MePEGPLA聚合物胶束的制备表征及细胞摄取机理初步研究

2 MePEG-PLA 聚合物胶束的制备及表征

2.1 引言

聚合物胶束作为抗肿瘤药物载体是目前研究的热点。聚乙二醇（PEG）是一种无毒、亲水、非免疫原性的聚合物，是FDA批准使用的非离子水溶性聚合物，常用于各种纳米粒的修饰，经PEG修饰的纳米粒能有效地避免与免疫球蛋白作用，阻碍载体与吞噬细胞粘合，延长载体的体内循环时间[87]。疏水段聚乳酸（PLA）由于它的生物可降解性及代谢产物对人体没有毒害而被广泛使用，它与PEG一起构成的二嵌段两性聚合物能载一些难溶性的抗肿瘤药物。

载药聚合物胶束最简单的制备方法是将固体药物用与水混溶的有机溶剂溶解，取少量注入含有胶束的水溶液中。通常为了提高载药量，因此先将药物和聚合物溶解在适当的有机溶剂中，然后缓慢加水，残留有机溶剂可通过透析或挥发法除去，也可将药物和聚合物溶于有机溶剂中，蒸除有机溶剂后，将形成的混合物薄膜重新分散在水相介质中，或将药物和聚合物通过共价键偶联，制备载药聚合物胶束。

本章通过FT-IR、1H-NMR、GPC等手段对聚合物进行了表征。然后分别利用成膜法和自乳化溶剂蒸发法制备载紫杉醇的聚合物，并采用自乳化溶剂蒸发法制备了荧光标记的聚合物胶束，通过透析、超滤等手段除去游离的荧光小分子。利用透射电镜、激光散射粒度仪对所制备了聚合物胶束进行了形态表征，为聚合物胶束在给药系统的应用提供了基本的依据。

2.2 实验部分

2.2.1 实验仪器及试剂 2.2.1.1 主要仪器 分析天平 旋转蒸发仪

BS110S RE-52

北京Satrorius仪器系统有限公司 上海亚荣生化仪器厂

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超滤离心管 FT-IR 光谱仪 透射电子显微镜 核磁共振仪 荧光分光光度计 激光衍射粒度分析仪 高效液相色谱仪 2.2.1.2 主要试剂

35 kDa VERTEX70 TECNAI G2-20 AV400 F4500 Nano-ZS90

Agilent

美国Millipore公司 德国Bruker 公司 荷兰FEI公司 瑞士Bruker公司 日本分光(JASCO)公司 英国Malvern仪器公司 美国Agilent公司

MePEG5000-PLA（50：50） 紫杉醇(99.45%) 芘(＞97%)

尼罗红荧光染料(＞99%) 2.2.2 实验方法

山东岱罡公司

泰华天然生物制药有限公司 瑞士Sigma-Aldrich 公司 美国Sigma公司

2.2.2.1 MePEG-PLA聚合物的表征 （1）傅利叶红外（FT-IR）光谱分析

取适量MePEG-PLA，用KBr压片，在4000～400 cm-1 范围内其红外吸收光谱。 （2）核磁共振谱（1H-NMR）分析

以CDCl3为溶剂，TMS为内标，25 ℃下测定。 （3）凝胶渗透色谱仪（GPC）分析

采用凝胶渗透色谱（GPC）测量相对分子质量大小以及相对分子质量的分布。凝胶色谱分析柱，流动相：四氢呋喃溶液；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。取聚苯乙烯系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由GPC专用软件绘制标准曲线，待测样品相对分子质量的测定根据GPC标准曲线及待测样品的保留时间，采用GPC软件计算样品各组分的重均相对分子质量(Mw)和数均相对分子质量（Mn）。

2.2.2.2 MePEG-PLA聚合物胶束的制备

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(1) 空白胶束的制备

准确称取10 mg MePEG-PLA 于5 mL EP管中，用2 mL乙腈溶解，室温，磁力搅拌器下，把聚合物的乙腈溶液缓慢滴入10 mL PBS中（1滴／10 s）。搅拌24 h后旋转蒸发除去有机溶剂，随着有机溶剂的挥发，内核固化成球，形成聚合物胶束，0.22 μm 水相滤膜过滤，得到透明的空白胶束溶液, 4 ℃冷藏保存。

(2) 载紫杉醇胶束的制备

本研究比较了成膜法和自乳化溶剂蒸发法制备载紫杉醇的聚合物胶束。 成膜法：准确称取1 mg 紫杉醇和10 mg MePEG-PLA ，置于圆底烧瓶中，加入2 mL 三氯甲烷，使其充分溶解，60 ℃旋转蒸发除去有机溶剂，得干燥透明的药膜骨架。60 ℃水浴使固体骨架融化，得到透明的凝胶样样品。加入10 mL PBS，磁力搅拌器搅拌过夜，用0.22 μm 水相滤膜过滤，得到透明的紫杉醇胶束溶液, 4 ℃冷藏保存。

自乳化溶剂蒸发法：准确称取1 mg 紫杉醇和10 mg MePEG-PLA 于5 mL EP管中，用2 mL 乙腈溶解，室温，磁力搅拌器下，把聚合物-紫杉醇的乙腈溶液缓慢滴入10 mL PBS中（1滴／10s）。搅拌24h后旋转蒸发除去有机溶剂，随着有机溶剂的挥发，内核固化成球，形成聚合物胶束，0.22 μm 水相滤膜过滤，得到透明的紫杉醇胶束溶液, 4 ℃冷藏保存。

(3) 荧光标记的聚合物胶束的制备

准确加入120 µL 0.1mg/mL 尼罗红的乙腈溶液和12 mg MePEG-PLA 于5 mL EP管中，用2 mL 乙腈溶解，室温，磁力搅拌器下，把聚合物-尼罗红的乙腈溶液缓慢滴入12 mL PBS中（1滴／10s）。搅拌24h后置于透析袋(MWD 3500)中透析48h, 超滤离心管(MWD 3500)离心除去游离的荧光染料直至下清液无荧光，过0.22 µm 水相滤膜，得到荧光标记的聚合物胶束，4 ℃冷藏备用。 2.2.2.3 MePEG-PLA聚合物胶束的表征

(1) 聚合物胶束的粒径及分布的测定

取1 mL样品，置入激光粒度仪测量粒径，测定温度：25 ℃，平衡时间3 min，激光光源：He-Ne激光，波长为633 nm。

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(2) 聚合物胶束的形貌表征

将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，取约20µL 胶束溶液滴于铜网上，当铜网上的溶剂基本挥发完以后，用1%磷钨酸染色，于室温下自然挥干，胶束固定在网格后，用透射电子显微镜（TEM，Tecnai G2 20公司）观测其形貌。

(3) 包封率试验

包封率（Entrapment Efficiency，EE%）是指包裹在纳米颗粒中的药物占纳米颗粒混悬液中药物总量的比例。包封率是评价纳米颗粒质量优劣的最重要的指标，也是其能否发挥较普通制剂高效低毒特点的关键。本研究通过如下方法测定包封率，取制备好的聚合物胶束（已透析除去游离紫杉醇，过0.22 μm 滤膜除去未溶解的紫杉醇）适量，加三倍其体积的乙腈使胶束破坏，通过高效液相色谱仪测定聚合物胶束中紫杉醇的含量。依公式包封率EE % = W包/ W药 ×100 %。 (4) 临界胶束浓度（CMC）测定

用芘（pyrene）作为荧光探针测量其临界胶束浓度。按上述2.2.2.2方法制备1 mg/mL空白胶束，并用PBS依次稀释成0.5 mg/mL，0.25 mg/mL，0.1 mg/mL， 0.05 mg/mL，0.025 mg/mL，5×10-3 mg/mL，1×10-3 mg/mL，0.25×10-3 mg/mL，0.05×10-3 mg/mL 的溶液。精确称取1 mg芘，用丙酮定容于100 mL容量瓶中配制成浓度为10 µg/mL的芘的丙酮溶液, 取10个洁净的10mL小瓶，每瓶中精确加入芘的丙酮溶液25 µL，锡纸避光，40 ℃水浴30 min使丙酮完全挥发。取上述不同稀释度的溶液各2 mL加入小瓶中，使每一溶液中芘的终浓度均为6×10-7 mol/L，常温下避光磁力搅拌24 h，固定发射波长393 nm，荧光分光光度计测定激发波长在333 nm和338 nm处的荧光强度，分别记为I333和I338，以聚合物浓度的对数值为横坐标，I338/I333值为纵坐标作图。通过倾斜部分与水平部分曲线的切线的交点来测定其大小。

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2.3 结果与讨论

2.3.1 傅利叶红外（FT-IR）光谱

Figure 2.1 FT-IR spectra of MePEG-PLA polymer

MePEG-PLA的红外图谱反映出：1191 cm-1处的峰是酯基C-O伸缩振动峰，证明嵌段共聚物中-COO-基团的存在，证明发生了聚合反应；1114 cm-1处出现了一个较大的峰，这是MePEG的醚键C-O-C伸缩振动峰；3000～2800 cm-1之间的峰是甲基和亚甲基的C-H伸缩振动峰；1468 cm-1处的峰代表亚甲基的C-H弯曲振动；1500～1350 在3510 cm-1处的弱吸收峰是羟基的吸收峰，由于只有聚乳酸段的cm-1是甲基特征峰；

端基是羟基，所以显示的峰较弱。从该FT-IR图可以证实该聚合物基本上符合理论上的结构。

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2.3.2 核磁共振谱（1H-NMR）分析

1086420-2

ppm

Figure 2.2 1H NMR spectra of MePEG-PLA polymer

δ= 1.52～1.60 ppm处的峰是PLA的-CH3 质子的化学位移峰；δ = 3.36 ppm是MePEG 的-OCH3质子的化学位移峰；δ = 3.60～3.67 ppm是MePEG的-CH2质子的化学位移峰；δ = 5.14～5.22 ppm为PLA 的-CH质子的化学位移峰；而δ = 4.3～4.4 ppm是连接MePEG 和PLA 的-COOCH2的质子的化学位移峰，表明MePEG 与丙交酯发生反应形成了嵌段共聚物MePEG-PLA；δ = 7.3 ppm处的峰是溶剂环境引起的，而且从图形中可看出产物纯度较高。

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2.3.3凝胶渗透色谱仪（GPC）分析

Figure 2.3 GPC result of MePEG-PLA polymer

图 2.3是MePEG-PLA嵌段聚合物的GPC谱图，从图中可以看出，只存在一个洗脱峰，证明了合成的聚合物是MePEG-PLA嵌段聚合物而不是MePEG和PLA形成的混合物。由GPC图的洗脱时间，通过标准曲线计算知：Mw＝11659，Mn＝9674，与理论一致。

2.3.4聚合物胶束的粒径及分布的测定

Statistics Graph (1 measurements)1210Intensity (%)86420110100Diameter (nm)100010000（A）

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Statistics Graph (1 measurements)15Intensity (%)1050110100Diameter (nm)100010000(B) Statistics Graph (1 measurements)20Intensity (%)151050110100Diameter (nm)100010000 (C) Statistics Graph (1 measurements)40Intensity (%)3020100110100Diameter (nm)100010000 (D) Figure2.4 Representative dynamic light scattering spectrum of (A): Nile Red-loaded micelle prepared by film formation method and the Nile Red is 100 ng/mL. (B): PTX-loaded micelle prepared by film formation method and the PTX is 100μg/mL. (C): Nile Red-loaded micelle prepared by co-solvent evaporation method.The concentration of Nile Red is the same as (A). (D): PTX-loaded micelle prepared by co-solvent evaporation method .The concentration of PTX is the same as (B).

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图2.4 为用成膜法和自乳化溶剂挥发法制备的载紫杉醇和载尼罗红胶束的粒径分布图，从图中可以看出，用成膜法制备的胶束粒径比较大且分布不均一，其中载尼罗红胶束的平均粒径为104.1 nm，多分散性指数PDI为0.238，载紫杉醇胶束的平均粒径为288.3 nm，PDI为0.56。而用自乳化溶剂挥发法制备的胶束粒径分布窄，分散性好。其中载尼罗红胶束的平均粒径为40.3 nm，PDI为0.134，载紫杉醇胶束的平均粒径为27.8 nm，PDI为0.190。 2.3.5聚合物胶束的形貌表征

（A） （B） （C）

Figure 2.5 Transmission electron microscope image of (A): Empty MePEG-PLA micelle; (B, C):

Paclitaxel loaded MePEG-PLA micelle through film formation method.

(A) (B) (C)

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(D) (E) (F)

(G) (H) (I)

Figure 2.6 .Transmission electron microscope image of (A,B,C): Empty MePEG-PLA micelle; (D,E,F):

Nile Red loaded MePEG-PLA micelle; (G,H,I): Paclitaxel loaded MePEG-PLA micelle through

co-solvent evaporation method. The samples are stained with 1% uranyl acetate.

Statistics Graph (1 measurements)2520Intensity (%)151050110100Diameter (nm)100010000 （A）

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Statistics Graph (1 measurements)20Intensity (%)151050110100Diameter (nm)100010000 (B)

Statistics Graph (1 measurements)2520Intensity (%)151050110100Diameter (nm)100010000 (C)

Figure 2.7 The dynamic light scattering spectrum of (A):Empty micelle, (B): Nile Red-loaded micelle

（C）:PTX-loaded micelle. The samples are the same as Figure2.6.

用透射电镜对成膜法和自乳化-溶剂蒸发法制备的聚合物胶束进行了表征。图2.5 (A)为空白胶束（,B）为成膜法制备的载紫杉醇的聚合物胶束,与图2.6 中（G）、（H）、(I) 用自乳化-溶剂蒸发法制备的聚合物胶束相比粒径明显偏大，且不均一。原因可能是因为混合物薄膜（聚合物+药物）重新分散在水相介质中分散的不均匀，从而导致大小不一。而自乳化溶剂蒸发法是随着有机溶剂的挥发，内核固化成球，从而形成聚合物胶束。从图2.6 中可以看出，用自乳化-溶剂挥发法制备的载尼罗红和载紫杉醇的聚合物胶束均为球形，粒径在50 nm左右（与用激光粒度仪测出来的结果一致,见图2.7），且可以看到核壳结构。

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2.3.6 包封率试验

由2.3.4和2.3.5可知，自乳化溶剂蒸发法制备的聚合物胶束粒径在50 nm左右，分散性好，而成膜法制备的聚合物胶束粒径偏大且分散性不好，为了进一步比较这两种方法，本研究测定了这两种方法制备的载紫杉醇胶束的包封率。经计算成膜法制备的聚合物胶束包封率为26.51%，而经溶剂挥发法制备的载紫杉醇聚合物胶束的包封率为4.23%，前者约为后者的6.27倍。分析其原因，可能是因为自乳化蒸发法制备，内核固化成球时，有一大部分紫杉醇析出来，经过滤除掉了。综上所述，尽管自乳化溶剂蒸发法的包封率低于成膜法，但是其粒径在25~50 nm之间，最有利于进细胞膜，且临床上用抗肿瘤药物剂量也比较低。因此选用自乳化溶剂挥发法制备载药胶束。

2.3.7 临界胶束浓度（CMC）

芘是一种有效的研究两亲性共聚物体系胶束化行为的荧光探针。芘对环境的极性非常敏感，在胶束化过程中，芘的荧光光谱和荧光寿命经常伴随着一些显著的变化。如图2.7（A）、（B）所示，在芘的浓度固定为6×10-7 mol/L的浓度下，随着聚合物浓度的增加，芘的发射光谱和激发光谱均显著增加，而且其激发光谱的最高峰有一个小的红移。通过对激发光谱中激发峰强度之比I338/I333对共聚物浓度的对数值作图得到一条如图2.6的S形曲线，以低浓度区域的水平切线和中间浓度区域曲线的切线交于一点，对应的聚合物浓度即为该胶束体系的临界胶束浓度，为1.5 mg/L。

28

1.3

1.2

1.1

I338/I3331.0

0.9

0.8

0.7

0.6

-2-10123LogC(mg/L)

Figure2.8. Intensity ration plots of I338/I333 versus logC for MePEG-PLA.

0.000010.000050.0050.010.0250.050.10.250.51mg/ml

Fluorescene Intensity(a.u.)2000150010005000350370390410430450Emission spectra of pyrene(nm)（A）

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Fluorescene Intensity(a.u.)2000150010000.000010.000050.0050.0010.0250.050.10.250.51mg/ml5000300320340360380

Exciation spectra of Pyrene(nm)(B)

Figure 2.9.(A) Emission spectra of pyrene (6.0×10-7 mol/L) in water in the presence of increasing concentratons of MePEG-PLA and (B) Excitation spectra for the same sample showing the shift from

333 to 338 nm as pyrene partitions between aqueous and micellar environments.

2.4 本章小结

本章通过FT-IR、1H-NMR、GPC等手段对聚合物进行了表征。以芘为探针测得该聚合物的临界胶束浓度为1.5 mg/L。本章节比较了成膜法和自乳化溶剂蒸发法制备载紫杉醇的聚合物的粒径、形态及包封率，结果显示自乳化溶剂蒸发法制备的载紫杉醇的聚合物胶束粒径为27±3 nm，分布均匀，呈球形，包封率为4.23%。因此选用自乳化法制备聚合物胶束体系。通过该方法制备的荧光标记的聚合物胶束平均粒径为40±4 nm，呈球形。

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3 载紫杉醇MePEG-PLA 聚合物胶束的体外释药及

细胞毒性研究

3.1 引言

紫杉醇是一种重要的植物来源的抗癌药物，它能抑制肿瘤细胞的分化、新血管的形成及肿瘤转移，对多种癌症有十分明显的治疗作用。但是，现有的紫杉醇制剂以聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）为助溶剂，与无水乙醇按1：1体积比混合得到紫杉醇制剂，浓度为6 mg/mL，使用时用0.9% 的生理盐水或5%的葡萄糖溶液稀释到最终的给药浓度。在正常治疗剂量下，制剂中高浓度的聚氧乙烯蓖麻油往往引起诸多较为严重的毒副作用，如过敏反应、肾脏毒性、神经毒性、心脏毒性等。因此解决紫杉醇的水溶性问题及制剂的毒副作用问题一直是国内外研究人员关注的热点

[88]

。

本章对紫杉醇的聚合物胶束体外释放药物特性进行了初步的研究，并比较了游

离紫杉醇与紫杉醇的聚合物胶束体系的体外细胞毒性。

3.2 实验部分

3.2.1 实验仪器及试剂 3.2.1.1 主要仪器 智能溶出试验仪 细胞培养箱 超净工作台 酶标仪 荧光倒置显微镜

其余仪器同2.2.1.1中主要仪器。

天津大学无线电厂

德国New Brunswick Scientific公司 苏州安泰空气技术有限公司 美国PerkinElmer公司 日本Olympus 公司

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