脐血CD34 +细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

上海交通大学学报（医学版）　５ｌ６　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．５　Ｍａｙ　２００７　文章编号：０２５８—５８９８（２００７）０５—０５１６—０４　基础研究・　脐血ＣＤ３４＋细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增　陈雪华。　黎　皓。　俞焙秦。　郑　重。　柯　山。　朱正纲。　顾琴龙。　刘炳亚　（上海交通大学医学院瑞金医院外科上海消化外科研究所，上海２０００２５）　摘　要：目的探索脐血ＣＤ３４　细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞（ＤＣｓ）的方法。方法Ｆｉｃｏｌ１分　离脐血单个核细胞，免疫微磁珠法分离纯化ＣＤ３４　细胞，以ｒｈｌＬ－４、ＧＭ．ＣＳＦ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｈ．３　Ｌｉｇａｎｄ、ＴＧＦ．ｐ，及ＴＮＦ．ａ体外诱导培　养１４　ｄ，进行形态学观察、表型检测及上清液ＩＬ．１２测定。结果体外培养１４　ｄ后，细胞呈现典型的成熟ＤＣｓ形态学及表型特征：　胞体表面粗糙，可见大量突起，高水平表达ＣＤ１ａ、ＣＤ１１　ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６和ＭＨＣ　Ｉ１类分子；同时，ＩＬ．１２浓度随着培养　时间的增加而升高，且在加入ＴＮＦ－ｄ刺激成熟后，ＩＬ．１２浓度较未成熟时显著升高（Ｐ＜０．０５）。结论体外联合运用ｒｈｌＬ－４、ＧＭ．　ＣＳＦ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｈ－３Ｌｉｇａｎｄ、ＴＧＦ－３１１、ＴＮＦ－ｄ，能够成功诱导脐血ＣＤ３４　细胞分化为大量活力好的ＤＣｓ。　关键词：树突状细胞；脐血；ＣＤ３４；诱导；扩增　中图分类号：Ｑ８１３　文献标志码：Ａ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｆｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＣＨＥＮ　Ｘｕｅ—ｈｕａ，ＬＩ　ＨａＤ，Ｙｕ　Ｂｅｉ－ｑｉｎ，ＺＨＥＮＧ　Ｚｈｏｎｇ，ＫＥ　Ｓｈａｎ，ＺＨＵ　Ｚｈｅｎｇ－ｇａｎｇ，ＧＵ　Ｑｉｎ—ｌｏｎｇ，ＬＩＵ　Ｂｉｎｇ－ｙａ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｄ噜ｅｓｔｉｖｅ　ＳｕｒｇｅＤ＂，Ｒｕｉｊｉｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２５，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｏｒｅ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｉｃｏｌ１．ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＭＡＣＳ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｒｈｌＬ－４，ＧＭ－ＣＳＦ，ｒｈＳＣＦ，ｒｈＦｈ－３　Ｌｉｇ－　ａｎｄ，ＴＧＦ－ｐｌ　ａｎｄ　ＴＮＦ－ｄ．Ａｆｔｅｒ　１４　ｄ　ｏｆ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｔｈｅ　ｐｈｏｎｏｔｙｐｅ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＩＬ－１２　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＤＣｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｈｏｎｏｔｙｐｅ　ａｆｔｅｒ　１４　ｄ．Ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｒｏｕｇｈ　ｗｉｔｈ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，ａｎｄ　ＣＤ１　ａ，ＣＤ１　１　ｃ，ＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８３，ＣＤ８６　ａｎｄ　ＭＨＣ　Ｉ１　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＬ－１２　ｒｉｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｍａｔｕｒｅ　ｓｔａｔｅ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌ－　ｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ＴＮＦ－ｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｓｔａｔｅ（Ｐ＜０．０５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａ－　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｒｈｌＬ－４，ＧＭ－ＣＳＦ，ｒｈＳＣＦ，ｒｈＦｌｔ一３Ｌｉｇａｎｄ，ＴＧＦ—Ｂ１　ａｎｄ　ＴＮＦ－ｄ　ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ；　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ；　ＣＤ３４；　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ，ＤＣｓ）是目前所知功　研究采用脐血微磁珠法分离纯化ＣＤ３４　细胞，探索　体外细胞因子诱导分化和培养大量ＤＣｓ的方法，为　今后ＤＣｓ在临床上的应用提供实验基础。　１材料与方法　１．１　材料　能最强大的专职抗原递呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ，ＡＰＣ），也是唯一能够激活未致敏Ｔ细胞的细胞，　它在发起和放大天然和获得性免疫应答方面发挥着　至关重要的作用　。更有研究　表明脐血来源　的ＤＣｓ本身就能杀伤肿瘤细胞，因而无论是在机体　免疫机制的研究还是应用于免疫治疗，ＤＣｓ一直是研　究的热点，特别是它在肿瘤免疫中的重要地位越来　越受到重视　。　。如何获得大量的活力好的ＤＣｓ也　就成为研究的关键。如今，比较多的研究者采用外　１．１．１脐血：新鲜脐血３０～４０　ｍＬ，来源于上海交通　大学医学院附属国际妇婴保健院顺产后６　ｈ内的孕　妇，每份脐血中加入浓度为２５　Ｕ／ｍＬ的肝素钠ＰＢＳ　溶液５　ｍＬ进行抗凝处理。　周血单个核细胞体外诱导分化的方法培养ＤＣｓ　，　其优点是标本来源充足，培养步骤简单、经济，但是，　最终收获的ＤＣｓ数量较少且活力和纯度都不高。本　１．１．２　主要试剂：Ｆｉｃｏｌｌ淋巴细胞分离液（上海华精　生物高科技有限公司，上海）；ｄｉｒｅｃｔ　ＣＤ３４　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｈｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，德国）；胎牛血清（杭　基金项目：国家自然科学基金（３Ｏｌ７Ｏ９ｌ５、３０５７０８２８、３０６７０９３９）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，３０１７０９１５，３０５７０８２８，３０６７０９３９）。　作者简介：陈雪华（１９５６一），女，上海人，副主任技师；电子信箱：ｘｈｃｈｅｎｓｈ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃａ。　通讯作者：刘炳亚，电子信箱：Ｌｉｕｂｙｏ＠ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ．ｅｌｌ。　维普资讯 http://www.cqvip.com

陈雪华，等：脐血ＣＤ３４　细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增　州四季青生物工程材料有限公司，杭州）；ＩＭＤＭ培养　液（吉诺生物医药技术有限公司，上海）；Ｈｕｍａｎ　ＩＬ一　１　２／ＩＬ一２３　ｐ４０　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　镀膜，扫描电镜观察。②透射电镜观察：收集培养第　１４　ｄ的ＤＣｓ，ＰＢＳ洗涤后，加入２．５％戊二醛磷酸缓　冲液固定２　ｈ，漂洗，再加入１％锇酸固定１　ｈ。漂洗，　乙醇梯度脱水，环氧丙烷浸透３０　ｍｉｎ，包埋剂浸透过　夜，６０℃加温聚合２４～３６　ｈ，５００　ｎｍ半薄切片定位。　再超薄切片成５０　ｎｍ。醋酸铀和枸橼酸铅双重电子染　Ｉｎｃ．公司，美国）；荧光单抗：ＣＤ１　ａ—ＦＩＴＣ、ＣＤ１１　ｃ—ＰＥ、　ＣＤ４０一ＦＩＴＣ、ＣＤ８０一ＦＩＴＣ、ＣＤ８３一ＦＩＴＣ、ＣＤ８６一ＦＩＴＣ、　ＨＬＡ—ＤＲ—ＣＹ５（ＢＤ　ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司，美国）；细胞因　子：ｒｈＩＬ－４、ＴＮＦ—ｄ、ＧＭ．ＣＳＦ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｉｔ．３　Ｌｉｇａｎｄ、　ＴＧＦ－１３１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．公司，美国）。　１．２　方法　１．２．１　脐血ＣＤ３４　细胞的分选：新鲜抗凝脐血经　０．５％ＢＳＡ—ＰＢＳ－ＥＤＴＡ缓冲液按１：３稀释后，用等体　积的Ｆｉｃｏｌｌ淋巴细胞分离液密度梯度离心分离脐血　单个核细胞，并用２．５％冰醋酸溶液计数。根据单　个核细胞计数结果，每１×１０　个单个核细胞加入　０．１　ｍＬ　ＦｃＲ封闭试剂。轻柔混匀，再加入０．１　ｍＬ　ＣＤ３４　微磁珠，轻柔混匀，４　ｏＣ孵育３０　ｍｉｎ，采用Ｍｉｄｉ　ＭＡＣｓ磁珠分选仪（Ｍｉｌｉｅｎｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公司，德国），经磁　性细胞分离柱分选，收集ＣＤ３４　细胞，并用２％锥蓝　蓝染液计数。　１．２．２　ＣＤ３４　细胞诱导分化ＤＣｓ：ＤＣｓ培养液的配　制：在１５％ＦＢＳ．ＩＭＤＭ培养液中，加入适量细胞因　子，终浓度为ｒｈｌＬ－４　５０　ｎｇ／ｍＬ、ＧＭ－ＣＳＦ　１００　ｎｇ／ｍＬ、　ｒｈＳＣＦ　１００　ｎｇ／ｍＬ、ｒｈＦｌｔ一３　Ｌｉｇａｎｄ　１００　ｎｇ／ｍＬ、ＴＧＦ—ｐｌ　５　ｎｇ／ｍＬ。根据ＣＤ３４　细胞计数结果，加入适量培养　液，混匀，以每孑Ｌ　１×１０　／ｍＬ培养液为标准，将细胞　悬液均分入１２孑Ｌ培养板中，置３７℃，５％ＣＯ：培养箱　内培养１１　ｄ，采用ＤＣｓ培养液３—４　ｄ半量换液；培养　至第１２　ｄ，在ＤＣｓ培养液中加入ＴＮＦ—ｄ达到终浓度　５０　ｎｇ／ｍＬ。培养至第１４　ｄ。于培养的第６、９、１２、１４　ｄ，　收集细胞培养液上清，一８０℃保存，待测细胞因子。　１．２．３　细胞活力检测：收集培养的细胞，计数，加　ＰＢＳ缓冲液稀释至５×１０　／ｍＬ，混匀，制成细胞悬液。　取９滴细胞悬液移入小试管，加入０．４％锥蓝染液，　混匀。加入计数板，在３　ｍｉｎ内分别计数活细胞和死　细胞共２００个（死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒　染），根据公式计算细胞活力。活细胞率＝活细胞总　数／（活细胞总数＋死细胞总数）×１００％。　１．２．４　ＤＣｓ形态观察：倒置显微镜观察细胞生长情　况。①扫描电镜观察：收集培养至第１４　ｄ的ＤＣｓ，　ＰＢＳ洗涤后，加入０．５％戊二醛磷酸缓冲液，混匀成　细胞悬液，用０．１％多聚赖氨酸溶液包被载玻片，待　形成的多聚赖氨酸阳离子膜尚未干时将细胞悬液滴　加于膜上，静置２０　ｍｉｎ，再用１％戊二醛磷酸缓冲液　固定４℃１　ｈ，漂洗后１％锇酸固定１　ｈ，乙醇梯度脱　水，标本置于临界点干燥仪内完全干燥后，离子溅射　色，透射电镜观察。　１．２．５　ＤＣｓ表面分子表达测定：收集细胞，按１×　１０。个细胞加荧光标记单抗２０　Ｌ，在每个试管中加　入相应量的荧光标记单抗，４℃避光孵育３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ　洗涤，１　５００　ｒ／ｍｉｎ×５ｍｉｎ×２次，最后每管加入０．５％　甲醛ＰＢＳ溶液０．５　ｍＬ固定，流式细胞仪检测（ＦＡＣｓ，　ＢＤ，美国）。　１．２．６　ＤＣｓ培养液上清ＩＬ．１２定量测定：采用ＥＬＩＳＡ　方法。将收集的不同时间点的ＤＣｓ培养上清，按　ＥＬＩＳＡ操作说明书进行检测。　１．２．７　统计学处理：所有数据均以ｘ±ｓ表示，应用　ＳＰＳＳ　１３．０统计软件进行分析。未成熟组与诱导成熟　组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２　结　果　２．１　细胞形态学及活力　２．１×１０。～９．０×１０。个　ＣＤ３４　细胞经由ＣＤ３４　磁珠分选，从８．３×１０　一　４．１×１０　个脐带血单个核细胞中阳性分选出来，得率　为３．０３％±１．４％，略高于Ｒｏｓｅｎｚｗａｊｇ等　的报道。　将ＣＤ３４　细胞置于含ｒｈｌＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ一３　Ｌｉｇａｎｄ、ＴＧＦ—ｐ．的ＩＭＤＭ培养液中培养至第９　ｄ，细　胞总数达到最高，较培养之初扩增了约１８倍，第１２　ｄ　在培养液中加入ＴＮＦ—ｄ，刺激成熟。最终获得的成　熟ＤＣｓ较培养之初扩增了约９倍，ＣＤ１　ａ　ＤＣｓ纯度　为６２．２３％±１７．６８％。倒置显微镜观察细胞生长发　现，培养最初５　ｄ，细胞较小，呈圆形，无突起，散在分　布；以后细胞逐渐变大，并呈现出椭圆形、梭形、星形　或不规则形状，聚集成簇状生长；培养至第７～９　ｄ，　细胞数量增长最为明显，表面出现细胞突起；培养至　第１２　ｄ。培养液中加入ＴＮＦ－ｄ刺激ＤＣｓ成熟，４８　ｈ后　细胞数量有所减少，存留的细胞体积进一步增大，可　见明显的细胞突起（图１）。扫描电镜观察ＤＣｓ胞体　基本呈圆形或不规则梭形，胞体表面粗糙，可见大量　突起和皱褶，光镜可见的毛刺在电镜下更加清晰，向　四周弯曲伸展。透射电镜下可见胞体表面的突起直　接来自胞质，胞质中线粒体丰富，细胞活力好。另外　经锥蓝染色的细胞活力观察，活细胞均＞９０％。　２．２细胞表型收集第６、９、１２、１４　ｄ的细胞进行流　式细胞仪表型测定，在加入ＴＮＦ－ｄ刺激成熟前，细胞　维普资讯 http://www.cqvip.com

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Ｎｏ．５　陈雪华，等：脐血ＣＤ３４　细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增　Ｂｉｏｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００６，１２（８）：８５５—８６７．　５ｌ９　的分化并刺激ＤＣｓ成熟Ⅲ　。　通过对细胞形态学的观察以及各个阶段细胞表　型的检测和分析，显示脐带血造血干细胞体外培养、　诱导分化树突状细胞大致可以分为三个阶段：第一　阶段培养１～６　ｄ（细胞增殖阶段），细胞形态呈小圆　形，没有突起，细胞表型ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＣＤ４０等均呈低　［７］Ｇｕｏ　Ｇ，Ｃｈｅｎ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００５，２３（４５）：５２２５—５２３０．　［８］Ｎｅｎｃｉｏｎｉ　Ａ，Ｂｒｏｓｓａｒｔ　Ｐ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｔａｔｕｓ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２００４，２２（４）：５０１—５１３．　［９］Ｒｏｓｅｎｚｗａｊｇ　Ｍ，Ｃａｎｑｕｅ　Ｂ，Ｇｌｕｃｋｍａｎ　ＪＣ．Ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆ－　ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｒｏｍ　ＣＤ３４　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．　Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７（２）：５３５—５４４．　水平表达；第二阶段培养７～１１　ｄ（诱导分化阶段），　细胞形态呈不规则状，表面可见突起，细胞表型表达　水平较第一阶段明显提高，具有很强的摄取抗原能　［１Ｏ］Ｅｌｓａｓ　ＡＶ，Ｓｊｏｅｒｄ　Ｈ，Ｃａｒｏｌｉｅｎ　Ｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｕｌｓｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ－　力，适于基因的转染与抗原刺激；第三阶段培养加入　ＴＮＦ一仅后，刺激细胞成熟，ＣＤ１ａ和ＣＤ８３表达显著增　高，呈现典型的成熟ＤＣｓ的表型，另外共刺激分子　Ｂ７—１、Ｂ７—２、ＣＤ４０及黏附分子ＣＤ１１ｃ等也呈高水平　表达，具有很强的活化未致敏Ｔ和Ｂ淋巴细胞的功　能，适用于免疫治疗。　ＩＬ—ｌ２又称为细胞毒淋巴细胞成熟因子，是抗原　递呈细胞分泌的多效的细胞因子，可以刺激ＣＴＬ的　增殖和细胞因子的产生，并促进Ｔｈｌ亚型的发生　。　本研究在ＤＣｓ培养过程中，进行上清液中ＩＬ—ｌ２定量　检测，并与ＤＣｓ表型测定同步进行。上清中ＩＬ—ｌ２量　的增长与ＤＣｓ分化成熟的进程一致，且成熟阶段的　ＤＣｓ上清液中ＩＬ—ｌ２的量较未成熟阶段有显著差异。　ＩＬ—ｌ２量的变化也印证了ＤＣｓ诱导分化的成功。　上述实验结果表明，在适当的细胞因子配伍条　件下，脐血ＣＤ３４　细胞可在体外诱导分化为大量具　有典型形态、结构和功能的成熟ＤＣｓ，为用于实验研　究及临床应用提供了可能。　参考文献：　［１］Ｓｔｅｉｎｍａｎ　ＲＭ．Ｔｈｅ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｅｏｇｅ’　ｎｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，９：２７１—２９６．　［２］Ｃｅｌｉａ　Ｍ，Ｓａｌｌｕｓｔｏ　Ｆ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ　Ａ．Ｏｒｉｇｉｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉ－　ｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１９９７，９（１）：１０一ｌ６．　［３］Ｓｈｌ　Ｊ，Ｉｋｅｄａ　Ｋ，Ｆｕｊｉｉ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｃｏｒｄ　ｂｌ０ｏｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｋｉｌｌ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｄａｍａｇｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ，２００５，９６（２）：１２７—　１３３．　［４］Ｌｉｕ　Ｓ，Ｙｕ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＴＮＦ’ｑ　ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｉｐｔｏｓｉｓ．ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＩＦＮ’１３’ｓｔｉ－　ｍｕｌａｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，　１６６（９）：５４０７—５４ｌ５．　［５］　Ｊａｎｊｉｃ　ＢＭ，Ｌｕ　Ｇ，Ｐｉｍｅｎｏｖ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｎａｔｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｆｕｎｃｔｉ０ｎ　０ｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍａｒｕｒｅ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ．１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，１６８（４）：１８２３—　１８３０．　［６］Ｈｓｕ　ＡＫ，Ｋｅｒｒ　ＢＭ，Ｊｏｎｅｓ　ＫＬ，ｅｔ　ａ１．ＲＮＡ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｏｆｌｅｕｋｅｍｉｃ　ａｎｔｉ－　ｇｅｎｓ　ｉｎｔｏ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．　ｄｕｃｅ　ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｄｏｎｏｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｓｔａｂｌｅ　ＨＬＡ－Ａ０２０１－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１　ｓｅｌｆ　ａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，２６（８）：１６８３～１６８９．　［１　１］Ｈａｒｔ　ＤＮ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ：ｕｎｉｑｕｅ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９７，９０（９）：３２４５—　３２Ｒ７　［１２］　Ｃｒｅｓｐｏ　Ｉ，Ｐａｉｖａ　Ａ，Ｃｏｕｃｅｉｒｏ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎ０ｐｈｅｎ０ｔｙ　ｐｊｃ　ａｎｄ　ｆｕｎｃ－　ｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖ，２００４，１３（１）：６３—７０．　［１３］Ｃａｕｘ　Ｃ，Ｄｅｚｕｔｔｅｒ・Ｄａｍｂｕｙａｎｔ　Ｃ，Ｓｅｈｍｉｔｔ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．ＧＭ—ＣＳＦ　ａｎｄ　ＴＮＦ—　ａｌｐｈａ　ｃｏｏｐｅｒａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３６０（６４０１）：２５８—２６１．　［１４］Ｐａｌｕｃｋａ　ＫＡ，Ｔａｑｕｅｔ　Ｎ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｃｈａｐｕｉｓ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１９９８，１６０（９）：４５８７—４５９５．　［１５］Ｓｔｒｕｎｋ　Ｄ，Ｒａｐｐｅｒｓｂｅｒｇｅｒ　Ｋ，Ｅｇｇｅｒ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ／Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ＣＤ３４　ｈｅｍａｔｏ—　ｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７（４）：１２９２—１３０２．　［１６］　Ｓｚａｂｏｌｃｓ　Ｐ．Ｍｏｏｒｅ　ＭＡ，Ｙｏｕｎｇ　ＪＷ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎ０ｓｔｉｍｕｌａｔ０ｒｙ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｐｒｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃ—ｋｉｔ　ｌｉｇａｎｄ，ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ’ｍａｃｒｏ’　ｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ　ＴＮＦ—ａｌｐｈａ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　１９９５，１５４（１１）：５８５１—５８６１．　［１７］Ｓａｎｔｉａｇｏ．Ｓｃｈｗａｒｓ　Ｆ，Ｒａｐｐａ　ＤＡ，Ｌａｋｙ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ—ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉ—　ｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ．ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，１９９５，１３（２）：１８６—１９７．　［１８］Ｒｏｓｅｎｚｗａｊｇ　Ｍ，Ｃａｎｑｕｅ　Ｂ，Ｇｌｕｃｋｍａｎ　ＪＣ．Ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆ－　ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｒｏｍ　ＣＤ３４　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．　Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７（２）：５３５—５４４．　『ｌ９］Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ　Ｃ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｆｌｔ３　ｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌ　Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ），２００１，４９（６）：４８１—　４８３．　［２０］Ｆｉｓｈｅｒ　ＧＭ，Ｉｑｂａｌｌ　Ｓ，Ｋｎｉｇｈｔ　ＳＣ．Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ’　ｔｉ０ｎ　０ｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅ１１ｓ　ｆｒｏｍ　ｃｏｒｄ　ｂｌｏｏｄ　ＣＤ３４　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．１９９９，１１（２）：１１１—１１７．　［２１］Ｒｉｅｄｌ　Ｅ，Ｓｔｏｒｂｌ　Ｈ，Ｍａｊｄｉｃ　０，ｅｔ　ａ１．ＴＧＦ—ｂｅｔａ　１　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ａｐｏｐ’　ｔｏｓｉｓ『Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７，１５８（４）：１５９１—１５９７．　［２２］Ｃｈｅｎ　ｗ，Ｆｏｒｄ　ＭＳ，Ｙｏｕｎｇ　ＫＪ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｄｏｕｂｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐ０ｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１（５）：３２８—３３５．　收稿日期：２００６—１２—１２　本文编辑：周珠风