皿底部打一微孔，以便水分漏出。总之，运用透射法测量，操作过程不易掌握，并且导致重现性差，一般需运用双波长等吸收点法来扣除背景误差, 有人[20]对固相测量方式进行了改进，提出用反射法测量，并对固相反射光度法进行了理论的探讨，得出结论：在局部浓度范围内，反射吸值AR与待测物浓度C有线性关系，为固相反射光度法进行定量分析奠定了基础，并成功地测定了矿样中的铁。宋雅茹等[21]运用固相反射光度法测定了水中痕量磷，并对透射法和反射法进行了比较，认为两者具有相同的灵敏度，不同的是：透射法比较费时，但对仪器要求不高；而反射法比较省时，却需要具有积分球装置的紫外分光光度仪。为了克服反射法所需仪器复杂的局限性，赵中一等[22]设计了一种简单的反射散射附件与国产的722型、721型分光光度计联用，以中速定量滤纸为载体，富集溶液中Ag(Ⅰ)—对二甲胺基苄叉若丹宁络合物，用固相反射光度法测定了地质试样中银的含量，结果满意。反射法的引入突破了透射法要求固相吸附剂透光的限制，扩大了固相吸附剂的选择范围，从而也拓宽了固相光度法的应用范围。
固相光度法作为一种新痕量分析手段正在兴起，不断研究出新的固相载体，与其他技术联用更是增强了它的活力，拓宽了它的应用范围。虽然还有很多的理论问题有待研究，许多实际应用领域有待开发，但在痕量分析中其发展前景是广阔的。在分析化学中，固相光度法将会被更多的分析工作者熟悉、研究和应用。
1.3.3 导数光度法
20世纪50年代初，导数技术开始引入紫外-可见和红外分光光度分析中，为分光光度法的发展开辟了一条新的途径。此后，人们开展了对导数分光光度法的理论、实验技术和测量装置的研究。20世纪70年代以来，随着低噪音运算放大器的出现和微型计算机在分光光度仪中的应用，简化了获得导数光谱方法，有力地推动了导数光谱的理论和应用研究的发展。在分光光度分析中引入导数技术，扩展了分光光度法的应用范围，在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰和加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，导数分光光度法在一定程序上解决了普通分光光度法难于解决的问题。
1.3.4 流动注射光度法
20世纪70年代中期由丹麦科学家J. Ruzicka教授和E. H.Hansen博
士，美国的A.Stewart分别在连续流动分析和高效液相色谱的基础上提出的流动注射分析（Flow injection analysis，简称FIA），近年来得到迅速发展，成为一门新型的微量溶液高速自动化分析技术。FIA技术还能够与多种检测技术联用，如分光光度法、原子吸收法、荧光光度法、化学发光法和色谱法等，其中分光光度法的应用最多，这种结合给检测技术增添了新的活力。流动注射光度法是FIA技术与分光光度法检测技术结合而发展起来的一种新方法，在这种方法中，FIA技术主要作为样品前处理及各种化学操作手段，用分光光度法作为检测手段，检测部分由分光光度仪和流通池组成[23]。它具有试剂消耗量小和容易实现分析过程自动化等优点，在现代分析中占有很重要的地位。目前，流动注射光度分析对象已从测定无机离子扩大到有机及生化分析领域。
第二章 分光光度法测定与其他方法联用
2.1 显微分光光度法
显微分光光度法是以光学显微放大技术和光度测量相结合对样品微区中的物质进行定量分析的一种方法，其测量装置是显微分光光度计。该方法广泛用于生物学和医学领域[12]。
（1） 测量方法
经聚焦的（直径为0.5至几十微米）探针型单色光束照射待测物上时，物质进行选择性吸收。在生物医学领域中，由于样品的结构和形状比较复杂，切不均匀，容易引起测量光束漫反射、折射和衍射，使测量结果误差比较大，为了减小这种误差，在显微分光光度中，对单个细胞中化学物质的相对含量或绝地含量的的量一般采用以下三种方法。 （i）一波长双区域法 （ii）双波长法 （iii）扫描法 （2） 显微分光光度计
显微分光光度计由光源、分光系统、显微系统、图象聚焦系统、机械扫描系统和镜扫描系统以及电子控制系统等六部分组成。 （i）光源
显微分光光度计中的光源通常采用高功率卤钨灯（100W）或氙灯（150W），前者使用于可见光谱区，后者使用于紫外-可见光谱区（180-1000nm），光源必须备有高稳定度的电源稳压装置。 （ii）分光系统
平面光栅作色散元件的单光束光学系统 （iii）显微系统
由分光器射出的单色光经扬光阑和聚光物镜，通过改变扬光阑可控制照明场大小，待测样品的区域和大小则由测量光阑控制。观察系统则由物镜和目镜控制。物镜对物品第一次进行放大，再经由目镜第二次放
大后进行观察，或由摄影器用胶片记录。经由物镜放大的象同时由分光配器反射到投影镜，将放大后的象投影到光电倍增管的阴极上，进行光电转换和接收。投影镜的倍率可根据待测物的大小调节。图象旋转系统设置在投影镜和测量光阑之间，由同步电机带动使图象作180。转动，只是在染色体的图象旋转与测量光阑重合时，才可进行正常分析
（iv）图象聚焦系统
通常有两种聚焦系统，一种是用步进马达使齿轮与显微系统的细聚焦旋扭连接，通过观察物体在近焦区域时显示较黑暗的模糊区域，再由计算机检查，当地到两个面积最大值之间存在一个最小值为最佳聚焦。另一种是Focovit自动聚焦系统，采用震动棱镜光栅，将显微镜视场下的放大图象投射在两个光度检测器上，获得两个相位的电信号以使电机驱动聚焦旋扭，得到最小的相位差，从而获得最佳焦距；这两种聚焦，每聚焦一次需0.1 s，聚焦精度为0.1 um。
（v）机械扫描和镜扫描系统
机械扫描是指对样品作直接光点扫描，在X，Y两个方向上均用步进马达驱动，可改变扫描速度和扫描步距；镜扫描是指样品经光学透镜放大后作影象扫描，由反射镜，作两个垂直方向的旋转运动，使放大图象相对测量光阑，作相对扫描运动，从而获得样品的吸收信息；带有TV扫描的显微分光光度计可以获得物质的空间分布、微观精细结构，并可以进行细胞图象识别和分类[24]。
（vi）电子控制系统
仪器的光学和电学部件，均可用计算机控制，操作者通过键盘的控制整个显微分光光度计进行工作。
目前应用比较广泛的显微分光光度计有德国的Life MPV-2型、Opton SMP-5型和我国的XFG-01型。
（3） 显微分光光度法的应用
显微分光光度法是显微测定分析的有效手段。该方法可用于测定单个细胞或者细胞微区中微量化学物质的相对含量和绝对含量，如细胞中的DNA、RNA、蛋白质、氨基酸、血红素、酶、多糖类、脂类、天然色素的测定，它是细胞学、组织化学、药物学、细胞病理学和免疫科学的
研究的有效手段。
2.2 反射光谱法 （1） 基本原理
物质受光照射时，通常会发生两种不同的反射现象，即镜面反射和漫反射。镜面反射如同镜子反射一样，光线不被物质吸收，反射角等于入射角，慢反射则必须满足库贝尔卡-芒克方程式：
（1 – R∞）2/2R∞ = K/S
式中K为吸收系数，与吸收光谱中的吸收吸收意义相同，S为散射系数，R∞ 表示无限厚样品的反射系数R的极限值。实际上，反射系数（R∞≈1）标准物质比较来测定，测定R∞（样品）/ R∞（标准物）比值，将此比值对波长作图，构成一定波长范围内该物质的反射光谱。
（2） 测量装置
目前，大多数手动或自动记录式分光光度计都具备有反射附件，测量的波长范围由分光光度计的工作光谱区决定，可以是紫外区、可见区或是近红外区。反射测量一般都采用与标准物比较的相对测量法。因此，附件必须提供同时或连续照明标准物和样品的光学系统，通常的标准物有MgO，MgCO3等，这些物质都具有很高的反射系数。
在通常情况下，镜反射和漫反射一般同时发生，因而测量系统中必须设置消除镜反射的装置，常用黑体吸收法或选择垂直于样品表面的入射光束照射样品，而只检测轴外的漫反射，或者相反，以一定的入射角照射样品，而检测垂直于样品表面的反射组分。
（3） 反射光谱法的应用
反射测量法只要用于食品（面包、不透明果汁）、涂料（油漆等）和建筑材料的分析，有些情况下也可以作定性和定量的测量，该方法最适合于作固体、不溶性材料或溶液中不稳定的材料的分析，在纸色谱或薄层色谱中，应用反射测量法更为简便，可以省去将待测组分从基质中分离步骤。
可见光谱区的反射测量法，待测组分必须是有色的，或者将待测组分经适当的化学反应生成有色化合物再进行测定。例如，一些燃料，曙
红、苯安蓝、碱性品红、孔雀绿、罗丹明B等的混合物，在氧化铝或硅胶为基质的薄板上，以正丁醇/乙醇/水（80：20：10）作展开试剂进行分离，于110℃烘干后，即可对薄板直接进行反射光谱分析；各种氨基酸，DL-丙铵酸、L-精氨酸、L-谷氨酸等。
紫外光谱区的反射测量法可用于维生素分析，如硫胺素盐酸盐、烟酸、对氨基苯甲酸等可用冰醋酸/丙酮/甲醇/苯（5：5：20：70）作展开剂进行硅胶薄板层分离，喷上2%的发光色素，在紫外光照射下显示荧光斑点，在Beckman DK-2型分光广度计进行分析。
近红外光谱区的反射光谱广泛应用于谷物、小麦、大麦的检测，也可用于多组分的同时测定。例如，一组反射测量可同时测定牛奶样品中的蛋白质、脂肪、总固体及乳糖的含量。它是生产控制分析的有效手段。
2.3 吸收光谱电化学方法
吸收光谱法与电化学结合而建立的吸收光谱电化学方法也是一种溶液分光光度法；这种方法对于阐明电极反应机理、鉴别中间产物和吸收物质的性质以及测量电化学参数（如扩散系数、速度常数、电子转移数和标准电极电位等）的有效手段。其基本原理是：当光束在靠近电极表面通过时，测量电解一定时间后溶液的吸光度，用标准曲线法求得待测组分的浓度。影响吸光度的主要因素有：
（1）吸光度与待测物质的浓度和光束通过电极表面的光程b成正比，这与常规分光光度法相同
（2）吸光度与电解时间的平方根成正比。
（3）吸光度与待测组分的还原态和氧化态的摩尔吸光系数之差成正比，在通常情况下，待测组分的氧化态和还原态的吸收光谱不同，其最大吸收位置也不同，对金属而言，在电极反应过程中，一般只是在靠近工作电极的溶液处于碱性状态时，才可以观察到吸收光谱，其实质是由于吸收池的阴极附近，电极表面氧化物还原产生OH-，随后扩散到整个溶液，与金属离子形成氢氧化物，从而对一定波长的光产生吸收。在某种意义上说，电极过程产生的OH-起着“显色剂”的作用。
（4）吸光度与通过电极表面的光束高度h成反比。
（5）吸光度随电极电位的变化而变化，当阴极电极电位达到或超过2.2V时，电极表面释放出氢气，导致测量结果不稳定。
光导纤维传感器的特点：
（1）由于光纤维传感器基于探测和传输的光学信号，它具有抗电磁、微波干扰的能力；它可置于高温、高压、强磁场、易燃、和强放射性的环境中，通过光导纤维实现远距离遥测，目前已研究出长度为1280m的遥控光纤荧光测量装置。
（2）光纤本身绝缘，且光纤及其探头可以做到很小而柔软，可直接插入活体组织内，并能作长时间的连续测量，为临床检验提供一种新的手段。
（3）应用多波长及时间分辨技术，能制造出同时相对两种或两种以上组分响应的光纤传感器的固定试剂相，这种固定试剂相可固定在适当的基底上而不与光纤端直接接触，便于根据测定对象进行更换。
（4）作为分光光度分析的显色剂、荧光剂、化学发光试剂等，都可作为光纤传感器的固相试剂相，这种固定试剂相可固定在适当的基底上而不与光纤端直接接触，便于根据测定对象进行更换。
（5）在一般情况下，光纤探头不致引起试样性质的变化，因而它是非破坏性分析。
2.4 分光光度测定与色谱分离联用
近年来，色谱法特别是高效液相色谱法和离子色谱法获得迅速发展，成为一种重要的分离分析技术，广泛应用于各个领域。
色谱法中，根据流动相的状态不同，可分为气相色谱法和液相色谱法，前者以气体作流动相，后者以液相作流动相。液相色谱中，根据其固定相装在柱管内，纸色谱是以滤纸作固相，而薄层色谱则是将粉末固相压成薄膜或涂在玻璃上，狭义地讲液相色谱法是指柱色谱法。根据固定相作用机理上的不同，柱色谱法又分为分配吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法。
（1） 紫外吸收检测器与色谱分离联用
固定波长的紫外吸收检测器是高效液相色谱仪中应用最早的一种形
式、价格便宜、应用非常广泛；它用低压汞灯获得254 nm单一波长光源或锌灯（214 nm）、镉灯（229 nm）作光源。
固定波长的紫外吸收检测器主要用于分析对紫外光有吸收的物质，对强吸收物质，可检测至1ng，也可用于非吸收物质的检测。一般用两种方法：一种是在洗提液中加入一种对紫外光有吸收的化合物，使之与待测组分形成离子对化合物，此法不仅可以检 测有机离子，也可检测无机离子；另一种方法是，在洗提液中加入少量紫外吸收化合物，分离过程中无紫外吸收的离子取代了紫外吸收的离子而产生一种负峰影响。这种方法可检测各种有机和无机阴离子和阳离子。
（2） 分光光度计式检测器与高效液相色谱联用
分光光度计式的检测器是一种可变波长检测器，通常在自动记录式紫外-可见分光光度计中装备一流通池后即可，这种检测器的优点是可以选择待测物的最大吸收波长处进行检测，以提高检测器的选择性，但其灵敏度一般比固定波长检测器要底，因后者的成本底噪声小。
用分光光度计作检测器的高效液相色谱法可看作是带有前处理装置的通用型分光光度计，应用这种仪器进行分离测定的方法称为高效液相色谱分光光度法。金属螯合物的高效液相色谱分光光度法和常规分光光度法相比，在灵敏度、选择性、操作技术等方面都有很大的改善。常规分光光度法的主要缺点实在爱同一条件下有多种金属形成配合物，而吸收光谱相互重叠，为了测定某一组分，必须寻找适当的掩蔽或者分离方法；将分光光度计与液相色谱联用，色谱柱对各组分作预分离，然后在同一波长或不同波长处进行检测，并用吸光度标尺放大，即使摩尔吸光系数达到中等水平的显色反应，也能使测定达到ng/L级灵敏度；将分离测定合为一体，避免了一系列烦琐的处理，更易实现操作自动化。
（3） 双波长分光光度检测与高效液相色谱联用
根据双波长分光光度法的原理，以两个不同波长的单色光分时地交替通过同一样品吸收池，获得两波长处的吸光度差，经放大后进行测量；该法可以减小光源波动、溶质和溶剂分子的光散射以及流动相的波动引起的误差。此外，有些在某一波长处没有吸收而在另一波长处仍可能有吸收的组分也可被检测，但在单波长检测器中就会漏掉。
第三章 钙
3.1.1钙的物理性质
钙元素符号Ca，银白色金属，原子序数20，原子量40.08，钙是碱土金属中活泼金属之一。纯金属的新切开面色白而软，呈光亮的结晶。它硬度与铅相当，钙具有延展性，它既可以进行一般机械加工，也可用模压以及锤锻制成板材。 钙的熔点839±2℃，沸点1484℃[25]。
3.1.2钙的化学性质
钙是非常活泼的金属，在常温下能与空气中的氧和氮缓慢作用形成一层氧化物和氮化物。钙在空气中受强热即燃烧而成砖红色火焰，生成氧化钙和氮化钙。钙与冷水作用缓慢，与热水迅速反应置换出氢气，钙易与卤素、硫、氮化合，而在加热时，几乎能将所有的金属氧化还原，钙几乎与各种酸碱均起反应。由于钙的活泼属性，因此，钙的各种产品必须保存在充满惰性气体的密闭容器中[26]。
3.2 钙的应用
钙广泛用于冶金、化工、医药、电器、能源等工业中。 在钢铁冶炼中，钙及其合金作为添加剂加入钢包中，可大大提高钢的质量。钢水包中加入钙，可有效地脱除钢中的氧、磷、硫等杂质，改善钢的微观结构。现在生产优质钢材普遍采用这种措施。在有色冶炼中，钙是极好的还原剂，用钙可还原出很多难熔即高熔点金属以及稀土金属，如Sm、Nd等。在化学工业中，钙用作聚氯乙烯的稳定剂，有机化学反应中的还原剂、有机溶剂的脱水剂等。在医药工业中，钙用来生产维生素。在能源工业中，钙用来制作钙电池，制作铅钙合金用于铅酸免维护蓄电池，用来还原铀的氟化物生产金属铀[27]。
3.3.1 钙在人体内的基本作用：
钙是人体内的一种微量元素，它在体内的含量虽然微乎其微，但是它的作用是巨大的。 直接的作用是钙能维持调节机体内许多生理生化过程，调节递质释放，增加内分泌腺的分泌，维持细胞膜的完整性和通透性，促进细胞的再生，增加机体抵抗力。间接的作用就比较具体繁多，例如钙可以使骨骼粗壮，使肌肉发达，使人精神饱满，维持体内酸碱适中、水和电解质平衡等。钙还可以消除炎症、净化血液、强力解毒、健美皮肤并能抑制有害病菌的入侵等。钙使人体保持上述状况，实际上是人体抵抗力强的一种综合表现。举例来说，钙能预防治疗感冒的原因有三方面：⑴钙能降低毛细血管的通透性；⑵钙能抑制病菌的生存；⑶钙能增强人体对环境冷暖变化的适应能力。具体来说，钙有以下功能： (1) 维持血管的正常通透性
体液中钙含量降低，毛细血管通透性增强，血液中的成分可以渗出血管外，这就是某些过敏性疾病的发病机制。注射钙制剂，可以降低毛细血管通透性，过敏性疾病即可缓解。 (2) 抑制神经肌肉的兴奋性
钙离子有降低神经骨骼肌兴奋性的作用。血钙浓度低到每100毫升血7毫克以下时，神经骨骼肌兴奋性增强，可以出现手足搐搦症或惊厥。这时静脉推注钙制剂，提高血钙浓度，惊厥即可停止。 (3) 参与肌肉的收缩
肌浆里的钙与骨骼肌收缩有直接关系，对维持心肌的正常收缩也起重要作用。如果钙浓度过高，可以减弱肌紧张，引起心跳减慢或心脏停跳。
(4) 参与血液凝固过程
抽血化验时，常在血液标本中加入枸橼酸钠或草酸钾等抗凝剂，枸橼酸和草酸可与血液中的钙离子结合，使钙离子减少，血液标本不凝固。 3.3.2 正常需要——人体每天钙的摄入推荐量
钙的含量与人的健康息息相关，为了避免钙缺乏疾病的发生，营养
学家确定了补钙的标准。现今，我国规定的供给量为：成年男女800毫克；儿童500～1000毫克；孕妇1000毫克；乳母1500毫克。而人体每日需钙量随年龄、性别、身体状况的不同而各异。因此，更年期妇女为防止绝经期后“骨丢失”，可以增加到1500毫克／日，50岁以上妇女还可以增至2500毫克／日。最近，美国营养专家确定，钙的日摄入量上限为2500毫克。根据我国的实际情况及人民的体质状况，国内营养学专家建议钙的日摄入量上限为2000毫克为宜。
3.3.3 钙的缺乏症及过量的中毒症
过量：钙是无毒的元素，但过量摄入将导致高的血清钙，从而导致消化系统、血清系统及泌尿系统的疾病。
缺乏：钙缺乏主要影响骨骼的发育和结构。严重缺钙时，成长缓慢，食物消化量降低，基本代谢率变高，活性及敏感性降低，出现骨质多孔症或低钙佝偻症，不正常的姿态与步调，易于内出血，尿量大增和寿命较短。临床症状表现为婴幼儿的佝偻病和成年人的骨质软化症及骨质疏松症[28]。
3.4.1 生产钙的基本方法
目前工业上生产钙有两种方法：1、熔盐电解法；2、金属热还原法。熔盐电解法中，以CaCl2作为原料，用熔融铜作为液体阴极，石墨作阳极，电解生成的钙熔入液体铜中变成铜钙合金，电解的阴极产品为铜钙合金，阳极产品为氯气。取出铜钙合金经蒸馏。把钙与铜分离，钙冷凝为钙锭，剩余的铜返回电解槽再用。氯化钙的原料是石灰石，氯化钙经一系列过程净化处理后，制成粒状氯化钙。这一方法的优点是：制得的钙纯度较高，可用于原子能工业作为还原剂。其缺点是：工艺流程长，操作复杂，产品成本较高，而最大的缺点是生产过程产生氯气，影响职工身体健康，危害周围环境。因此，多数国家均不采用电解法，已采用的也逐步用还原法取代。金属热还原法，也是用石灰（CaO）作原料，用硅铝等作还原剂，石灰与还原剂经混合压块后，装入还原罐中抽真空
和加热，直接还原成金属钙。该方法的优点是工艺流程短，操作简单，而最大的优点是，不产生有毒、有害气体，基本不污染环境，连炉渣也用于制造水泥，不足之处是产品的纯度，在很大程度上取决于原料石灰石和石炭的质量。因此，只要找到较好石灰石，则还原法的优点更突出
[29]
。
3.4.2前景描述
采用还原法是制钙工业的主流。但从上一世纪六十年代以来，由于原子能工业的需要，我国一直沿用电解法生产钙，国内没有用过还原法大规模生产钙。上一世纪九十年代以来，由于国际市场变化，以及种种原因，国内炼镁厂纷纷倒闭，有的工厂利用原有的炼镁设备，稍经技术改造，用还原法试验生产金属钙。经近两年的技术资料准备，工艺探索，最后在大生产设备上进行了两次试生产，终于获得成功，所得结果，已与国际公认的水平持平，甚至有可能超过，经过试生产数据核算，实际生产成本，也低于国内的电解法[30]。 3.5 分光光度法测定钙的进展 3.5.1普通光度法
普通分光光度法是广泛用于微量组分测定的一种方法，显色剂测定钙属经典方法，近年来，对该方法有改进性研究并广泛应用于水，化学制品，生物样品，人体组织等式样中钙的测定。王云周等[31]以偶氮胂Ⅲ为显色剂，在pH 7.0的六次甲基四胺-HCl介质中，以Ba（II）-偶氮胂-Zn（II）-Phen多元配合物形式测定Ba（660nm），用EGTA掩蔽Ca，在pH10Na2B4O7-NaOH介质中，以硫酸胺消除Ba对Ca的干扰，Ba量在0～100µg/50ml,Ca量在0～50/ml范围内为线性。对于硅钡合金中钡和钙的测定，试样经过六次甲基四胺-溴水分离后，与Ba、Ca共存的离子可能有Mg2+,Sr2+,Cu2+,Zn2+,Co2+,Ni2+,其中Cu2+,Zn2+, Co2+, Ni2+用邻菲罗啉掩胡云良等[32]利用碱性条件下，在含有8-羟基奎啉-5-磺酸的反映体系中，偶氮胂Ⅰ与钙离子反应生成紫色络合物，钙含量在0～4.5mmol/L范围内
蔽，乙酰丙酮掩蔽Mg2+。方法曾与重量法，RSD<5%。
有良好的线性，回收率为98.3%～101.3%。cu2+、Fe3+、Zn2+各100µmol/L对测定影响，胆红素280µmol/L、甘油三脂4.8mmol/L、血红蛋白2.5g/L以下对测定无影响。翟庆洲等[33]介绍了利用分光光度法测定化学试剂中痕量钙的方法，准确称量少量试剂后用水溶解定容至25ml，移取1.00ml于25ml容量瓶中，加入pH 10.4NH3-NH4Cl的缓冲溶液2.0ml，在加入1g/L DBC-CPA显色剂溶液2.0ml，以水定容，20min后以试剂空白为参比于波长624nm处测定试液的吸光度，ε624nm = 3.82×104，钙含量在0～25µg/25ml范围内遵循比尔定律，考察了36种离子的干扰情况，用于化学试剂KCl、NaCl、NaNO3中痕量钙的测定，得到了满意结果。另外，黄庆斌[34]，雷心恒[35]，王巍[36]等人也利用经典分光光度法测定样品中的钙取得了良好的实验结果。
3.5.2动力学光度法
动力学光度法是基于显色反应的动力学特性而建立起来的光度分析新方法，包括速差动力学光度法、胶束介质动力学光度法、催化动力学光度法等。近20多年来发表了不少动力学分析法的研究报告和综述，并出版了专著，在很多的分析化学著作中都列有专章。催化动力学光度法因其特有的高灵敏度在光度法中占有重要地位。近年来，利用催化动力光度法测定钙含量的研究呈上升趋势。李建平[37]等人利用阻抑反应动力学光度法测定微量钙，具体方法是：在0.012mol/L硫酸介质中，KBrO3氧化偶氮氯磷Ⅲ褪色，Ca2+可阻抑该褪色反应的速度。λmax=550nm，Ca2+浓度在0～1.4mol/L范围内成线性，检出限为0.0042mg/L。测定1.0µg Ca2+/10ml,允许误差≤5%，加标回收率93.5%～106.3%，此方法可以直接用于测定水中微量钙。
3.5.3固相光度法
尽管现在已有很多的化学方法和仪器设备可以应用在痕量分析中，但光度分析法因其仪器设备简单和高灵敏度、高选择性显色试剂的不断出现而受到广大分析工作者的青睐。固相光度法集分离、富集、测试于一体，不仅简化了实验过程，而且灵敏度和选择性比相应的溶液光度法有
显著的提高。闫永胜，黄卫红等[38]利用薄层树脂相分光光度法测定痕量钙，取得满意实验结果，方法如下：利用Na+型732#阳离子交换树脂优先与Ca2+交换缔合，形成二元缔合体系，在酸性介质中离子交换树脂负载的Ca2+与乙酰基偶氮羧在树脂上配位显色，形成离子交换树脂- Ca2+_乙酰基偶氮羧三元缔合配位显色系统，该体系在720nm波长处有最大吸收，建立了薄层树脂相分光光度法测定痕量钙的新方法。选择0.1mol/L柠檬酸10ml为测定酸度，显色剂用量为2.0mlg/L对乙酰基偶氮羧溶液，吸收时间为5min吸附显色时间为30min，树脂用量为1.0g，孔径为0.074mm，钙吸附体积为20ml，显色体积为50ml，常温下晾干时间为20min。方法验处限为1.4µg/L，线性范围为0～9.0µg/ml，ε=9.1×105。测定2.0µg Ca2+，相对误差≤5％的情况下，考察了17中共存离子的情况。可以用于烧碱厂二次精制含盐水中Ca的测定，RSD(n=5)为2.8％～3.2％，回收率为95％～105％。
3.5.4导数光度法
20世纪50年代初，导数技术开始引入紫外-可见和红外分光光度分析中，为分光光度法的发展开辟了一条新的途径。此后，人们开展了对导数分光光度法的理论、实验技术和测量装置的研究。林振宇等人[39]提出了傅立叶变换滤波值导数分光光度法，并以酸性络蓝K作为显色剂，并把它当作一部分，并不是参比，对水中的 钙和镁进行了同时测定，测定体系的pH=10,对于钙和镁的比值导数点的波长分别为531.2nm和572.0nm。方法用于模拟水样和实际水样中钙的测定，加标回收率为92％～103％。张美荣等[40]利用一阶导数吸光光度法直接测定水和食品中的钙，实验表明，导数吸收光度法利用零交技术，可在不加掩蔽剂的情况下，有效的消除一种或多种干扰物的影响。被测组分钙和干扰组分镁与显色剂显色，干扰严重，但是两者的一阶导数光谱有 一个零交点（λ=665nm），在该点上，镁的导数值为零，钙的导数值较大，因此选择该点测定钙，可消除镁等离子干扰。移取定量水于容量瓶中，加pH9.5的Clark-Lubs缓冲液2.0ml,0.2g/L偶氮胂Ⅲ溶液2.0ml，用去离子水稀释到刻度，摇匀。在室温下稳定5min后，将仪器调制导数工作方式，选择
n=1，Δλ=7.2nm，波长扫描范围是580～700nm，吸光度范围为0～0.250，用1cm比色皿，试剂空白为参比，扫描。按665nm处的零-谷导数值作工作曲线，再根据工作曲线求出样品中的钙含量，线性范围是0～10µg/25ml，回收率为97％～104％。 3.5.5流动注射光度法
20世纪70年代中期由丹麦科学家J. Ruzicka教授和E. H.Hansen博士，
美国的A.Stewart教授分别在连续流动分析和高效液相色谱的基础上提出的流动注射分析（Flow injection analysis，简称FIA），近年来得到迅速发展，成为一门新型的微量溶液高速自动化分析技术。刘兆霖等[41]利用流动注射络合显色吸光光度测定血清中的钙，以0.80％氢氧化钾－0.02％钙血素溶液为显色剂，3％甘油溶液为载体的流动注射光度法测定血清钙的分析方法（λ=510nm），钙在0～20mg/dl有良好线性关系（r>0.999），RSD（n=6）为1.5％～5.6％，加标回收率在91.5％～108％。 3.5.6计算光度法
计算光度法测定多组分十分有效，所以近年来用于多组分研究报道较多。吴宇梅等人[42]用化学计量学-分光光度法同时测定成年男子精液中的钙、镁、锌，取得了良好的效果。具体方法如下：在pH 10.4的硼砂-NaOH体系中，应用主要成分回归法、偏最小二乘法和径向基人工神经网络法处理测量数据，建立数学模型，2-(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′偶氮)变色酸（8Q5SAC）光度法同时测定钙、镁、锌于(400～800nm波长范围内间隔2nm进行扫描)，RSD分别为3.4％，3.0％，3.2％。该方法用于-患不育症成年男子和-正常成年男子的精液中钙、镁、锌的同时测定。
第四章 DBM－偶氮胂分光光度法测定
生物样品钙的研究
4.1前言
钙对于维持人体生命和健康起到至关重要的作用。它维持人体循环、呼吸、神经、内分泌、消化、骨骼、泌尿、免疫等系统正常生理功能起着重要的调节作用。钙摄取量不足骨头里的钙就会溶解到血液里引起骨质疏松、易产生骨折的同时还会黏在血管内壁上，增加了血管的厚度和硬度，使血管内腔变窄变细，造成动脉硬化，以至发生心脑血管疾病和脑中风等后果。所以，人体的健康与钙有不可分割的关系。光度法由于仪器设备简单，目前该法测定钙仍是令人感兴趣的方法。DBM-偶氮胂的全名是二溴对甲偶氮胂[43]{2-[（2-胂酸基苯偶氮）-7-（2，6-二溴-4-甲基苯偶氮）-1，8-二羟基-3，6-萘二磺酸]}，它是一种新的不对称变色酸的偶氮衍生物，属酸性介质中检测稀土元素的高灵敏度试剂。本文研究了钙（Ⅱ）与该试剂显色反应，建立了测定钙的最佳实验条件。研究表明，在pH 10.4 NH3-NH4Cl缓冲介质中，Ca2+与DBM-偶氮胂形成蓝色络合物，该络合物的组成比为Ca（Ⅱ）：（DBM-ASA）＝1：2，最大吸收波长位于628 nm处，表观摩尔吸光系数ε628nm＝ 3.92×104L·mol-1·cm-1，钙量在2～10μg/10 mL范围内遵守比耳定律,可以用于大米、面粉及土豆等生物样品中钙的测定。 4.2 主要仪器与试剂
722型分光光度计（上海棱光技术有限公司）。
Ca2+标准溶液：6 μg·mL-1，准确称取0.2497 g碳酸钙（光谱纯）于烧杯中，加入30 mL蒸馏水，小心加入1 mL浓盐酸搅拌，使其溶解，转移至100 mL容量瓶中摇匀，得含钙1.000 mg·mL-1储备液Ⅰ。移取1.0 mL储备液Ⅰ于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得含钙10 μg·mL-1储备液Ⅱ。移取15 mL储备液Ⅱ于25 mL容量瓶中，用水稀
释至刻度，摇匀，得含钙6 μg·mL-1工作液。
DBM-偶氮胂（DBM-ASA，上海长科试剂研究所）：1.0 g·L-1水溶液。
pH10.4 NH3-NH4Cl缓冲溶液：用0.1 mol/L的氨水与0.1 mol/L的氯化氨溶液以体积比为16：1进行混合即得pH 10.4的NH3-NH4Cl缓冲溶液。
实验所用试剂均为分析纯试剂（除特殊说明外）；水为蒸馏水。 4.3实验方法
准确移取6 μg Ca2+标准溶液置于10 mL容量瓶中，依次加入pH 10.4缓冲液1.0 mL，再加入1.0 g·L-1 DBM-ASA显色剂溶液1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀；放置20 min后，用1 cm比色皿相应试剂空白为参比于波长628 nm处测定吸光度。
4.4结果与讨论
4.4.1 吸收曲线
按实验方法绘制吸收光谱，结果表明（见图4-1），Ca2+与DBM-ASA所形成络合物的最大吸收波长位于628 nm，其第二峰值在602nm处，试剂空白最大吸收波长位于540 nm，实验选用628 nm作为测定波长。
图4-1. 吸收光谱 Fig 4-1. Absorption spectra
a. 试剂空白（对水）b．Ca(Ⅱ)-(DBM-ASA)络合物（对试剂空白）
4.4.2 实验条件优化
按实验方法考察了pH 8.0～12.0之间对吸光度的影响，结果表明（图4-2），在pH 10.0～11.0时吸光度较大且波动较小，实验选取pH 10.4。缓冲溶液用量考查了0.5、1.0、1.5 mL三个体积对吸光度的影响，实验结果表明（图4-3），当缓冲溶液选用1.0 mL时，吸光度最大, 以1 mL缓冲溶液控制体系酸度。
0.4)ec0.3nabro0.2sbA(0.1度光吸0-0.18910111213
pH
图4-2 酸度影响
Fig. 4-2 Effect of acidity
0.4 )ecnabrosb0.2 A(度光吸0 0 1.0 2.0 缓冲溶液用量（Vbuffer/mL） 图4-3. 缓冲溶液用量的影响
Fig 4-3. Effect of amount of buffer solution
显色剂用量在0～1.5 mL进行,实验结果表明（见图4-4），当
DBM-ASA用量在0.8～1.2 mL时吸光度最大且波动较小，实验选用1.0 mL。
0.5 吸光度(Absorbance) 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 DBM-ASA/mL 1.5 2
图4-4 显色剂用量的影响
Fig. 4-4 Effect of amount of chromogenic agent
加入各种试剂并混合，10 min后吸光度恒定，在2.5h内吸光度变化不超过5%，体系保持稳定。
4. 4. 3 方法选择性
有机试剂的选择性是指在给定条件下，能与某种有机试剂反应的金
属离子种类的多少；某种试剂在一定条件下只能与有限种金属离子起反应，或者在和某种金属离子反应时，可允许共存的其它离子的种类愈多，相对浓度愈大，则称该试剂为高选择性试剂，反之，则是选择性不好的试剂。如某种试剂在一定条件下只与一种元素反应，这种试剂叫专属试剂或特效试剂。试剂的选择性或专属性，取决于试剂本身的结构、性质和反应条件。研究合成高选择性有机显色剂或显色反应体系，比提高反应灵敏度的问题更为复杂和困难。目前，研究高选择性的有机试剂主要有两种方法，其一是用量子化学和计算技术，从分子的整体结构出发，计算分子中各原子的电子密度、能级、键级和吸收光谱特性(吸收峰位置
和强度)，确定试剂存在的形式及结构，通过对比，对拟合成的试剂与金属离子的反应趋势作出估计，从而为分子设计提供理论指导。这种方法目前对处理复杂结构的有机试剂及其金属配合物还有—定困难，离指导定向合成新有机试剂还有较大的距离。另一种方法是在总结已有头验资料的基础上对原有试剂进行结构改造，从而合成新的有机试剂。这两种方法都是必须的。
如果共存离子本身有颜色，如Fe3+、Ni2+、Cr3+、Cu2+等、或共存离子与显色剂生成有色络合物，会使吸光度增加，造成正干扰。如果共存离子与被测组分或显色剂生成无色络合物，则会降低被测组分或显色剂的浓度，从而影响显色剂与波测组分的反应，引起负干扰。
在最佳实验条件下，测得结果表明，当相对误差不超过± 5%时，29 种共存离子影响：NO2-(500)，NO3-(200)， NH4+(150)，葡萄糖(100)，柠檬酸(80)，Cl-(40)， Ag+、 P(Ⅴ) (20)， 抗坏血酸(10)，Br-、酒石酸、尿素、C2O42-、Pb2+(4)，Fe3+ 、Zn2+ (2)，Ba2+ 、Fe2+、Mg2+ 、Co2+、 Mn2+(1)， Cu2+、 Ni2+、 Eu3+ (0.5)，Bi3+ 、Y3+(0.4)，La3+、Cr3+(0.2)， Al3+(0.1)，加入形态及允许误差见表4-1。
表4-1 共存物质的影响 Table 4-1 Effect of coexisting substance
加入离子 Ion added NO2- NO3- NH4+ 葡萄糖 柠檬酸 Cl- Ag+ P(Ⅴ) 抗坏血酸 Br- 酒石酸 尿素
加入形态 Speciation added NaNO2 KNO3 ( NH4 )2 SO4
允许量(μɡ) Permissible amount
500 200 150 100 80 40 20 20 10 5 4 4
相对误差（%） Relative error
+2.4 +3.6 +4.4 +3.3 +4.7 -2.8 +3.6 +3.6 -4.3 -4.2 +4.4 -3.0
C6H12O6
C6H8O7·2H2O NaCl AgNO3 NaH2PO4 C6H8O6 KBr
C4H6O6 CH4N2O
C2O42- Pb2+ Fe3+ Zn2+ Ba2+ Fe2+ Mg2+ Co2+ Mn2+ Cu2+ Ni2+ Eu3+ Bi3+ Y3+ La3+ Cr3+ Al3+ H2C2O4 ·2H2O Pb(CH3COO)2·2H2O FeCl3·6H2O Zn(CH3COO)2 ·2H2O BaCl2·2H2O FeSO4·7H2O MgSO4 ·6H2O CoSO4 ·7H2O MnSO4 ·2 H2O CuSO4 ·2 H2O NiSO4 ·4H2O EuCl3 Bi(NO3)3·5H2O YCl3 LaCl3 Cr(NO3)2·9H2O Al2(SO4)3· 6H2O 4 4 2 2 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 0.2 0.2 0.1 +3.9 +3.9 -4.4 +4.8 +4.7 -4.8 -4.8
+4.3
+3.8 +3.4 +2.3 +3.5 +4.3 +3.6 -4.2 +3.3 +2.5
消除共存离子干扰的一般方法如下：
(1) 控制溶液的酸度；(2) 加入掩蔽剂；(3)利用氧化还原反应, 改变干扰离子的价态；(14) 利用校正系数；(5) 利用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰；(6) 选择适当的波长；(7) 采用适当的分离方法
4.4.4络合物组成比
采用摩尔比法和等摩尔连续变化法测得络合物组成比为n（Ca2+）: n(DBM-ASA) = 1 : 2。
4.4.5工作曲线
按实验方法操作，于10 mL容量瓶中，加入含钙0、2、4、6、8、10、12 μg钙标准溶液按实验方法操作测定吸光度，钙在2～10 μg/10 mL范围内与吸光度呈线性关系(图4-5)。工作曲线回归方程： A = 0.0428 C + 0.148（C：μg Ca2+ /10 mL），相关系数γ = 0.9934，方法表观摩尔吸光系数ε628nm = 3.92×104 L·mol-1·cm-1
0.7吸光度（Absorbance)0.60.50.40.30.20.1005Ca2+(µg)1015
图4-5. 工作曲线 Fig 4-4. Calibration curve
4.4.6样品分析
大米、面粉样品：准确秤取大米、面粉样品2g于石英坩埚中，加入浓硝酸10 mL，蒸干，然后再加入浓硝酸2 mL，加热，逐滴加入浓过氧化氢至溶液澄清为止，蒸至近干。用蒸馏水定容至25mL，准确移取1.0 mL样品溶液, 按实验方法进行钙的测定。
土豆样品：将土豆洗干净切条后，在110℃的烘箱中恒温干燥4h。准确称取干燥后的样品2.0000g于瓷坩埚中，放入马弗炉中在650℃进行灰化8 h，待灰化完全，打开炉门降温后取出，冷却至室温，加数滴水使之温润，沿皿壁加体积比为（1+1）的浓盐酸4-5ml，溶解残留物，加热，蒸至近干，以水转至100ml容量瓶中，定容，移取1.0ml样品, 按实验方法溶液进行钙的测定。
以上分析见表4-2
表4-2样品分析结果
Table 4-2 Analytical results of samples
试样 Sample
测定结果 Found
(ρ/µg·g-1)
平均值 相对标准Average
(ρ/µg·g-1)
加入量Added (m/μg)
测得量 Found (m/μg)
回收率Recovery (%)
偏差 RSD (%)
(n=6)
大米 (rice) 面粉 (wheat flour) 土豆 (potato)
132.5,133.8 132.5,131.7 131.2,132.6
132.4
0.82
2.00
2.01
100.5
141.4,141.1 140.0,141.3 140.5,141.2
140.9
0.62
2.00
1.96
98.0
83.5, 83.0, 83.5, 81.0, 83.5, 81.5
82.6
1.03
2.00
1.97
98.5
在吸光光度分析中，除了各种化学条件所引起的误差之外，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件的偶然变动，读数不准确等。在吸光光度分析中，我们一定要考虑到这些偶然误差对测定的影响。
在光度计中，透光率的标尺刻度是均匀的。吸光度与透光率，为负对数关系，故它的标尺刻度是不均匀的。通常，对于同一台仪器，读数的波动对透光率来说，应基本上为一定值。可是，对吸光度来说，它的读数波动就不再为定值。
为了使测定结果有较高的灵敏度和准确度，必须注意选择最适宜的测量条件，一般说来，在选择测量条件时，应注意以下几点：
(1)入射光波长的选择，为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择波长等于被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。这称为“最大吸收原则”。选用这种波长的光进行分析，不仅灵敏度较高，而且测定时偏离朗伯－比耳定律的程度减小，其准确度也较好。但是，当有干扰物质存在时，有时不可能选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。这时，应根据“吸收最大、干扰最小”的原则来选择入射光波长。
(2)控制适当的吸光度范围，从仪器测量误差的讨论中已了解到，为了使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0．2～0.8范围内。为此，可以从下列两方面来考虑：1．控制溶液的浓度，如改变试样的称量和改变溶液的稀释度等；2．选择不同厚度的吸收池。
(3)选择适当的参比溶液，在测量吸光度时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于吸收池器壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。当试液及显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比溶液。如果显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可采用不加显色剂的被测试液作参比溶液。如果显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂一些共存组分的干扰。
结 论
介绍了分光光度法并综述了钙光度分析的进展。研究了钙与DBM－偶氮胂形成络合物的光度性质。在pH 10.4 缓冲溶液介质中，钙络合物最大吸收峰在628 nm。表观摩尔吸光系数ε628nm ＝ 3.92×104 L·mol-1·cm-1，钙量在2～10μg/10 mL范围内遵守比耳定律。考察了32常见共存物质的影响。本法成功地用于土豆、面粉及大米中钙的测定，6次测定相对标准偏差小于2%，加标回收率为98.0%～100.5%, 获得了令人满意的结果。
致 谢
本论文是在李景梅老师、翟庆洲教授的精心指导下完成的，从论文的选题、构思和研究结果的分析，以及具体的实验操作都得到了老师们的耐心教授。尤其在一些细小的学术问题上，得到了很大的收获。导师渊博的知识和严谨的治学态度，以及对我们生活上的关心，给我留下了非常深刻的印象。导师丰富的经验以及科学的思维方式将使我终生受益，为我今后的学习研究打下坚实基础。在此，谨向为我的学位论文完成付出辛勤劳动的导师表示最衷心的感谢！
同时感谢同组黄冲、孙赛林等同学的支持与帮助。
在此，也将本论文献给曾经帮助过我的老师、同学，并对他们为我做出的支持与帮助致以良好的谢意！
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附录
1．吸收曲线：400 410 420 0.703 0.034 0.726 0.027 0.824 0.013
430 0.915 440 1.071 450 1.151 460 1.27 470 1.383 480 1.562 490 1.567 500 1.652 510 1.701 520 1.745 530 1.765 1.802 550 1.703 560 1.59 570 1.567 580 1.31 590 1.033 600 0.824 610 0.656 620 0.563 622 0.541 624 0.516 626 0.489 628 0.467 630 0.426 632 0.411 634 0.394 636 0.371 638 0.365 640 0.35 650 0.283 660 0.229 670 0.189 680 0.15 690 0.121 700 0.104 710 0.078 720 0.062 730 0.051 740 0.041 750 0.036 760 0.028 770 0.026 780 0.022 0.015 -0.006 -0.016 -0.026 -0.037 -0.051 -0.044 -0.043 -0.027 -0.014 -0.015 -0.021 0.035 0.058 0.094 0.017 0.179 0.343 0.183 0.219 0.297 0.361 0.358 0.381 0.347 0.336 0.348 0.317 0.302 0.307 0.126 0.106 0.092 0.076 0.061 0.044 0.05 0.032 0.025 0.024 0.016 0.019 0.01 0.01
540 790 800
0.02 0.021 0.008 0.011
2.0吸光度（Absorbance)1.51.00.50.0400-0.5波长（Wavelength）λ/nm
500600700800
2．工作曲线：
2 4 6 8 10 12
0.70.60.239 0.329 0.409 0.495 0.572 0.522
吸光度（Absorbance)0.50.40.30.20.1005Ca2+(µg)1015
3．酸度对吸光度的影响
8 9 10 10.4 11 11.4 12 -0.019 0.041 0.102 0.381 0.318 0.085 0.106
0.4吸光度(Absorbance)0.30.20.10-0.18910pH111213
4．显色剂用量对吸光度的影响
0 0.2 0.5 0.8 1 1.2 1.5
0 0.012 0.055 0.232 0.381 0.187 0.112
0.5吸光度(Absorbance)0.40.30.20.1000.51DBM-ASA/mL
1.525．缓冲溶液用量对吸光度的影响
0.5 1 1.5
吸光度(Absorbance)0.40.304 0.333 0.324
0.2001DBM-ASA/mL2
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