三七总皂苷中各组分含量测定方法的改进

2006,21(2):187～1　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　WCJ・PS　

三七总皂苷中各组分含量测定方法的改进

冯　亮,蒋学华3,叶利民

(四川大学华西药学院,四川成都610041)

摘要:目的　用薄层扫描法(TLSC)和高效液相色谱法(HPLC)测定三七总皂苷中人参皂苷Rb1(Rb1)、人参皂苷Rg1(Rg1)和三

七皂苷R1(R1)3种主要成分的含量,并对两种方法进行比较,为修订质量标准中含量测定方法及含量限度提供依据。方法　

TLSC法用正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂,27%硫酸无水乙醇溶液为显色剂,测定波长λs=535nmλ,R=460nm;HPLC法用C18色谱柱,以乙腈-水线性梯度洗脱,0min(25∶75)～15min(45∶55);流速1.5ml・min-1;测定波长200nm。结

果　TLSC法测得三七总皂苷原料中Rb1、Rg1、R1的含量分别为31.07%、23.30%、9.35%;HPLC法测得三七总皂苷原料中Rb1、

Rg1、R1含量分别为30.46%、22.65%、5.83%。结论　HPLC法能将多种皂苷很好地分离并检测,简便快速,减少了误差。其准

确度和测定结果的稳定性均优于TLSC法。

关键词:薄层扫描法;高效液相色谱法;三七总皂苷;人参皂苷Rb1;人参皂苷Rg1;三七皂苷R1中图分类号:R927

文献标识码:A文章编号:1006-0103(2006)02-0187-03

ImprovementofdeterminationmethodofthemaincomponentsinPanaxnotoginsengsaponions

FENGLiang,JIANGXue-hua3,YELi-ming

(WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract:OBJECTIVE　TLSCandHPLCwereadoptedtodeterminethecontentsofginsenosideRb1,ginsenosideRg1andsanchinosideR1inPanaxnotoginsengsaponions.Andresultsofthetwomethodswerecompared,whichcouldprovidethebasisofrevisingthedeterminationmethodinqualitystandard.METHODS　TLSChasbeenestablishedwiththeupperlayerofthemixtureofbutanol-ethylacetate-H2O(4∶1∶5)asdevelopingsolvent,and27%sulphuricacidethanolsolutionascoloringreagent,λs=535nmλ,R=460nm.HPLCwasadoptedwithC18column,acetonitrile-H2O(25∶75at0minand45∶55at15min,lineargradientelution)wasusedasmobilephaseanddetectivewave2lengthwassetat200nm.Theflowratewas1.5ml・min-1.RESULTS　ThecontentofginsenosideRb1,ginsenosideRg1andsanchinosideR1inPanaxnotoginsengsaponionsdeterminedbyTLSCwas31.07%,23.30%and9.35%;andthatdeterminedbyHPLCwas30.46%,22.65%and5.83%,respectively.CONCLUSION　HPLCcouldseparateanddeterminevariouscomponentsinPanaxnotoginsengsaponionsanddeterminethem.ItsaccuracyandstabilityarebetterthanTLSC.

Keywords:TLSC;HPLC;Panaxnotoginsengsaponions;GinsenosideRb1;GinsenosideRg1;SanchinosideR1CLCnumber:R927

Documentcode:A

ArticleID:1006-0103(2006)02-0187-03

　　三七是五加科人参属植物Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根;含有皂苷、多糖、氨基酸等多种化学成分。其中三七总皂苷(Panaxnoto2

ginsengsaponions)为其主要的有效成分,具有活血化

三七总皂苷原料中Rb1、Rg1和R1的含量[4];同时建立了HPLC含量测定法,并与TLSC法进行比较,为重新修订质量标准中含量测定方法及含量限度提供依据。

淤的功效。三七总皂苷含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和三七皂苷R1、R2、R3、R4、R6等20余种皂苷成分,均属达玛烷型(Dammaranetype)四环三萜皂苷。其中人参皂苷Rb1(Rb1)、人参

1　实验部分

1.1　仪器与试药

LC-9A高效液相色谱仪,SPD-6AV紫外检测

器(日本岛津);CS-930薄层扫描仪;DikmaDiamon2m,美国Dikma公silC18色谱柱(200mm×4.6mm,5μ

司);硅胶G板(大连化物所)。Rb1、Rg1和R1对照

皂苷Rg1(Rg1)是三七总皂苷中含量最高的两个成分,而三七皂苷R1(R1)则是三七总皂苷的特征化合物[1]。对于三七总皂苷原料及其口服制剂,文献[2]规定采用比色法测定总皂苷含量。而比色法在操作过程中存在操作烦琐、影响因素多及重复性差等问题[3],尤其是不能分别测定三七总皂苷中各主要成

分的含量。为此,特建立了薄层扫描法(TLSC)测定

作者简介:冯亮(1980-),男,正攻读药剂学专业的博士学位。3通讯作者(Correspondentauthor),jxh1013@vip.163.com

品(中国药品生物制品检定所);三七总皂苷(云南特

安钠制备厂);乙腈(色谱纯,美国Dikma公司);水(超纯水);其余试剂均为分析纯。1.2　TLSC法1.2.1　含量测定　取三七总皂苷样品约50mg,精

　　　188

华西药学杂志第21卷

密称定后置25ml量瓶中,加甲醇溶解定容,摇匀。用干燥滤纸滤过,弃初滤液,精密量取续滤液2ml,置10ml量瓶中,加甲醇定容,摇匀,作为供试品溶液。另取经过60℃真空干燥3h的对照品Rb13mg、Rg13mg和R11mg,精密称定后置同一25ml量瓶

中,加甲醇溶解定容,摇匀,作为对照品溶液。吸取供试品溶液2μl、对照品溶液2、4μl,分别交叉点于同一薄层板上(使用前105℃活化约30min),以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)上层液为展开剂;27%硫酸无水乙醇溶液为显色剂;l05℃烘至斑点清晰,

λ取出放冷至室温。测定波长λs=535nm,R=460nm,SX=4,反射式锯齿扫描,灵敏度中。取峰面积,采用外标法分别计算样品中Rb1、Rg1和R1的含量。1.2.2　线性范围的考察　分别取3种对照品适量,精密称定后置1ml量瓶中,加甲醇溶解,定容;分别

l点于同一薄层板精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μ

上。按“1.2.1”项下方法展开,显色,测定峰面积。将峰面积对点样量进行线性回归。回归方程分别为:ARb1=2.097×103C+1.107×104(r=0.9914),点样量在2.30～36.80μg范围内,线性关系良好;ARg1=6.9×103C+1.970×104(r=0.9921),点样量在1.25～20.00μg范围内,线性关系良好;AR1=2.211×10C+1.130×10(r=0.99),点样量在1.75～28.00μg范围内,线性关系良好。

1.2.3　峰面积检测精密度　分别精密吸取3种对l,点于薄层板上,按“1.2.1”项下方法照品溶液2μ

展开,显色,测定峰面积。对同一待测斑点连续重复扫描测定5次。峰面积的RSD为1.04%～1.85%,表明峰面积检测精密度良好。1.2.4　板内精密度　精密吸取3种对照品溶液,在同一块薄层板上点5个点,每次点样2μl。按“1.2.1”项下方法展开,显色,测定峰面积。峰面积的RSD为6.34%～7.30%。RSD值大于5%,可见板内精密度低,故需多取几个样品点样测定,并取平均值。1.2.5　板间精密度　精密吸取3种对照品溶液,分别在5块薄层板上点样,每次点样2μl。按“1.2.1”项下方法展开,显色,测定峰面积。峰面积的RSD为9.%～14.85%。RSD大于5%,可见板间精密度低,故在测定时必须保持色谱条件的稳定并使用随行对照。1.2.6　方法精密度　精密称取三七总皂苷样品5份(每份约50mg),按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液。展开,显色,测定每份样品中Rb1、Rg1和R1的含量,其RSD为7.74%～10.65%。3种组份含量的RSD均大于5%(n=5)。表明方法精密度低。1.2.7　显色稳定性考察　分别精密吸取3种对照

3

4

品溶液2μl,点于薄层板上。按“1.2.1”项下方法展

开,显色,对待测斑点于显色后0、1、2、3h测定峰面积。其RSD为1.39%～4.20%。表明三七总皂苷的3个主成分显色后的斑点在3h内基本稳定。1.2.8　回收率试验　精密称取已测定含量的样品9份,分别加入相应的对照品适量。按“1.2.1”项下方法展开,显色,测定其含量并计算回收率。测定结果见表1。3种成分高、中、低3个浓度的回收率均在91%～105%之间。表1　TLSC法的回收率测定结果(μg,n=3)

Table1　ResultsofrecoverytestofTLSC(μg,n=3)ComponentsRb1

lowmiddlehigh

Rg1

lowmiddlehigh

R1

lowmiddlehigh

Original6.9006.9006.9003.7503.7503.7505.2505.2505.250

Added3.4504.6006.9001.2502.5003.7501.7503.5005.250

Recovered10.38411.43913.6145.0006.07.4366.8528.73710.759

Recovery(x±s)/%100.99±6.0798.67±5.2797.30±12.32100.00±10.4593.56±6.1798.29±6.3191.±7.6999.63±1.37104.93±5.91

1.3　HPLC法

1.3.1　含量测定　除溶解和稀释所用溶剂改为蒸馏

水外,其余操作均按照“1.2.1”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液。分别吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪分析。使用的色谱条件为:DikmadiamonsilC18分析柱(200mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水,采用线性梯度洗脱,0min(25∶75)～15min(45∶55);流速1.5ml・min-1;测定波长200nm。所有组分在15min内出峰(图1)。以外标法用峰面积计算样品中Rb1、Rg1和R1的含量。

图1　三七总皂苷(A)、三七皂苷R1(B)、人参皂苷Rg1(C)、人参皂苷

Rb1(D)和空白对照(E)的色谱图

Fig1　HPLCchromatogramsofPanaxnotoginsengsaponionssolution

(A),sanchinosideR1solution(B),ginsenosideRg1solution(C),ginsenosideRb1solution(D)andblanksolution(E)

1.3.2　线性关系　取3种对照品适量,精密称定后

置同一25ml量瓶中。用蒸馏水定容,然后依次作等倍稀释。分别吸取各稀释液20μl,注入液相色谱仪,测定不同浓度对照品的峰面积。以色谱峰面积对浓度(mg・ml-1)进行线性回归,得各组分的回归

第2期冯　亮,等。三七总皂苷中各组分含量测定方法的改进　　　1

方程:ARb1=2.932×106C+2.200×103(r=0.9999),线性范围1.1～280.0μg・ml-1;ARg1=3.5×10C+9.712×10(r=0.9999),线性范围1.2～304.0μg・ml-1;AR1=3.094×106C-1.693×103(r=0.9999),线性范围1.5～380.0μg・ml-1。1.3.3　精密度　取“1.3.1”项下对照品溶液,于测

6

3

各组分的含量,测定结果见表3。

表3　TLSC法与HPLC法的测定结果比较

Table3　ComparisonofresultsdeterminedbyTLSCandHPLCNo.12345

XRSDRb1/%TLSC29.3031.9630.4332.1531.4831.073.81%HPLC30.30.3330.4230.3330.5930.460.48%

TLSC24.0123.7624.5922.1421.9823.30

Rg1/%

HPLC22.8522.7922.3422.6922.5622.650.90%

TLSC8.969.6910.0.448.5.35R1/%

HPLC5.775.835.915.725.935.831.%

定条件下进样,重复5次。以3种组分峰面积,分别

计算其浓度,RSD为0.58%～0.91%。3种组分的RSD均小于1.0%(n=5),表明进样精密度高。1.3.4　方法精密度　分别精密称取三七总皂苷原料5份。按照“1.3.1”项下方法测定含量,其RSD为0.34%～1.04%。3种组分的RSD均小于1.5%(n=5)。表明方法精密度高。1.3.5　加样回收率试验　分别精密吸取3种对照品溶液各9份,分成高、中、低3组。再分别精密加

表2　HPLC法的回收率实验结果(μg,n=3)

Table2　ResultsofrecoverytestofHPLC(μg,n=3)IngredientsRb1

low

middlehighlowmiddlehighlowmiddlehighOriginal0.1400.1400.1400.1520.1520.1520.1280.1280.128Added0.0560.1120.1680.0410.0820.1230.0110.0220.033Recovered0.1960.2530.3090.1920.2360.2750.1400.1510.160Recovery(x±s)/%100.00±0.86100.±1.33100.60±0.4497.56±0.40102.44±0.32100.00±0.59109.09±1.07104.55±0.9796.97±0.335.02%6.33%

对两种方法所得结果进行双侧t检验,TLSC法

和HPLC法测得的人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1含量无显著性差异(P>0.05),而三七皂苷R1含量则有显著性差异(P<0.05),TLSC法测得值明显偏高。1.4.2　方法学比较　将TLSC与HPLC的方法学考察结果进行比较(表4)。从表4可知:TLSC法的灵敏度、线性范围、精密度、回收率等均低于HPLC法。

2　讨论

用TLSC法测得的三七皂苷R1含量一般在9%以上,而HPLC法测得值在6%左右,其原因是TLSC法不能有效地分离三七皂苷R1与人参皂苷Rd两种成分[5],致测定结果偏高。而HPLC法能够将其有效分离并测定,结果也准确。

TLSC法操作烦琐,影响因素很多,测定条件不易控制,结果重复性差,而HPLC法测定条件容易控制,测定所需时间短,测定的灵敏度、线性范围、精密度、回收率均优于TLSC法。用HPLC梯度洗脱同时测定三七总皂苷中3种主要成分,简便易行。样品整个分析过程在15min内完成,进样间隔3～5min即可达平衡。

Rg1

R1

入已知量的三七皂苷原料,混匀。按“1.3.1”项下方法测定其含量,再计算回收率(表2)。3种成分高、中、低3个浓度的回收率在97%～110%之间。1.4　TLSC法与HPLC法的比较

1.4.1　TLSC法与HPLC法测定结果的比较　用TLSC法与HPLC法测定同一批三七总皂苷样品中

表4　TLSC法与HPLC法的方法学考察结果(x±s)

Table4　ResultsofmethodologicalinspectforTLSCandHPLC(x±s)

Items

Linearrange/mg

rRSD/%

TLSC

Rb1

2.30-36.800.99148.61

lowmiddlehigh

100.99%±6.07%98.67%±5.27%97.30%±12.32%

Rg1

1.25-20.000.99217.74

93.56%±6.17%98.29%±6.31%

R1

1.75-28.000.9910.65

99.63%±1.37%104.93%±5.91%

Rb1

0.02-5.600.99990.91

100.00%±0.86%100.%±1.33%100.60%±0.44%

Rg1

HPLC

R1

0.03-7.600.99990.58

109.09%±1.07%104.55%±0.97%96.97%±0.33%

0.24-6.080.99990.76

97.56%±0.40%102.44%±0.32%100.00%±0.59%

Recovery100.00%±10.45%91.%±7.69%

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收稿日期:2005-08