麻风树组培

烟草叶片一农杆菌浸染(0D600=0.6一0.8浓度,浸染smin)一在MS+6一BAlmg/L上共培养Zd~MS+6一BAlmg/L+Km100mg/L+Timentin250mg/L+头抱曲松钠500mg/L选择培养,获得愈伤组织和不定芽一MS+6一BAo.lmg/L+Km100mg/L+Timentin250mg/L+头抱曲松钠

300mg/L选择培养,不定芽生长一MS+Km100mg/L+Timentin250mg/L+头抱曲松钠300mgL/诱导生根一PCR、RTPCR分析检测一转基因植物。PCR和巢式PCR检测初步确认目的基因已整和到烟草基因组中,经RT一PCR检测已表明目的基因在烟草中达到了转录水平的表达。

3.3转基因烟草的获得

叶盘转入筛选培养基MSSI中约4天后发现叶盘明显长大变厚,叶盘边缘开始变白。一周后,叶盘几乎完全变白,膨大变厚,边缘有凹凸不平的突起,开始长出抗性愈伤组织,有的直接长出绿色的芽点,继续培养至10一15天后,74%以上的外植体能分化出愈伤组织和84%外植体能分化出再生芽(图2.10一C)。不定芽会继续生长产生丛生芽,其数量可由几枚多至20余枚(图2.10一D)。待丛生芽长到2一3cm时,用解剖刀将长势较好再生芽从基部切下,并转入MSS。生根培养基上诱导生根。产生的不定芽大多能够在生根培养基上长出健壮的根(图2.10一E),生根率约为81%。由于生根培养基中的琼脂含量较少,练苗后移栽时,很容易地就能洗净,根几乎未受伤害,移栽的成活率高达90%以上。图(2.10一F)显示的是移栽成活的转基因烟草植株。而用不含重组质粒的农杆菌感染的对照样组叶盘在筛选培养基上也会变白,但膨大不明显,逐渐变黄,始终不能产生愈伤组织,更不能再生出芽(图2.10一A),逐渐死亡。一个月后,待根系发育完全后,练苗一周后将幼苗转移至营养钵,置于温室中生长。成活率达100%。