基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体及其制备方法和应用[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200810072485.X[51]Int.CI.

C12N 15/63 (2006.01)C08B 37/08 (2006.01)C08G 77/452 (2006.01)

[43]公开日2009年5月27日[22]申请日2008.12.26[21]申请号200810072485.X

[71]申请人厦门大学

地址361005福建省厦门市思明南路422号[72]发明人任磊 张亚菲 印佩 王祖勇 王军 张其

清

[11]公开号CN 101440376A

[74]专利代理机构厦门南强之路专利事务所

代理人陈永秀 马应森

权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 3 页

[]发明名称

基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体及其制备方法和应用[57]摘要

基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体及其制备方法和应用，涉及一种非病毒载体的基因递送载体。提供一种新型的羧甲基壳聚糖－硅氧烷纳米杂化材料及其制备方法，其具有良好的生物相容性，可作为基因治疗的递送载体以实现对DNA的运输和表达。所述的基于壳聚糖的基因递送载体为羧甲基壳聚糖和硅烷组成的有机－无机纳米杂化材料，将羧甲基壳聚糖和硅烷在碱性条件进行化合，通过水解反应及硅烷的聚合反应，即可得羧甲基壳聚糖－硅氧烷纳米颗粒。其具有较高的稳定性和良好的生物相容性。可以高效率地与治疗基因通过静电吸附作用结合，并能保护治疗基因不被降解。该基因递送载体可以有效递送治疗基因到宿主细胞并进行高效表达。

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权 利 要 求 书

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1.基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体，其特征在于为羧甲基壳聚糖和硅烷组成的有机-无机纳米杂化材料，其结构式如下：

其中R＝C8H11O6，为羧甲基壳聚糖分子单元。

2.如权利要求1所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体，其特征在于按质量比，羧甲基壳聚糖∶硅烷＝1∶1～3。

3.如权利要求1所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体，其特征在于所述的硅烷为3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。

4.如权利要求1所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采用碱溶液作为溶剂制备羧甲基壳聚糖溶液，按质量百分比，羧甲基壳聚糖的含量为0.08％～1％；

2)在羧甲基壳聚糖溶液中加入硅烷，得到反应液；

3)将反应液于25～60℃加热搅拌至整个体系呈现乳光并乳光颜色不再加深，得到乳白色悬浮液；

4)将悬浮液离心分离，收集白色沉淀并用蒸馏水洗涤，冷冻干燥后得到羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料，即为基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体。

5.如权利要求4所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体的制备方法，其特征在于所述碱溶液为氨水。

6.如权利要求4所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体的制备方法，其特征在于所述硅烷为3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。

7.如权利要求1所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体用于与外源基因结合实现对DNA的运输和表达。

8.如权利要求7所述的用于与外源基因结合实现对DNA的运输和表达的具体步骤如下：

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1)将羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料悬浮于医用酒精中，离心分离，得无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料；

2)将无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料悬浮于无菌水中，超声分散，加入无菌的外源基因，按质量比，无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料的纳米颗粒：外源基因为50～200∶1，得复合溶液；

3)将复合溶液涡旋，静置，得载有外源基因的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料的悬浮液；

4)收集悬浮液中的沉淀，得载有外源基因的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米基因载体。 9.如权利要求8所述的用于与外源基因结合实现对DNA的运输和表达，其特征在于外源基因为双链环状质粒DNA，单链反义寡核普酸或RNA。

10.如权利要求8所述的用于与外源基因结合实现对DNA的运输和表达，其特征在于涡旋的温度为4～40℃，涡旋的时间为10～50s，静置的时间至少30min。

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说 明 书

基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体及其制备方法和应用

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技术领域

本发明涉及一种非病毒载体的基因递送载体，尤其是一种非病毒载体—羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米杂化材料及其制备方法和应用。背景技术

基因治疗是指将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或起治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。基因治疗有3个基本要素：目的基因、表达载体和递送载体，其中递送载体的构建和改进，一直是基因治疗研究的重点。递送载体有病毒载体和非病毒载体两类。相对于病毒载体，非病毒载体具有低毒、低免疫反应、使用简单、制备方便以及便于保存和检验等优势，近些年得到人们愈来愈多的重视。理想的非病毒基因载体系统，应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性以及较高的稳定性。目前所研究的非病毒型纳米基因载体主要集中在以一些有机高聚物为材料制备的纳米颗粒，特别是天然高分子，如壳聚糖、明胶等。无机材料也广泛地用于基因载体的研究，如Au、SiO2纳米颗粒等制备的非病毒型基因载体也有报道。然而，由于壳聚糖的溶解性较低，以及转染效率低下等问题了其在基因治疗方面的应用。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的一种改性产物，具有较高的溶解性，实验证明其也同样具有很好的生物相容性。发明内容

本发明的目的在于提供一种基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体及其制备方法和应用，其具有良好的生物相容性，可作为基因治疗的递送载体以实现对DNA的运输和表达。 所述的基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体为羧甲基壳聚糖和硅烷组成的有机-无机纳米杂化材料，按质量比，羧甲基壳聚糖∶硅烷＝1：(1～3)，其结构式如下：

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其中R＝C8H11O6，为羧甲基壳聚糖分子单元。

所述的硅烷为3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。 红外光谱表征显示该纳米材料在1637cm和458cmcm

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、1337cm

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、1030cm

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～11cm

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、5cm

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具有吸收，其中1637cm

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是羧甲基壳聚糖中羰基-C＝O的伸缩振动吸收峰，1337

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是反应后复合材料的酰胺振动峰，1030cm

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和1078cm

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是C-O的伸缩振动峰，5cm

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是伯氨-NH2的弯曲振动峰，11cm振动峰。

是Si-O-Si的伸缩振动峰，458cm-1是Si-O-Si的弯曲

基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体的制备方法如下：

1)采用碱溶液作为溶剂制备羧甲基壳聚糖溶液，按质量百分比，羧甲基壳聚糖的含量为0.08％～1％；

2)在羧甲基壳聚糖溶液中加入硅烷，得到反应液；

3)将反应液于25～60℃加热搅拌至整个体系呈现乳光并乳光颜色不再加深，得到乳白色悬浮液；

4)将悬浮液离心分离，收集白色沉淀并用蒸馏水洗涤，冷冻干燥后得到羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料，即为基于羧甲基壳聚糖的基因递送载体。 所述碱溶液最好为氨水。

所述硅烷最好为3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。

所述制备的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料作为基因递送载体，与外源基因结合可实现对DNA的运输和表达。

用于基因递送载体实现对DNA的运输方法的具体步骤如下：

1)将羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料悬浮于医用酒精中，并离心分离，得无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料；

2)将无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料悬浮于无菌水中，超声分散，然后加入无菌的外源基因，按质量比，无菌的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料的纳米颗粒∶外源基因为(50～200)：1，得到复合溶液；

3)将复合溶液涡旋，静置，得载有外源基因的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料的悬浮液；

4)收集悬浮液中的沉淀，即可得到载有外源基因的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米基因载体。 外源基因最好是双链环状质粒DNA，单链反义寡核普酸或RNA等。

将复合溶液涡旋的温度最好为4～40℃，涡旋的时间最好为10～50s，静置的时间最好至

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少30min。

本发明所制备的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料不仅生物相容性好，无毒副作用，稳定性高；而且材料易得，成本低廉，制备方法工艺简单，合成条件温和。另外，载有外源基因的羧甲基壳聚糖-硅氧烷-多肽基因载体，转导效率高，无免疫原性、无细胞毒性，且可转移的外源基因的大小范围可以从几十bp到几千kb，克服了病毒载体插入外源基因的大小。作为基因递送载体可以高效率地与治疗基因通过静电吸附作用结合，并能保护治疗基因不被降解。该基因递送载体可以有效递送治疗基因到宿主细胞并进行高效表达。附图说明

图1为羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米颗粒的TEM电镜照片。在图1中，(a)尺寸约为200nm的羧甲基壳聚糖—硅氧烷杂化材料；(b)尺寸约为500nm的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳杂化材料；(c)尺寸为1000m的羧甲基壳聚糖-硅氧烷杂化材料；标尺为500nm。

图2为实施例1制备的羧甲基壳聚糖—硅氧烷(CMG)纳米杂化材料的红外图谱。在图2中，横坐标为波数Wavenumber(cm)，纵坐标为红外光透过率Transmittance(％)；从左至右，振动峰为C＝O，C-O，Si-O-Si振动峰。

图3为羧甲基壳聚糖-硅氧烷-DNA纳米颗粒复合物稳定性琼脂糖凝胶电泳图。在图3中，电泳泳道Lane1为DNA marker分子量标记物，Lane 2为裸荧光素酶质粒DNA；Lane3～7为羧甲基壳聚糖-硅氧烷-DNA复合物，其中羧甲基壳聚糖-硅氧烷与DNA的质量比分别为500∶1，400∶1，300∶1，200∶1和100∶1；Well表示电泳点样空；DNA表示质粒基因；M表示marker标准分子量泳带；ND表示naked DNA即裸DNA(无载体的DNA空白对照)；CMG/DNA表示CMG纳米颗粒与DNA的复合材料。

图4为羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米颗粒的细胞毒性MTT实验谱图。在图4中，横坐标为纳米粒子的浓度Concentration(mg/mL)，纵坐标为细胞存活率Normailzed vibaility(％ ofcontrol)。

图5为实施例5中裸DNA、壳聚糖/DNA复合纳米颗粒以及不同质量比的羧甲基壳聚糖—硅氧烷/DNA复合纳米颗粒介导外源基因在细胞中的转染效率图。在图5中，横坐标nakedDNA表示裸DNA，即无载体的DNA，作为对照参比；chitosan/DNA为壳聚糖DNA的复合材料，作为对照，证明本发明的载体比其性能有所提高；CMG为本发明的新型载体，载体与DNA的质量比为100∶1；纵坐标为外源基因表达的相对光子数Luciferase Activity(RLU per10Cells)，其中羧甲基壳聚糖-硅氧烷与DNA的质量比分别为300∶1，200∶1和100∶1。 具体实施方式

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下面通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1

将0.016g羧甲基壳聚糖溶于20mL、pH为11的氨水溶液中，在30℃下搅拌30min，配制成0.08％的羧甲基壳聚糖溶液。然后向上述羧甲基壳聚糖溶液中加入0.048g 3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。该反应液在60℃下搅拌反应3h后即可得到乳白色悬浮液。将乳白色悬浮液进行高速离心分离(19,000rpm，15min，20℃)，即可得到白色沉淀。白色沉淀用蒸馏水洗涤2次，即可得到如图1(a)所示的尺寸约为200nm的羧甲基壳聚糖—硅氧烷杂化材料。以红外图谱进行表征，如图2所示，该纳米杂化材料在1637cm、1337cm、1030cm～11cm

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、5cm

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和458cm

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具有吸收，其中1637cm

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是羧甲基壳聚糖中羰基C＝O的伸缩

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振动吸收峰，1337cm动峰，5cm

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是反应后复合材料的酰胺振动峰，1030cm

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和1078cm

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是C-O伸缩振是Si-O-Si的

是伯氨-NH2弯曲振动，11cm是Si-O-Si的伸缩振动，458cm

弯曲振动。结果表示该材料是一种由羧甲基壳聚糖和硅氧烷复合而成的杂化材料。 实施例2

将0.1g羧甲基壳聚糖溶于20mL、pH＝11的氨水溶液中，在30℃下搅拌30min，配制成0.5％的羧甲基壳聚糖溶液。然后向上述羧甲基壳聚糖溶液中加入0.2g3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。该反应液在25℃下搅拌反应过夜后，即可得到乳白色悬浮液。将该乳白色悬浮液进行离心分离(10,000rpm，15min，20℃)，即可得到白色沉淀。白色沉淀用蒸馏水洗涤2次，即得到如图1(b)所示的尺寸约为500nm的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳杂化材料。 实施例3

将0.2g羧甲基壳聚糖溶于20mL、pH＝11的氨水溶液中，在30℃下搅拌30min，配制成1％的羧甲基壳聚糖溶液。然后向上述羧甲基壳聚糖溶液中加入0.2g3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。该反应液在60℃下搅拌反应3h后，即可得到乳白色悬浮液。将该乳白色悬浮液进行离心分离(5,000rpm，15min，20℃)，即可得到白色沉淀。白色沉淀用蒸馏水洗涤2次，即可得到如图1(c)所示的尺寸为1000m的羧甲基壳聚糖-硅氧烷杂化材料。 实施例4

将实施例1制备的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米杂化材料用超声法悬浮于医用酒精中，并高速离心分离(19,000rpm，15min，20℃)，即可得到无菌的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米杂化材料。将该无菌的纳米材料悬浮于无菌的去离子水中，超声分散。按羧甲基壳聚糖-硅氧烷与DNA质量比分别为500∶1，400∶1，300∶1，200∶1及100∶1的比例，加入质粒DNA。如图3所示，电泳结果表明羧甲基壳聚糖-硅氧烷-DNA复合物的点样孔都保持亮度，只有在100∶1

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中有少量的解离，说明该材料与DNA有很好的结合能力。 实施例5

将羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米杂化材料用超声法悬浮于医用酒精中，并高速离心分离(19,000rpm，15min，20℃)，即可得到无菌的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米材料。将该无菌的纳米材料悬浮于无血清的DMEM培养基中，超声分散，使其含量分别为100g/mL，200g/mL，300g/mL，400g/mL和500g/mL。按每孔3.5×10个细胞的密度，将人子宫颈癌细胞HeLa接种于6孔培养板，培养24h后，用酶标仪测定其吸光值。如图4所示，该羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米材料具有良好的生物相容性。 实施例6

将实施例1制备的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米材料用超声法悬浮于医用酒精中，并高速离心分离(19,000rpm，15min，20℃)，即可得到无菌的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米材料。将该无菌的纳米材料悬浮于无血清的DMEM培养基中，超声分散，使其含量为10mg/mL。在上述悬浮液按材料与质粒DNA的质量比例300∶1，200∶1和100∶1，加入无菌的含有编码荧光素酶DNA的质粒溶液(1mg/mL)混合，并于25℃下涡旋30s，然后静置30min，即可得到载有荧光素酶质粒DNA的羧甲基壳聚糖—硅氧烷纳米杂化材料的培养基悬浮液。 按每孔3.5×10个细胞的密度，将人子宫颈癌细胞HeLa接种于6孔培养板内，培养6h贴壁后，吸去旧培养液，用PBS洗涤培养板中的细胞两次。每孔加入200L上述载有荧光素酶质粒DNA的羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米材料的培养基悬浮液，然后每孔补加800L无血清的DMEM培养基。培养11个h后，更换完全培养基，继续培养36h。最后，用细胞荧光素酶定量检测试剂盒检测转染表达的相对光子数。

如图5所示，在同等条件下羧甲基壳聚糖-硅氧烷纳米粒子转染效率明显高于壳聚糖/DNA复合纳米颗粒以及裸DNA，说明羧甲基壳聚糖-硅氧烷作为一种基因载体可以很明显地提高基因转染的效率，而且随着羧甲基壳聚糖-硅氧烷与DNA的质量比的增加，转染效率也随之增加。

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图2

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图3

图4

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图5

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