基因敲除方法及其应用

文章编号:10052376X(2009)0220181204

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【综　　述】

基因敲除方法及其应用

贺松,张德纯

(重庆医科大学病原生物学教研室,重庆　400016)

【关键词】　基因敲除;基因打靶;同源重组;RNA干扰

【中图分类号】Q781　　　　【文献标识码】A

　　基因(gene)是核酸分子中储存信息的遗传单

位,是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。基因敲除(Geneknockout)是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。

基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家CAPECCHI和OLIVERSMITHIES、英国科学家EV2ANS因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳

动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ESC分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的技术基础和理论基础,是进行基因敲除研究不可替代的材料。

基因打靶的主要步骤包括:(1)重组基因载体的构建:把目的基因和细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上,此重组

载体即为基因打靶载体,载体要包括外源目的基因、同源基因片段及标记基因;(2)导入受体细胞:用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内;(3)筛选:用选择性培养基筛选已击中的细胞;(4)检测:观察被击中细胞的生物学特征,将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长,对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。基因打靶技术进行基因敲除目前使用相当广泛,根据其作用方式不同可分为:条件性基因敲除法、诱导性基因敲除法、基因捕获技术基因敲除法等,这些方法都是建立在DNA基因同源重组技术原理基础之上的,现分别展开叙述。1.1　条件性基因敲除法　条件性基因敲除法是指将某个基因的修饰于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上,利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术,在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可的“按钮”,从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。自从1994年GU等的第一例应用Cre2LoxP系统研制的组织特异性基因敲除小鼠问世以来,条件基因敲除技术迅速取代了传统的完全基因敲除成为主流

[2]

饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学

或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。本文就基因打靶技术和RNA干扰技术两个方面综述了基因敲除的方法及其应用。1　基因打靶技术

基因打靶技术(genetargeting)是指基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA序列发生重组的性质,来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术,又称为同源重组技术。胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESC)是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系,体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖,在发育上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞,具有与早期胚胎细胞相似

【收稿日期】2008205220

【作者简介】贺松(19822),男,硕士在读,从事基因工程菌的构建及其

应用的研究,Email:jarm190@163.com;张德纯,通讯作者,Email:zhangdechun46@sohu.com

[1]

。

条件基因敲除技术利用Cre2LoxP和FLP2FRT位点特异性重组酶系统使得时空特异性基因敲除变为

现实。在特定阶段特定组织或细胞中表达Cre或FLP重组酶的转基因小鼠通过与在基因组中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配,可导致子代鼠中特定

组织或细胞中的靶基因被删除。基于Cre2LoxP系统的第二代小鼠模型可以克服重要功能基因敲除所导致的早期致死表型,模拟人类疾病相关的体细胞突变,并对突变进行时空上的,提供了激动人心的新机会研究已知或者未知基因的在疾病的起始、发生

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和治疗过程中的作用及其机制。近几年来,利用细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs)构建的Cre转基因载体通过受精卵注射得到了许多与内源性基因表达谱相似的Cre转基因小鼠。2007年

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Xu等将两种不同细胞特异性的Cre基因部分缺失的转基因小鼠交配得到了恢复Cre重组酶活性的子代小鼠,从而对Cre在特定细胞中的表达达到了“双重”。在构建转基因载体时,如果同时将Cre基因置于配体或药物可诱导的启动子控制下,就可同时实现在时间和空间水平上对Cre表达的精确。近几年来研究者利用各种诱导系统结合细胞特异性启动子构建了多种在时空水平上可的Cre转基因小鼠,为揭示靶基因在特定阶段特定细胞中的功能

[4]

提供了强为有力的工具。除了利用Cre转基因小鼠,还可通过感染具有自我剪切功能的表达重组酶的逆转录病毒和慢病毒以及直接注射可透膜的Cre重组酶蛋白而实现重组,同时可以减少Cre重组酶的细

[5]

胞毒性。

近年来,研究者利用组织特异性基因敲除技术揭示了某些基因在组织器官发育、生理过程以及疾病发生中的重要功能。国内一些研究者也自主研制成功了1O余种组织特异性Cre重组酶转基因小鼠以及系列组织特异性条件基因敲除小鼠,通过对突变小鼠的表型分析,系统地揭示了Smad4基因在组织器官发育和稳态维持以及相关疾病发生过程中的作用和[6]

机制。

1.2　诱导性基因敲除法　诱导性基因敲除法也是以Cre/Loxp系统为基础,利用控制Cre表达的启动子的

上,Cre介导两个同向排列LoxP之间的DNA的缺失

反应。如果两个LoxP位点呈反向排列,Cre则诱发倒位反应。当LoxP存在于不同的DNA分子上时,Cre则介导缺失、重复、插入及易位等反应。LoxP转基因动物是用常规基因打靶技术构建的,基因组中待修饰区域的两端各携带有1个LoxP位点的转基因动物。构建该转基因动物的目的是为Cre介导的重组反应提供作用底物。诱导系统是指其所携带的Cre基因的表达,或所表达的Cre的酶活性具有可诱导特性的转基因动物,或Cre基固可定位表达的基因转移系统等。对Cre基因的表达具有可诱导特眭的转基因动物来说,其控制Cre表达的启动子的活性具有可诱导性,即Cre基因平时并不表达,只有当诱导剂存在时,控制Cre基因表达的启动子才有转录活性,Cre才会表达。在Cre的酶活性具有可诱导特性的转基因动物体内,其Cre基因事先已经过了改造,虽然该酶可组成性地表达,但它却没有介导重组反应的酶活性,只有当诱导剂存在时,Cre的酶活性才能被激活。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制,以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性打靶类型如下:四环素诱导型;干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。

诱导性基因敲除方法的优点有:(1)诱导基因突变的时间可人为控制;(2)可避免因基因突变而致死胎的问题;(3)在2个LoxP位点之间的重组率较高;(4)如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达,则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程;(5)如果在Cre2ERT和Ad2Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达,其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。1.3　基因捕获技术　基因捕获技术敲除基因的方法

活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点,通过

对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性,从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。

诱导性基因敲除法主要有Cre/LoxP系统和诱导系统两个部分组成。Cre/LoxP系统由源于大肠埃希菌噬菌体Pl的位点特异性重组酶Cre和其特定的识别和作用位点LoxP组成。其中Cre由343个氨基酸组成、分子量约38kD。其特定的作用位点LoxP为34bp的DNA序列:由8bp非对称的核心序列和两端各l3bp的反向重复序列构成:5′2ATAACTTCG2TATAATGTATGCTATACGAAGTTAT23′。Cre的特定

酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是

将一含报告基因的DNA载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因。

基因捕获技术是大规模随机基因敲除技术的方法之一。研究者利用位点特异性重组酶系统对传统的基因诱捕策略进行了改进使条件性的基因诱捕成为可能。在小鼠ES细胞中进行ENU诱变可以在ES

作用位点LoxP的位置也极富变化,可以位于相同或不同的染色体或DNA分子上,LoxP之间既可同向排列,也可反向存在。重组反应的形式究竟是缺失、插入、重复、倒位或易位中的哪一种,由两个LoxP在DNA分子上的相对位置来决定。在同一DNA分子

中国微生态学杂志　2009年2月第21卷第2期细胞中直接进行突变基因的筛选,使ENU诱变技术同样适合于基因驱动的研究。而通过在cDNA样品库中检测特定基因的剪接突变,使在ES细胞水平上进行基因突变的筛选更加方便、有效。近几年来,研究者成功地将不同的转座子系统应用到小鼠中,为大规模地研制基因突变小鼠以及构建新的疾病模型提供了崭新的途径。在转座子系统基础上,同时结合不同的诱导系统可以对基因突变实现时空水平上的调[7]

控。最近,利用位点特异性重组酶系统和转座子系统的一种新的基因诱捕策略为在小鼠基因组范围内大规模地进行基因突变提供了一种更方便、快捷的

[8]

方法。

根据报告基因在载体中的位置及报告基因激活表达的方式,基因捕获分为3种类型:(1)通过增强子捕获载体(enhancer2trapping)整合到顺式增强子元件附近报告基因的表达;(2)通过启动子捕获(promoter2trapping)载体体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本并表达报告基因;(3)基因捕获载体中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体(sp1iceacceptor,SA)和多聚腺苷酸加尾序列(polyA),当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中SA与内源基因剪接供体(splicedonor,SD)作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本,使内源基因发生突变,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。

基因捕获载体在基因组中也有“hot”和“cold”插入位点。但是计算机模拟显示,按照单个克隆被捕获的百分比,如果以多种类型的载体进行足够多次的突变实验所获得的突变克隆就可以覆盖整个ES细胞基因组中全部基因位点。因此,新型捕获策略和载体不断被设计应用。基因捕获插入能提供三类数据作为突变筛选的依据———基因功能、表达模式及序列信息。而检测突变策略的最重要指标是诱变率。所有插入型诱变因素,包括以基因打靶方式导入基因组的载体,都有一定比率的插入而不产生突变或产生减效等位基因型突变(hypomorphicmutations)。越来越多成功事例的出现证明基因捕获是一种富有成效的研究方法,能为阐释哺乳动物基因组提供相当多的功能学数据。如Ff1基因捕获识别鉴定的新基因可直接从表型角度分析其功能,常可以确定其所在的分子通路;利用基因捕获的方法还可以捕获确定某一分子通路成员;最后,基因捕获对于那些不能通过同源重组产生突变的模式生物研究有深远的意义。1.4　其他基因打靶技术敲除基因的方法　基因打靶技术敲除基因的方法除了上述的三种方法外,还有其他很多也基于DNA同源重组技术原理的基因敲除方法,如基因插入突变技术、基因缺失技术、自杀质粒构建技术等,也被一些研究者们所重视。2　RNA干扰技术

RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)是指通

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过利用短片段的双链RNA促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断特定基因的表达,诱使细胞表现出特定基因沉默的表型。该系统能被siRNA的直接途径或非病毒载体和病毒载体shRNA的表达在体内外有效诱发。到目前为止,RNAi技术作为基因沉默的一个工具,被研究人员广泛应用到包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析、疾病

[9]

治疗等研究领域。与传统的基因敲除技术相比,RNAi技术具有投入少,周期短,操作简单等优势。

[10]

RNAi阻断基因表达的机理:双链RNA进入细胞后,一方面能够在Dicer酶的作用下被裂解成小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),而另一方面双链RNA还能在RdRP(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶,RNA2directedRNApotyraerase,RdRP)的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链,并与某些蛋白形成复合物,Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以siRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。从21～23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

近些年来,RNAi技术成为基因敲除的热点,应用相当广泛。例如,将针对M2BCR/ABL融合基因设计合成的dsRNA转染慢性髓细胞白血病K562细胞系,结果发现mRNA的转录和BCR/ABI癌蛋白的表达减少,基因被敲除,引起强烈的细胞凋亡反应;利用RNAi技术抑制白血病细胞多药耐药基因表达,结果显示不仅肿瘤细胞耐药被逆转,而且还发现前列腺素E的合成和释放减少,提示白血病细胞多药耐药基因不仅具有降低细胞内药物浓度抵抗药物杀伤作用,而且还可能参与了前列腺素E等体内化学递质的代谢,在自血病细胞的其他生物学行为中发挥作用;针对形成胶质瘤的关键因子表皮生长因子受体独特的外显子1及S交接序列设计的siRNA可有效地抑制人胶质母细胞瘤系的表皮生长因子表达,并且发现siRNA介导的表皮生长因子受体缺失可明显引起胶质瘤AKT磷酸化水平下降及P13K的抑制,细胞凋亡

[11][12]

增加,细胞周期G22M期阻滞。陈功星等为了研究特异siRNA作用于大肠癌细胞株SW480中PLK1(Polo21ikekinase1)基因表达的mRNA对该细胞生长的影响,设计了对应于PLK1基因表达mRNA不同位点的10种特异siRNA,经化学合成后,用脂质体转染SW480细胞,实时定量PCR检测PLK1

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基因的表达,观察不同的siRNA作用强度,并计数细胞了解相应细胞的生长情况,Western2blot观察PLK1表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。发现10种siRNA均可敲除PLK1基因表达的20%以上,其中P1、P4和P93组敲除mRNA达80%以上,这3种siRNA及其混合物对PLK1基因mRNA的作用具有相应浓度效应,在25nmol/L时达到最佳作用效果,而且相同浓度的混合物作用效果更好(超过95%),PLK1表达蛋白质明显降低,细胞周期在G2期受到阻碍。72h后的各种siRNA浓度下细胞生长变化与PLK1基因的mRNA水平变化相一致。结果表明化学合成的特异siRNA对SW480细胞中PLK1基因表达具有消除作用,混合物作用更强,在细胞水

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平上抑制了SW480细胞的生长。范钰等根据STAT3基因特点,设计合成STAT3siRNA,并转染人结肠癌细胞系HCT116后,采用RT2PCR检测STAT3mRNA,采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭能力,结果表明STAT3siRNA可有效抑制结肠癌细胞集落生长和侵袭能力。

运用RNAi技术来诱导基因表达的沉默是一种制备基因功能缺失表型的有效的新方法。将RNAi技术用于基因敲除有其很大的优点:(1)比同源重组法更加简便,周期大大缩短;(2)能够快速而简单地制备某个功能缺失表型;(3)RNAi技术也已经可以通过shRNA表达盒子能够在细胞中像在动物模型中一样产生有效的、稳定的和可调节的基因沉默作用;(4)对于哺乳动物,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能;(5)由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达,它成为研究信号传导通路的良好工具;(6)RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。3　基因敲除技术的应用前景

随着功能基因组学的兴起和发展,基因敲除技术被人们广泛的用于探讨基因功能的研究,通过基因敲除技术逐渐明确了大量模式生物和重要功能微生物的全基因组,并能准确定位功能基因,从基因水平上更加清楚的认识微生物的代谢规律。同时,敲除载体及相关技术的完善可进一步推动微生物代谢工程的广泛应用,通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向,阻断有害代谢产物积累,可望降低成本,大幅度提高生产水平及产品纯度。

近10多年来,由于抗生素的滥用,细菌耐药率有增长趋势,耐药菌株也逐渐增多,解决细菌耐药性问题已经成为当务之急,选择合理有效的抗生素已经成为目前医学界的难题,研究致病菌的耐药机制以及研发新型抗菌药物更是迫在眉睫。从功能基因组学的

角度来研究细菌的耐药基因,并采用基因打靶技术和RNAi技术对细菌耐药机制进行探讨,以便研制抑制细菌耐药、增强抗菌药物疗效和开发新的抗菌药物,以及研制和开发具有预防和治疗作用的功能性食品。

在肿瘤的化疗治疗过程中,肿瘤细胞在接触化疗药物后对某一药物耐药,往往对其他结构、机制上相似或相异的多种药物产生耐药,即肿瘤多药耐药现象。肿瘤的多药耐药是导致化疗的失败主要原因,也是肿瘤化疗急需解决的难题。运用RNAi技术诱导肿瘤耐药基因同源基因转录后沉默,丧失其耐药功能;或运用基因打靶技术直接敲除肿瘤耐药基因,或致使肿瘤耐药基因突变,从而可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。也可采用基因敲除技术敲除肿瘤细胞关键性基因或致使肿瘤细胞关键性基因发生突变,抑制肿瘤细胞生长,或者诱导肿瘤细胞凋亡,用于肿瘤的基础研究和临床治疗。

另外,基因敲除技术还可运用于基因结构与功能研究、细胞生活周期机制研究、食品发酵工程基因工程菌的研究、无毒活体疫苗的制备研究以及遗传病的基因治疗等诸多方面。可见,基因敲除技术具有非常好的应用前景和广阔的发展空间。

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