Westernblot所需溶液的配制

1 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (Running buffer) 5 X

Tris base Glyci ne （甘氨酸） SDS 15.14g 72.0g 5.0g 蒸馏水 溶解至1000ml 5XTris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72g甘氨酸，5g电泳级的SDS,双 蒸水 定容至1L, pH值为8.3。使用前，将5X稀释到IX :取200ml 5X ,定容到 1000ml。

2转膜缓冲液

（Sending buffet ）（现用现配）

1000 ml 1500 ml 21.6 g 37.5ml 1.5 ml 300 ml 14.413 g 25 ml 1 ml 200 ml Glyci ne （甘氨酸） 1.0 M Tris.HCI (pH8.3) 10% SDS 甲醇(metha nol) 蒸馏水

溶解至1000 ml 溶解至1500 ml 必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加 SDS

3

10% SDS 配置

电泳级 十二烷基硫酸钠也叫 SDS（ Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C i2H25O4NaS） 溶液：10g

SDS, 100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室 温保存。 4

Tris.HCI的配置

1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到 250ml 水 中 1.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到 250ml 水 中 1.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到 250ml 水 中 1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 浓盐酸调pH到8.8 浓盐酸调pH到8.8 浓盐酸调pH到6.8 浓盐酸调pH到8.3,需 要Tris 30.28 g 加入到 250ml 水 中 大约8毫升。 注：Tris的分子量是121.4. 4度储存

5 10% APS (Ammonium persulfate ;

过硫酸铵)的配置

称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至 10ml，分装到1.5ml微量离心管中， 负

30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。 4度存则两周内

用完，最多不能超过一个月。负 20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10 x TBS 仃 ris-buffered saline) NaCl Tris base 80 g 24 g 的配置

160 g 48 g 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml

加HCI调pH到7.6,室温储存

7 TBST 仃 ris-buffered sal ine with Twee n20)

的配置

200 ml 2 ml 10XTBS Tween20 100 ml 1 ml 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml 室温储存。 8上样缓冲液(loading buffer )的配置

SDS-PAGE 加样缓冲液：pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml，甘油 6.4ml，10%SDS 12.8ml,巯基乙

醇3.2ml, 0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例 与蛋白质样品混合，在沸水终煮 3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋 白量100 g

9 stacki ng gel buffer (4X)

A

Tris base: 0.5M 5 ml 1M Tris.HCl SDS(w/v): 0.4% 0.4ml 1%SDS 调pH到6.8,加双蒸水到10毫升

10 5x Sample buffer (10ml)

Stack ing gel buffer SDS 巯基乙醇 5 ml 1.0 g 2.5 ml (最后再加) 甘油(glycerol) 溴芬兰(Sigma B-8026 ) 2.5 ml 2.5 mg 室温储存 11圭寸闭液的配置 Blocking solution

5% (w/v) nonfat dried milk 或者 1%BSA

要用TBST配制牛奶

0.01% an tifoam A (Sigma)

0.01%(v/v) sodium azide 12丽春红溶液:

100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。 1） 4%多聚甲醛（PFA）的配制（ 1000毫升）

40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全 部溶 解后冷

却到4度，再加入100毫升的10X PBS，加水定容到1000毫升。调pH至U 727.4。通风橱过滤，4度保存。

13组织裂解液

10mM Tris- HCl (pH 7.4) 150mM NaCI 1% Triton X-100 1% 去氧胆酸钠(Sodium dexycholate 5mM EDTA 1% SDS PMSF （难溶解） 48.44mg 粉末或 1M Tris- HCl 0.4ml 350.6 mg 0.4 ml 100% 400 mg 74.4 mg 或 0.25M EDTA 3.2 ml 10% SDS 0.4 ml 蛋白酶抑制剂 步

7 mg 1 片/10ml 骤：

戴口罩。

首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH使溶解，再调pH至7.4;然后 分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应

14. PBS 的配制(1000 毫升)

NaCL (PH 7.2〜7.4 )

8.00 g KCL 0.20 g 3.455 g Na2HPO4.12H2O 或 (1.56 g) (或 Na2HPO4.H2O) KH2 PO4 0.20 g