细胞生长曲线的测定

细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

测定细胞生长曲线有三种常用的方法，计数法、MTT法和CCK-8法，下面就这几种常用方法做详细说明。

计数法

1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致

2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养

3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，计算平均值，连续计数7 d 4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT法

1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致

2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养

3．24 h后开始检测细胞生长情况，制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h，使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶

4．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解 5．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

6．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。 7. 待测定结束后，收集数据进行处理，用Excel绘出图表。

CCK-8法

1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致

2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养

3．24 h后开始检测细胞生长情况，用CCK-8显色剂进行显色反应，每100ul培养基加10ul CCK-8，37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中孵育1h

4．酶标仪测定450nm处的吸光度，记录，确定细胞实际的起始密度，作为生长相对零点

5．每天或隔天换液，具体视实验要求而定 6．以后每隔24 h检测一次，连续计数5-7 d

7. 待测定结束后，收集数据进行处理，用Excel绘出图表。

本组测定生长曲线主要用于某基因过表达或者被siRNA干扰后对细胞生长的影响，具体操作步骤如下：

1. 核酸的准备：目的基因的质粒构建和抽提（一般为pcDNA3.1载体），或者是目的

基因siRNA的片段设计和合成

2. 细胞准备，取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL

视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致。

注：如果做过表达，则需要选取内源性基因表达水平较低的细胞株；如果做RNA干扰则需要选取内源性基因表达水平较高的细胞株。而在实验设计时，一定得有一组空载体的阴性对照或者是未进行RNA干扰的阳性对照。

3. 细胞过夜培养后，第二天进行转染，本组采用Lipofectamine® 2000转染细胞（以

24孔板转染质粒DNA为例）。将2-4ug质粒DNA溶解在50ul的Opti-MEM®中（或者其他的无血清培养基），轻轻混匀。

4. 将5-10ulLipofectamine® 2000溶于50 μL of Opti-MEM®中（或者其他的无血清培养

基），轻轻混匀，室温孵育5分钟。

5. 将DNA和Lipofectamine® 2000两者轻轻混匀，于室温孵育20分钟

注：核酸质量与Lipofectamine® 2000体积的比例一般在1:2和1:3之间，这个

比例根据细胞和基因不同而不同，需要自己摸索。 6. 在此期间将细胞培养基由完全培养基换成无血清培养基

7. 20分钟的孵育后将混合物慢慢加入细胞中，轻轻混匀，此间步骤5-6最好在25分

钟之内完成

8. 置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养4-6小时后将培养基换成完

全培养基

9. 每24小时用CCK-8试剂盒检测细胞生长情况

10. 与此平行进行转染结果的检测，一般为两种水平上的检测，RNA和蛋白水平检测

目的基因的表达或者沉默情况。

附：材料试剂和仪器

材料：培养瓶，试管，吸管，移液管，废液缸，各类型孔板

试剂：培养基(RPMI10或DMEM)，小牛血清，PBS，0．25％胰蛋白酶溶液(胰酶)，0．5％台盼蓝染液，Lipofectamine® 2000，Opti-MEM®，CCK-8试剂，

仪器：CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪，微量加样器，血球计数仪

表1.转染各种型号孔板所需核酸和Lipofectamine® 2000的推荐量