８８ ｑＡｃｔａ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｗｅｉｆａｎｇ Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．２ ２０１３ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＣＡＯ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ＢｒｄＵ ＧＦＡＰ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＭＣＡＯ ｇｒｏｕｐ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＯＮ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１ １．Ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ＢｒｄＵ ＧＦＡＰ ｃｅｌｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＰＢＳ ａｎｄ ＭＣＡＯ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．Ｌｅｓｓ Ｂｒ— ｄＵ ＧＦＡＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｒｏｕｐ ａｓｇ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＣＡＯ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．Ｏ１）．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｃｏｎｔａｃｔ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＭＣＡＯ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＣＯＮ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ａｎｄ ｔｈｅｒｅ Ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＢＳ ａｎｄ ＭＣＡＯ ｇｒｏｕｐ（尸＞０．０５）．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ—ｌａｔｅｒａｌ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＭＣＡＯ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＢＭＳＣｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＮＳＣｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ｔｈｕｓ ｒｅｐａｉｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒａｔｓ． ［ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ］ Ｂｏｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ；Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 脑血管疾病（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＣＶＤ）严重 威胁着人类的生命，我国每年约有１５０万新发脑血管 病患者，最常见的类型为局灶性脑缺血，给国家和社会 带来沉重负担 Ｊ，因此，寻找脑缺血后神经修复的方 法成为目前研究的热点。干细胞工程的兴起为ＣＶＤ 的治疗带来了希望 ，骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒ－ ｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）作为一种成体干 细胞，具有取材方便、来源广泛、低免疫源性等优点而 备受人们关注 Ｊ。近ｆ３研究发现，ＢＭＳＣｓ体内移植可 减轻局灶性脑缺血模型，即大脑中动脉阻塞（ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）大鼠的脑损伤 ，且可 以促进ＭＣＡＯ大鼠内源性ＮＳＣｓ的增殖 Ｊ，这些增殖 的ＮＳＣｓ能否分化成为成熟的神经细胞修复脑损伤目 前尚不清楚。本研究通过体外培养ＢＭＳＣｓ，采用线栓 法制成ＭＣＡＯ模型后，侧脑室移植ＢＭＳＣ，采用尼氏染 色法观察ＢＭＳＣｓ移植对ＭＣＡＯ大鼠脑损伤的影响，免 疫荧光双标法观察ＢＭＳＣｓ移植对ＮＳＣｓ分化的影响， 以期为ＢＭＳＣｓ移植治疗局灶性脑缺血性疾病的临床 应用提供科学的理论依据。 １材料和方法 １．１ 实验动物及分组健康成年Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄 性大鼠４０只（清洁级），由山东中医药大学实验动物 中心提供并批准使用，批号：ＳＣＸＫ（鲁）２０１１０００３，体重 ２４０～２７０ｇ，室温环境下饲养，采用完全随机法随机分 为正常对照组（ＣＯＮ组）、大脑中动脉阻塞（ＭＣＡＯ）模 型组、ＢＭＳＣｓ移植组（造模后２４ ｈ，侧脑室移植ＢＭＳＣｓ ３ ｘ １０。－＠／２￣ｚ１）、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）组（造模后２４ｈ， 侧脑室移植２ ｌ ＰＢＳ），ｎ＝１０。 １．２ ＢＭＳＣｓ的体外培养与细胞标记 采用贴壁法体 外培养大鼠ＢＭＳＣｓ：将大鼠脱臼处死，无菌条件下分 离出大鼠股骨和胫骨，冲出骨髓细胞离心ｌＯｍｉｎ，弃上 清，用低糖ＤＭＥＭ培养液制成骨髓细胞悬液种瓶，置 于３７℃、体积分数５％ＣＯ，、饱和湿度的细胞培养箱内 培养，２４ｈ后逐步半换液，隔日１次，细胞融后传代，传 至４代后ＢＭＳＣｓ行Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４标记２４ｈ后移植。。 。 １．３ 大鼠局灶性脑缺血模型的制作及５．Ｂｒｏｍｏ－２＂－ｄｅ— ｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ标记采用改良的大脑中动脉阻塞法建立 局灶性脑缺血模型，即ＭＣＡＯ模型 。造模后２４ｈ，各 组大鼠腹腔注射５－Ｂｒｏｍｏ－２＂－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）， ５０ｍｇ／次，每日２次，连续注射６ｄ。 １．４ 大鼠ＢＭＳＣｓ脑内移植及脑内检测 造模后 ２４ｈ，１０％的水合氯醛腹腔麻醉，俯卧位固定于立体定 位仪上，消毒后暴露出前囟，前囟后０．５ｍｍ，矢状缝旁 ２．５ｒａｍ，硬膜下ＤＶ ５．０ｍｍ），穿透其硬脑膜，微量加样 器注入细胞悬液３ ｘ １０ 个／２ ，针头缓慢退出，骨蜡 封闭针眼，缝合皮肤。青霉素注射预防感染。移植后 ２８ｄ，处死大鼠，制成１６１ｘｍ的冰冻切片，正置荧光显微 镜下检测Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４阳性细胞。 １．５标本的收集与切片的制作移植后２８ｄ，各组大 鼠心脏灌注取脑，移植组常规石蜡包埋，制成４ ｍ石 蜡切片，分别行ＢｒｄＵ／［３一ｔｕｂｕｌｉｎ与ＢｒｄＵ／胶质纤维酸 性蛋白（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）免疫荧光 双标检测与尼氏染色。 １．６ ＢｒｄＵ／［３．ｔｕｂｕｌｉｎ与ＢｒｄＵ／ＧＦＡＰ免疫荧光双标检 测 石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原，正常山羊血清 封闭１ｈ，分别加入抗体鼠抗ＢｒｄＵ一抗（１：２００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，美国）与兔抗［３－ｔｕｂｕｌｉｎ一抗（１：５０，ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，美国）或兔抗ＧＦＡＰ（１：１００，北京中杉金桥 生物试剂有限公司，中国），４ｑＣ冰箱过夜，０．Ｏ１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ冲洗，滴加ＴＲＩＴＣ标记的山羊抗大鼠ＩｇＧ（１： １００，北京中杉金桥生物试剂有限公司）与ＦＩＴＣ标记 的山羊抗兔ＩｇＧ（１：１００，北京中杉金桥生物试剂有限 公司），３７％避光孵育６０ｍｉｎ，冲洗后滴加含ＤＡＰＩ防淬 灭荧光封片剂封片（Ｆ６０５７，Ｓｉｇｍａ，美国），正置荧光显 微镜下（ＢＸ－５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）观察，每只大鼠取４～５ 张非连续脑组织切片计数大脑损伤侧脑组织ＢｒｄＵ Ｂ— ｔｕｂｕｌｉｎ 与ＢｒｄＵ ＧＦＡＰ 细胞数。 １．７尼氏（Ｎｉｓｓ１）染色石蜡切片，０．１％的甲苯胺蓝 ６０％染色３ｍｉｎ，双蒸水冲洗，７０％酒精１ｍｉｎ，８０％酒精 １ｍｉｎ，９５％酒精分色，镜下观察至背景无色，尼氏小体 染成蓝色。无水乙醇脱水，二甲苯中透明，用中性树胶 ｑＡｃｔａ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｗｅｉｆａｎｇ Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．２ ２０１３ 组大脑皮层及纹状体仅发现少量ＢｒｄＵ ＧＦＡＰ 细胞 ３讨论 数，说明ＢＭＳＣｓ可以减少内源性ＮＳＣｓ向星形胶质细 胞分化。 ＢＭＳＣｓ作为一种有潜能的干细胞，可自我更新， 总之，ＢＭＳＣｓ脑内移植后可以存活，并促进内源 性ＮＳＣｓ分化为成熟的神经元，减少星形胶质细胞分 自我复制，横向分化为神经细胞，且脑内移植后可促进 内源性神经再生 ，因而广泛用于神经系统疾病的治 疗。本研究发现移植后２８ｄ，移植组损伤侧可见移植 细胞，提示ＢＭＳＣｓ侧脑室移植后可以存活长达２８ｄ，且 可以迁移到损伤区。这些存活的ＢＭＳＣｓ是否具有神 经保护作用尚待进一步的研究。尼氏染色是神经元尼 氏体染色的常用方法，本研究采用尼氏染色法观察各 组大脑皮层及纹状体神经元形态及数量的变化，结果 发现ＣＯＮ组可见大量排列的整齐的神经元，而ＭＣＡＯ 组神经细胞排列不整齐，神经元数显著少于ＣＯＮ组， 提示模型制作成功。ＢＭＳＣｓ移植组神经元数显著多 于ＭＣＡＯ组，而ＰＢＳ组与ＭＣＡＯ组神经元数无差别， 提示ＢＭＳＣｓ移植可以减轻神经元损伤，具有神经保护 作用，且该保护作用与移植本身及移植介质无关。 ＢＭＳＣｓ的神经保护作用的具体机制目前尚不明确，由 于ＢＭＳＣｓ可以促进脑损伤大鼠内源性ＮＳＣｓ的增殖， ＢＭＳＣｓ能否促进内源性ＮＳＣｓ分化为成熟的神经元目 前尚不清楚，ＢＭＳＣｓ神经保护作用是否与其有关呢？ 本研究进行了深入研究。 ＢｒｄＵ是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增 殖周期的Ｓ期嵌入细胞核的ＤＮＡ，可以随着细胞的分 化进入子代细胞，可用来标记新生的神经细胞，Ｂ—ｔｕ— ｂｕｌｉｎ是成熟神经元的标记物，ＧＦＡＰ是星形神经胶质 细胞的标记物，故ＢｒｄＵ／１３ ｔｕｂｕｌｉｎ与ＢｒｄＵ／ＧＦＡＰ分别 用来标记新生成的成熟神经元与星形胶质细胞＿９＇加Ｊ。 本研究发现ＭＣＡＯ组大鼠ＢｒｄＵ ＧＦＡＰ 细胞数明显 增加，ＢｒｄＵ Ｂ—ｔｕｂｕｌｉｎ 细胞数增加不显著，而有研究 发现局灶性脑缺血可促进内源性ＮＳＣｓ的增殖，提示 局灶性脑缺血大鼠增殖的内源性ＮＳＣｓ多数分化为神 经胶质细胞，仅少量分化为神经元，进而出现局灶性脑 损伤。ＢＭＳＣｓ组ＢｒｄＵ Ｂ．ｔｕｂｕｌｉｎ 细胞数明显增多，较 ＭＣＡＯ组、ＣＯＮ组及ＰＢＳ组均显著增加且差异有统计 学意义，提示ＢＭＳＣｓ可促进内源性ＮＳＣｓ分化为成熟 神经元，从而修复脑损伤，且其促神经元分化作用与移 植本身及移植介质无关；同时，本研究还发现，ＢＭＳＣｓ 化，具有神经保护作用。 ［参考文献］ ［１］ Ｊａｍｅｓ Ｄ，Ｍａｒｓｈ ＭＤ，Ｓａｌａｈ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｏｋｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ［Ｊ］．ＪＡｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１０，５６（９）：６８３～６９１． ［２］ Ｙａｌｖａｅ ＭＥ，Ｒｉｚｖａｎｏｖ ＡＡ，Ｋｉｌｉｃ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｎｔａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｌａ ｉ＇ｓｅｈｅｍｉａ［Ｊ］＿Ｃｕｒｒ ｎ Ｄｅｓ， ２００９，１５（３３）：３９０８～３９１６． ［３］Ｄｈａｒｍａｓａｒｏｊａ Ｐ．Ｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．ｄｅｉｒｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，１６（１）：１２～ ２Ｏ． ［４］Ｂａｏ Ｘ，Ｗｅｉ Ｊ，Ｆｅｎｇ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ— ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｎ— ｄｏｇｅｎｏｕｓ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ２０１１，１３６７：１０３—１１３． ［５］Ｄｅｎｇ ＹＢ，Ｙｅ ＷＢ，Ｈｕ ＺＺ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ＢＭＳＣｓ ｒｅ ｄｕｃｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆＶＥＧＦ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｓ，２０１０，３２（２）：１４８ ～１５６， ［６］谢岷，杨于嘉，王晓莉，等．骨髓基质细胞移植治疗新生大鼠缺氧 缺血性脑损伤时间窗探讨［Ｊ］．中华儿科杂志，２００７，４５（５）：３９６ ～３９７． ［７］王耀明，董萼塘，肖学宏．ＭＲＩ评价改进的大鼠可逆性局灶性脑缺 血模型［Ｊ］．卒中与神经疾病，１９９９，６（３）：１７１． ［８］ Ｋａｎ Ｉ，Ｂａｒｈｕｍ Ｙ，Ｍｅｌａｍｅｄ Ｅ，ｅｔ １ａ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｖｅｎｔｆｉｃｕｌｒａ ｚｏｎｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ，２０１ｌ，７（２）：４ｏ４～４１２． ［９］Ｙａｎｇ ＹＪ，Ｗａｎｇ ＸＬ，Ｙｕ ＸＨ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｐｅｒｂａｒｉｃ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｎｄｏｇｅ－ ｎｏｕｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ－－ｉｓｃｈｅ－・ ｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｎｅｏｎａｔｌａ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｕｎｄｅｒｓｅａ Ｈｙｐｅｒｂ Ｍｅｄ，２００８，３５ （２）：１１３～１２９． ［１０］Ｘｉｏｎｇ Ｍ，Ｍａ ＳＭ，Ｓｈａｏ ＸＭ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｅｗｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＳＧＺ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔｌａ ｒａｔ ｂｒａｉｎ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２０１２，５２３（１）：８７～９２． ［收稿日期］２０１２—１１—１４
