RNA干扰技术及其应用

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分子生物医学

RNA干扰技术及其应用

郑亚婷

󰀁

(综述),段󰀁勇,王玉明(审校)

󰀁

(昆明医学院第一附属医院检验科,昆明650032)

中图分类号:R394;R342.3;R34󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1006-2084(2010)05-0641-04

在不断探索之中,尚未完全明源序列的信使RNA被降解,从而抑制了该基因的表达。从发现RNAi现象以来,对RNAi的了解了。目前,公认的RNAi技术已取得重大进展。包括从最初的,对其干扰模式的预测,到如今,能够精确了解RNAi在多个物种

基本原理是dsRNA在细胞内

中调节基因表达的作用机制及多面性。RNAi技术也已经在很多领域成为研究基因功能的重要

被RNA内切酶󰀁(RNase󰀁工具。

关键词:RNA干扰;小干扰RNA;基因治疗endonuclease)-Dicer酶切割成

3󰀁端带未配对核苷酸尾及5󰀁端RNAInterferenceTechniqueandItsApplication󰀁ZHENGYa-ting,DUANYong,WANGYu-ming.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming

磷酸化的21~23nt小RNA双650032,China)

Abstract:RNAinterference(RNAi)isaprocessofgenesilencinginducedbydouble-strandRNA链,即由正义链、反义链组成(dsRNA).Inthiscourse,themessengerRNAhomologoustodsRNAisdegradedandexpressionofthisgeneisrestrained.FromthediscoveryofRNA,itheunderstandingofRNAihasbeenincreased.Theunder-的RNAi效应中间产物小干扰standingsfromtheinitialpredictionofinterferencepatternstoasophisticatedunderstandingofamult-ifac-RNA(smallinterferingRNA,eted,mechanismsthatregulategeneexpressioninmanyorganisms.ThetechniqueofRNAihasalsobeen

developedasagenetictoolthatcanberesearchedinmoreandmoredomains.siRNA)。siRNA再与Dicer酶Keywords:RNAinterference;SmallinterferingRNA;Genetictherapy

形成RNA诱导沉默复合体

󰀁󰀁RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是指内(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)。RISC还可

[4]

源性或外源性双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)以与许多辅助蛋白相互作用。靶基因转录出的介导的细胞内mRNA发生特异性降解,最终导致相mRNA按照碱基互补原则和RISC中解链后siRNA

[1]

应的转录后基因沉默。自从RNAi现象被发现以的反义链相结合,随后Dicer酶将mRNA切割成来,作为自然界生物中广泛存在的一种保守的自我21~23nt的小RNA片段,从而特异性地抑制靶基因

[5]

保护现象,RNAi已成为近几年来基因组学研究的热的表达(图1)。siRNA反义链还可以作为引物,在点内容之一,研究领域也已拓展到基因治疗范围。RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApoly-RNAi技术不仅在基因治疗研究中应用日渐广泛,也merase,RdRp)催化下,以靶mRNA为模板合成长已成为重要的分子研究工具。dsRNA分子,后者又可被RISC降解为新的siRNA,1󰀁RNAi技术新生的siRNA又可进入上述循环。而mRNA酶降解[2]1.1󰀁RNAi现象的发现󰀁Fire等在1998年将后Dicer酶复生与新产生的siRNA再次形成RISC复dsRNA注入秀丽隐杆线虫,随后发现注入的dsRNA合体,继续降解mRNA,从而产生级联放大效应,也称能够特异性降解虫体体内同源mRNA,导致基因沉mRNA降解聚合酶链式反应(polymerasechainreac-默,称此现象为RNAi。此后,RNAi现象被广泛地发[6]

tion,PCR)。每个细胞仅需少量dsRNA,即有可能

现于果蝇、拟南芥和锥虫等生物中。起初,大多数人

完全抑制相应基因表达。此外,siRNA还可以在

认为在哺乳动物细胞中并不存在RNA,i主要是由于

RdRp催化下大量扩增,甚至转运出细胞将RNAi效

进化的哺乳动物具备抗dsRNA的保护机制。直到[7]

应扩散到整个机体并传代。[3]

Elbashir等发现把人工合成的21个核苷酸的

2󰀁RNAi机制的特点

dsRNA导入人胚肾细胞可以诱导RNA,i才证实在哺

2.1󰀁普遍性󰀁自然界的大部分物种中都存在RNAi

乳动物细胞中也存在RNAi现象。但较长dsRNA由

机制,从植物、低等动物到人类。因为他们都保留了

于可诱发细胞内干扰素系统,产生干扰素样反应,引

RNAi运作的必需酶类。只要将dsRNA或siRNA导[1]

发广泛的非特异性阻抑效应,而导致细胞凋亡。

入细胞,即可激发RNAi。而siRNA在多种动物器官

1.2󰀁RNAi技术的基本原理󰀁RNAi的机制迄今还

组织,包括肝、脾、肾、胰腺、血液、视网膜、神经系统

基金项目:云南省自然科学基金面上项目(2007C134M)和胚胎等中,能抑制特异基因的表达。几乎已知的󰀁󰀁摘要:RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默。在此过程中,与双链RNA有同

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医学综述2010年3月第16卷第5期MedicalRecapitulate,Mar2010,Vo.l16,No.5

基因都能被RNAi沉默,用siRNA或dsRNA抑制的

基因数量已超过4000种。2.2󰀁高效性󰀁siRNA进入细胞4~6h后mRNA开始降解,24h便能检测到蛋白明显抑制。体外试验表明,RNAi的抑制效能非常高,能使靶基因表达显著减少。单次把50󰀁gsiRNA注入小鼠血液内,能高效地抑制多个器官的基因表达,其中肝内抑制效果最强,能达到80%以上,并被首次用于治疗小鼠暴发

[8]

性肝炎模型。这种高效强大的基因抑制功能可能与以下因素有关:RISC降解能力、siRNA更容易接近mRNA靶点、siRNA的双链结构更稳定,在体内半衰期达24h。

图1󰀁RNAi干扰原理

2.3󰀁特异性󰀁siRNA是严格按照碱基配对与mRNA位点结合,故特异性很高。只要与互补mRNA序列相差仅一个碱基对的siRNA抑制能力就会大大降低,相差2、3个碱基对的siRNA干扰作用几乎完全丧失。若仅针对靶基因mRNA,并通过相应的详细基因序列检索排除正常细胞其他基因序列的互补情况,可防止非相关基因抑制所致的不良反应,也不会分散siRNA抑制效应。3󰀁siRNA的制备

siRNA直接转染动物细胞后通常可以诱导细胞内目的基因产生3~7d的高度的沉默,随后siRNA随时间的延长逐渐地被降解,靶基因的沉默现象逐渐得到恢复,基因沉默的效率主要取决于细胞增殖

[9]

速度和siRNA的效能。Hohjoh等提出siRNA正义链的3󰀁端有1~4个与反义链错配的核苷酸,即󰀁Fork-siRNA󰀁。与传统siRNA双链相比,Fork-siRNA能使沉默效应得到增强。为了评价siRNA的设计规

[10]

则,Chalk等检索到来自92个基因的398个siRNA序列,发现结合能量是siRNA设计的关键因素。Naito等还发明了siDirect高效siRNA序列设计在

线软件系统。目前为止,较为常用的有5种制备siRNA方法,包括:化学合成法、体外转录法、RNase󰀁或Dice酶切dsRNA、siRNA表达载体法和siRNA表达框法。3.1󰀁化学合成法󰀁通过化学合成的方式由合成仪按照序列进行合成并纯化。直接合成两条互补的21~23ntRNA单链,突出端为DNA碱基,增加了siRNA对RNase降解的耐受性。两条互补单链经过退火形成双链siRNA或发夹结构RNA,通过电转导或质脂体的方法转染给细胞,拥有效率高和对细胞毒害作用小的优点,转染率通常可以超过70%,且实验操作简单。利用化学合成siRNA对靶基因沉默的维持时间也较为短暂,一般72h之内。该方法的优点是得到的siRNA纯度高且无需任何其他实验,但缺点是价格高昂,且RNA较易被环境中的RNA酶所降解,所以对合成的条件和转染时的操作有严格的要求。目前研究人员多采用的方法是利用相对廉价的方法合成siRNA进行筛选,确认最高效率的siRNA后,再利用化学合成的方式合成siRNA进行实验。3.2󰀁体外转录法󰀁在体外,针对siRNA的序列合成对应的DNA链,再利用RNA聚合酶的T3或17启动子进行转录,合成两条互补的21~23ntRNA单链,经过退火形成双链siRNA,转录产物再转染给细胞。该方法的优点是价格便宜,试剂盒使用方便,但缺点是维持时间短暂,需要进行其他实验,操作繁琐,且siRNA合成量受到限制。目前主要被用于最有效的siRNA的筛选。3.3󰀁RNase󰀁或Dice酶切dsRNA法󰀁从一些siRNA序列中筛选出效率最高的siRNA分子是RNAi研究的一大瓶颈,针对这种状况研究人员设计出了一种叫󰀁鸡尾酒󰀁的siRNA制备方法。该方法模拟siRNA在体内的工作原理,针对200~1000nt的靶基因mRNA序列,在体外转录合成长片段dsRNA;然后利用RNase󰀁或Dicer对长dsRNA进行酶解,获得一组不同的siRNA片段混合物;最后再将混合物直接转

[12]

染细胞。但利用Dicer或RNase󰀁消化体外转录形成的siRNA转染细胞后较容易引起细胞内干扰素样反应,导致细胞凋亡。该方法的优点是可以避开繁琐的siRNA设计与筛选工作,缺点是可能产生非特异性基因的抑制,给真正起作用的siRNA的鉴别带来困难。3.4󰀁siRNA表达载体法󰀁在体内,将siRNA对应的DNA双链序列克隆到驱动小发夹RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)表达所用的启动子上,常用的RNAPol󰀁启动子有人、鼠的U6小核RNA(Smallnuclear[11]

医学综述2010年3月第16卷第5期MedicalRecapitulate,Mar2010,Vo.l16,No.5

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RNA,snRNA)和人H1RNA启动子,这2个启动子介导转录必需的位点均位于转录片段的5󰀁端区域,转录出的RNA无polyA尾,这样就能在体内表达目标siRNA。在转录过程中,U6启动子的第一个掺入核苷酸是鸟苷酸,H1启动子的是腺苷酸,还可以是其他3种核苷酸。该方法的优点是使siRNA载体直接表达,载体可长期循环使用,但是需要大量克隆工作,耗时长,且转染效率低。3.5󰀁siRNA表达框法󰀁siRNA表达框架法(siRNAexpressioncassettes,SEC)是通过PCR方法获得siRNA表达模板,直接转入细胞而无需克隆到载体的siRNA制备方法。这个方法最早是由Castanotto[13]

等采用,SEC中包括RNAPol󰀁启动子、shRNA模板和RNAPol󰀁终止信号等元件。相对于siRNA表达载体法,SEC无需片段克隆和测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,全部操作可在数小时内完成。因此,SECs已成为筛选有效的siRNA片段、合适的启动子和siRNA片段组合的最佳选择。SEC基于PCR技术获得,大规模制备能力有限,选出有效片段后可直接克隆到载体中使用。4󰀁RNAi技术的应用和前景

自从发现RNAi现象以来,在多个领域都引入这项技术用于研究,包括基因功能信号转导通路、基因治疗等多方面的研究。其中在基因治疗方面已取得了不菲成绩。找到新基因,弄清基因功能以及基因之间相互调控的方式已成为基因时代的主题。而󰀁致病基因󰀁的表达与许多疾病发病机制有关。致病基因包括侵入人体细胞的病原体基因,调节失控而过量表达的内源基因,由于突变而导致细胞毒性产物积累的基因,还有病态细胞内环境中表达的基因等。RNAi是目前国际上最先进的一种生物医药技术,在抗人类免疫缺陷病毒(humanImmunodeficiencyvirus,HIV)基因、肝炎病毒基因、癌基因或突变基因的表达方面也显现出强大的优势,通过RNAi抑制这些基因的过度表达,能够为这些疾病治疗开辟新的领域。4.1󰀁在基因治疗中的应用4.1.1󰀁HIV󰀁RNAi最早应用在研究siRNA体外抑制HIV感染上,使病毒复制大大减少。CCR5是内源性人受体蛋白,是主要的HIV-1共同受体,联合使用沉默宿主细胞CCR5受体基因和针对病毒结构基因

[14]

的siRNA,能完全遏止病毒对细胞的感染。用siRNA转染外周血T细胞,CCR5表达量减少,从而

[15]

使感染细胞数显著减少。Lau等针对HIV-1整合宿主细胞基因组所必需的整合酶成功设计出shRNA,转染细胞,数据显示能够有效抑制整合蛋白合成,并显著减少HIV-1病毒颗粒释放。4.1.2󰀁丙型肝炎󰀁研究人员用电穿孔技术转染细胞发现,siRNA能消除丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)复制,可以基本󰀁治愈󰀁98%丙型肝炎患

[16]

者的肝细胞。Volarevic等就siRNA在细胞内对HCV的切割活性进行了系统论述。siRNA用来对抗HCVNS5B(非结构蛋白5B,病毒多聚酶编码区域)

[17]

亦有效。Kapadia等先用反转录PCR筛选针对NS5B的siRNA,将能抑制HCVRNA的两种siRNA分别与表达HCV的质粒共转染Huh7细胞,杂交结

[18]

果显示抑制程度分别达5.7和8.3倍。Suzuki等则进一步显示,在组织培养中siRNA对HCV有非常明显的抑制作用。因此,RNAi技术为HCV感染的治疗提供了一个新途径。4.1.3󰀁恶性肿瘤󰀁肿瘤是多基因、多因素疾病,是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,是具有无限生长的克隆选择的结果。如果只针对单个基因的治疗一般效果是不明显的。一些肿瘤基因的变异往往反映在mRNA水平上,如多药耐药基因(mdr)、血管内皮细胞生长因子基因和细胞黏附因子基因等,而siRNA能特异地区分肿瘤和正常细胞,有望会成为理想的抗癌药。抗凋亡基因survivin被认为是诊断和治疗肿瘤的一个很有价值的基因,是RNAi治

[19]

疗的候选基因。最近用基因芯片进行的研究表明,用RNAi方法抑制慢性髓性白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白表达可启动细胞内其他沉默的癌

[20]

基因、抗凋亡基因和细胞因子的表达。目前,RNAi技术被广泛地用于新的肿瘤治疗靶基因的寻找、新的肿瘤药物的研发、新的肿瘤药物的作用靶点寻找和提高肿瘤细胞对抗肿瘤药敏感性等研

[21]

究上。4.2󰀁前景󰀁随着对RNAi不断深入的研究,其强大的潜能正在被逐渐发现和认识,基因时代对基因功能的分析离不开RNA,iRNAi的兴起使生物医学技术步入崭新阶段。因其沉默机制的广泛性、高效性和特异性,RNAi可能成为继单克隆抗体后又一次临床治疗手段的革命,其工艺要求不高,合成价格低廉,应用前景比后者更广阔。虽然目前仍存在较多的问题,如转染效率低、稳定性不高等,但随着对其研究的深入,不久的将来将看到siRNA成为一种新型药物而被更多的用于临床治疗。参考文献

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收稿日期:2009-07-23󰀁修回日期:2010-01-10

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心血管系统中微小RNA的作用

秦󰀁升

1󰀁

,金百翰,魏󰀁茜

1󰀁1󰀁

(综述),任安经

2󰀁

(审校)

(第二军医大学1研究生管理大队,2基础部病理生理学教研室,上海200433)

中图分类号:Q52;R541󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号:1006-2084(2010)05-0644-03

󰀁󰀁摘要:miRNA是一类内源性的,小的非编码的RNA,它可以调节人类大约30%的蛋白质编码基因。到目前为止,已有400多个人的miRNA被克隆和测序,其中一些miRNA在心血管组织高表达和特异性表达,参与心脏发育、心肌肥大/心力衰竭、电重塑和血管增殖的调节,miRNA在心血管方面的生理和病理意义越来越被关注,将来也很有希望为心血管疾病的治疗提供新的手段。

关键词:心血管;心肌肥大;血管增生;微小RNAImplicationofMicroRNAsintheCardiovascularSystem󰀁QINSheng1,JINBai-han1,WEIQian1,REN

2

An-jing.(1.TheGraduatesManagementBrigade,2.DepartmentofPathophysiology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:MicroRNAs(miRNAs)areendogenous,smal,lnoncodingRNAsthatcanregulateabout30%ofthehumanprotein-codinggenes.Sofar,morethan400miRNAshavebeenclonedandsequencedinhumanandsomeofthemarehighlyandspecificallyexpressedincardiovasculartissues.ThesemiRNAsareinvolvedintheregulationofheartdevelopment,cardiachypertrophy/heartfailure,electricalremodelingandvascularproliferation.PhysiopathologicalimplicationsofmiRNAinthecardiovascularsystemhavebeenincreasinglyconcerned,whichmayprovidenewmeansofcardiovasculardiseasestreatmentinthefuture.

Keywords:Cardiovascular;Cardiachypertrophy;Vasculoproliferation;miRNA

苷酸的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。它通

过与其目标mRNA分子的3󰀁端非编码区互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到

[1]

抑制。人们于1993年首先发现miRNA可以调节线虫的发育和分化,在人类估计有超过1000余种miRNA,目前已有400余种miRNA被克隆和测序,它们参与调

󰀁󰀁微小RNA(microRNA,miRNA)是近年发现的小的、内源性的单链的非编码RNA,由18~25个核苷酸组成,由一段具有发夹环结构的长度为70~80核

基金项目:国家自然科学基金(30800375);第二军医大学本科生创新基金(MS2008024)

控大约30%的基因。miRNA的表达有组织特异性和

[2,3]

发育阶段特异性,除了在动物的发育中起重要作

[4]

用外,在骨骼肌增殖和分化、造血系分化、肿瘤和病毒性疾病中都起着重要的作用。一些miRNA在心血管高表达,它们在调控心血管的发育和疾病方面具有重要意义,这给心血管疾病的治疗带来了希望。