气相色谱手性衍生化试剂Ｎ－七氟丁酰基－Ｌ－脯氨酰氯的合成与应用＊曾提要苏杭州３１００３１）（浙江医科大学药物分析教研室合成了用于气相色谱（ＧＣ）的手性衍生化试剂Ｎ－七氟丁酰基－Ｌ－脯氨酰氯（Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ）。各种特性试验表明，Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ是灵敏的ＧＣ手性衍生化试剂，可直接于水相拆分微量的手性胺对映体。关键词气相色谱，手性衍生化试剂，胺类对映体分离１前言随着立体异构体研究的发展，它们之间的生物活性差异也被人们所认识。为了研究异构体在生物体内的药理和毒理学性质，必须将它们进行拆分，其中最难拆分的当属对映异构体。应运而生的手性色盐（ＭＤＰ，（）－Ｎ－丙基－１－（３，４－亚甲二氧苯基－２－丙胺（ＰＭＤＰ）购自Ｓｉｇｍａ公司。Ｌ－脯氨酸（生化试剂，上海康达）、丙酮、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水硫酸钠、氯化钾等均为分析纯。干冰为杭州长征化工厂产品，二氯亚砜经全玻璃新鲜蒸馏两次，沸点７６～７８℃妗。谱学（Ｃｈｉｒａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）作为色谱科学的重要分支之一，已获得令人惊喜的发展。其中气相色谱（ＧＣ）用于拆分对映体的方法可分为两类［１，］：１）采２．２仪器与条件条件１：ＨＰ５７９０ＧＣ和５９７０ＭＳＤ，ＨＰ１石英毛细管柱，柱长１２ｍ，膜厚０．２５μｍ。载气Ｈｅ，ＧＣ升温程用手性固定相制成的手性柱如Ｃｈｉｒａｓｉｌ－Ｖａｌ，Ｃｈｉ－ｒａｌｄｅｘ等直接于柱上拆分对映体。该法简便、准确，但每种手性固定相仅适用于某几类化合物，使用温度也不能太高，且费用高昂。２）采用手性衍生化试剂，于柱前衍生化对映体，利用所形成的非对映体对的色谱行为的差异，于常规非手性固定相上拆分。该法对手性试剂和衍生化反应有较高的要求，化合物结构要有可供衍生化的官能团，其优点是可采用耐高温的非手性固定相，运用得当可增加检测灵敏度，并且费用也较经济。本文报道了用于ＧＣ的手性衍生化试剂Ｎ－七氟丁酰基－Ｌ－脯氨酰氯Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－序：１２０（ｌｍｉｎ） ２７５。注射温度２５０，接口温度２７５，电离模式：正离子电子轰击（ＰＥＩ）。条件２：Ｆｉｎｉｇａｎ ＭＡＴ ４５００ ＧＣ／ＭＳ ＤＢ５和ＤＢ１３０１石英毛细管柱，柱长１５ｍ膜厚０．２５ｍ（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），进样温度２６０，接口温度２７５。ＧＣ升温程序；１ ０ ０（ ４ ｍｉ ｎ） ３００，载气Ｈｅ。化学电离气体：甲烷，电离模式：负离子化学电离（ＮＣＩ。２．３ Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ的合成［３］取一圆底烧瓶置于－７８℃干冰－丙酮浴中，加入溶于１５ｍＬ无水乙醚中的２．５ｍＬ七氟丁酸酐，同时ＰＣｌ）的合成方法和特性试验，并成功地用于多种胺类手性化合物的对映体拆分。迅速加入０．６０ｇ Ｌ－脯氨酸，不断搅拌１０ｍｉｎ。再于室温拌搅２ｈ然后于室温真空蒸发除去过量未反应的试剂。先将７．５ｍＬ新鲜蒸馏的二氯亚砜溶于１５ｍＬ无水二氯甲烷中，加到置于０℃冰水浴的上述反应２实验部分２．１试剂和材料七氟丁酸酐（ＨＦＢＡ），ｄ和ｌ以及（ｄｌ）甲基苯丙胺（ＭＰ）Ｎ－正丙基－苯丙胺（ＰＰ）Ｓ－－甲苄胺，Ｒ和Ｓ以及（±）－３４－亚甲二氧苯基－Ｎ－甲基－２－丙胺盐酸（ＭＭＤＰ），（±）－１－（３，４－亚甲二氧苯基）－２－丙胺盐酸浙江省卫生厅和浙江省大仪器资助项目物残渣中，室温搅拌２．５ｈ。再于室温真空蒸发除去未反应的二氯亚砜。残渣溶于５ｍＬ无水ＣＨ２Ｃｌ２中，于室温真空蒸发至干。如此重复操作两次。最终残渣溶于５０ｍＬ无水ＣＨ２Ｃｌ２中，得到０．１ｍｏｉ／浓度的Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ。于Ｎ２流中灌封于棕色小瓶中，贮存本文收稿日期：１９９３年１１月１９日，修回日期：１９９４年１月１４日于－２０℃备用。图１是Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ的化学合成原理示意图。层于４０℃水浴与缓缓空气流中蒸干，分析前将残渣溶于１００Ｌ ＥｔＯＡｃ，注射１Ｌ进入ＧＣ／ＭＳ分析。图２～４是手性胺与Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ形成的酰胺衍生物的色谱和质谱图。３结果与讨论３．１手性胺的衍生方法与质谱取１０μｇ手性胺类化合物于０．５ｍＬ碳酸盐缓冲液（０．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ９．０）中，置０℃冰水浴内，加５０ＬＮ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ－，旋转反应２０ｍｉｎ，加ＫＣｌ至饱和，再调节ｐＨ至９并加入０．５ｍＬ上述缓冲液，用４ｍＬＥ－ｔＯＡｃ提取１５ｍｉｎ，分取有机层。依次用２ｍＬ稀氨液和２ｍＬ去离子水洗涤。经无水Ｎａ２ＳＯ４干燥的有机表１ Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ与手性胺形成衍生物的ＮＣＩ质谱（条件２）ＰＥＩ很难获得分子离子峰，但可以发现明显的断裂规律（如图３和图４所示）。而ＮＣＩ则可获得与分子量相符的分子离子峰［Ｍ－］或［Ｍ－ＨＦ］峰（如表１所示）。无论是ＰＥＩ还是ＮＣＩ对左旋体和右旋取５份消旋体胺类样品按３．１项操作，制成１ｇ／ｍＬ ＥｔＯＡｃ液。取１Ｌ注入ＧＣ按条件２进行选择性离子监测（ＳＩＭ）分析（表２）结果表明，在衍生化、提取净化和ＧＣ过程中，对映体未发生消旋化反应，各对映体对之间与手性试剂的反应速率一致。体均得到相同的质谱图。３．２反应速率试验［２］表２对映体衍生物的色谱峰面积比在同样条件下仅能稳定数天。用Ｓ－α甲苄胺，Ｒ－ＭＭＤＰ和Ｒ－ＭＤＰ检查Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ的光学纯度均在９８．５％以上。由于非对映体衍生物分子中引入了—ＣＯＣ３Ｆ７，使质谱ＮＣＩ灵敏度增加。按条件２操作，ＭＭＤＰ和ＭＤＰ对映体的最低检出量（ＬＯＤ）为１ｎｇ／ｍＬ最低定量浓度３．３对映体的分离度和柱效按３．２项制备样品后在条件２下分析，计算了对映体的分离度和柱效（表３）胺类对映体与Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ反应生成酰胺类非对映体，由于相互间物理性质不同，导致与固定相键合力不等，差速迁移而在非手性固定相上获得良好分离。表３对映体的分离度和柱效（ＬＯＱ）为５ｎｇ／ｍＬ。Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ与手性胺的反应，条件温和，检测灵敏度高，且可于水相直接衍生化，是ＧＣ分析生物体液中微量手性胺对映体较理想的拆分试剂。表４ Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ的稳定性试验（ｎｇ／ｍＬ）参考文献３．４稳定性试验［］于－２０℃嬷贮存的手性试剂Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ在四个月内使用，效果仍然很好，未发生消旋化现象（表１曾苏，现代应用药学，１９９３；１０（５）：４２曾苏，中国法医学杂志，待发表３ Ｌｉｎ Ｈ Ｋ，Ｚｅｎｇ Ｓ，Ｆｏｌｔｚ Ｒ Ｌ．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １９９２ Ａｎｎｕ－ａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｂｙ ＳＯＴ，Ｓｅａｔｔｌｅ：ＳＯＴ Ａｍｅｒｉｃａ，１９９２；２６４）。当Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ与对映体形成酰胺衍生物后，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎ－Ｈｅｐｔａｆ－ｌｕｒｏｂｕｔｙｒｙｌ－Ｌ－Ｐｒｏｌｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＧＣ） ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ＴｅｓｔｓＺｅｎｇ Ｓｕ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，３１００３１）Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ－ｈｅｐｔａｆｌｕｒｏｂｕｔｙｒｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ） ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｃｈｉｒａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＧＣ．Ｔｈｅ ｃｈａｔａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｔｈａｔ Ｎ－ＨＦＢ－Ｌ－ＰＣｌ ｉｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｃｈｉｒａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，ａｍｉｎｅ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
