(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103842823 A(43)申请公布日 2014.06.04
(21)申请号 201280045049.8(22)申请日 2012.09.14(30)优先权数据
2011-202463 2011.09.15 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.03.14
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/JP2012/005878 2012.09.14(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/038696 JA 2013.03.21(71)申请人国立大学法人名古屋大学
地址日本爱知县
申请人株式会社医学生物学研究所
株式会社昂考米克斯(72)发明人柳泽圣 高桥隆 横井香平(54)发明名称
用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分析方法(57)摘要
本发明的课题是开发简便且廉价、可信度高的间皮瘤的检查方法、和该检查方法中使用的试剂盒。作为解决问题的方法是，本发明提供间皮瘤的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。本发明提供用于间皮瘤的诊断的试剂盒，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。在本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是健常者。本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
权利要求书1页 说明书18页权利要求书1页 说明书18页序列表12页 附图5页序列表12页 附图5页
长谷川好规 小野健一郎八木香澄 增田瞳 竹内俊幸
(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所
11247
代理人曽祯 段承恩(51)Int.Cl.
G01N 33/574(2006.01)C07K 14/47(2006.01)C07K 16/18(2006.01)C12N 15/09(2006.01)
CN 103842823 ACN 103842823 A
权 利 要 求 书
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1.间皮瘤的检查方法，其特征在于，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。
2.根据权利要求1所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤，使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
5.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。
6.根据权利要求4所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的间皮瘤的检查方法，其特征在于，所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品。
8.用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。9.根据权利要求8所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体，是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
11.根据权利要求10所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，包含：固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体。
12.根据权利要求8～11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
13.根据权利要求8～11的任一项所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，所述间皮瘤的诊断，是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
14.根据权利要求12或13所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
15.根据权利要求14所述的用于间皮瘤的诊断的试剂盒，其特征在于，所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
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用于胸膜间皮瘤患者的早期发现的分子标志物及其表达分
析方法
技术领域
本发明涉及间皮瘤的检查方法、和用于间皮瘤的诊断的试剂盒。具体地，涉及包含
血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)的浓度的测定步骤的间皮瘤的检查方法、和包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体的用于间皮瘤的诊断的试剂盒。
[0001]
背景技术
已知间皮瘤由于石棉的吸引而发生。间皮瘤根据发生部位而分类为胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心膜间皮瘤。胸膜中的发生最多，占全部间皮瘤的8成～9成(非专利文献1)。良性的胸膜间皮瘤称为纤维性间皮瘤，在肺炎、外伤等之后，胸膜发生纤维增生，结果形成局限性的肿块；与此相对，恶性胸膜间皮瘤是由胸膜间皮(覆盖包裹肺的胸膜的肺侧表面的二重的膜)发生的肿瘤，是恶性度高的肿瘤。恶性胸膜间皮瘤进行组合了外科疗法、内科疗法和放射线疗法的治疗，但仍属于预后差的肿瘤之一。间皮瘤具有潜伏期非常长的特征，从向石棉的曝露到间皮瘤发生的时间为11～54年(中位数38.6年)。鉴于日本石棉使用最多的时期为1970～1990年，预计到2030年为止间皮瘤患者持续增加。该长的潜伏期连同没有对早期发现有用的筛选法的现状，造成了发病发现的延迟。晚期例的经过极不良，快速扩散、数年以内死亡的病例为大半。然而，对于可以治愈切除的早期发现例，却可以期待长期生存。因此，能够早期发现的新的筛选检查的开发成为迫切的课题。[0003] 恶性胸膜间皮瘤的早期诊断极困难，当因为胸痛、胸积水造成的呼吸困难等自觉症状而发现时，基本上已经是晚期。作为在诊断恶性胸膜间皮瘤时有用的标志物，可列举胸水中的透明质酸、CYFRA、CEA等，但具有作为样品必须采集胸水、诊断精度低等大的问题。进而，为了进行确实的诊断，必须使用活检材料进行真正的病理组织诊断，精神、肉体、社会的负担极大。另外，恶性胸膜间皮瘤作为组织型分为上皮型、肉瘤型、其混合型(双相型)，但特别是肉瘤型没有有效的诊断方法，预后劣恶。因此，多数情况下诊断为恶性间皮瘤诊断时，已经大范围扩散、不可能进行根治手术，预后极不良，1年生存率为50％左右，2年生存率为20％左右。
[0004] 由于石棉曝露而非肿瘤性炎症性的障害在肺、胸膜内发生，因此石棉曝露者在间皮瘤未发病的阶段已经发现医学影像学异常。因此，认为医学影像学检查作为筛选有用性低。另外相对于曝露者的数，实际发病的病例的比例小。现状是渴望对于石棉曝露者简便且廉价、可信度高的检查方法。[0005] 首先，本发明者们着眼于作为血中的肿瘤标志物的间皮素(mesothelin)阳性例限于上皮型的间皮瘤，尝试探索对于肉瘤型的胸膜间皮瘤例也能确认阳性例的标志物。肉瘤型胸膜间皮瘤的诊断被倡导必须进行细胞诊断、胸膜活检、图像诊断，诊断极困难(非专利文献2)。本发明者们经由利用了质谱装置的IDA(信息相关采集，Information Dependent
[0002]
Analysis)、运用了数据库的生物信息学分析、使用了DNA微阵列的与基因表达的比较、利用基序(motif)检索的蛋白质功能预测、利用与内标资料的比较的定量化等工序，通过应
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用蛋白质组分析结果的挖掘技术来分析胸膜间皮瘤组织样品中的蛋白质表达谱，尝试获得数百种蛋白质的表达信息，并成功地获得。
[0006] 进而为了进行作为血液中的标志物的候选缩小研究，进行了以血液为对象的蛋白质组学分析：利用了质谱装置的MRM(多反应监测，Multiple Reaction Monitoring)。并且，对于所述数百种蛋白质中的特别数十种蛋白质，与作为对照的正常胸膜间皮组织样品比较，确认了在恶性胸膜间皮瘤组织样品中其存在量增大。进而，在恶性胸膜间皮瘤病例血液样品中，与作为对照的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患病例比较，确认了骨膜蛋白(Periostin)的浓度上升。
[0007] 骨膜蛋白最初称为成骨细胞特异性因子-2(OSF-2)，是作为在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞中特异地表达的基因而被分离鉴定的分子(非专利文献3)。由骨膜蛋白基因所编码的氨基酸序列包含一般的信号序列、富含半胱氨酸的结构域(Cysteine-rich Domain)、4次重复的由约150个氨基酸组成的成束蛋白(Fasciclin)1结构域、和羧基末端结构域。骨膜蛋白中存在4种仅羧基末端区不同的剪接突变体的同种型。有骨膜蛋白不是在肺癌的肿瘤细胞本身、而是在肿瘤周围的间质细胞中高表达的报告(非专利文献4、5)；血清中的骨膜蛋白虽然没有发现在非小细胞性肺癌存在诊断中的有用性，但有可能成为预后的标志物的报告(非专利文献4、5)；在乳癌中高表达的报告(非专利文献6)；在胸腺癌中高表达的报告(非专利文献7)；在胰癌中高表达的报告(非专利文献8)。但是这些癌是与间皮瘤完全不同的病状。进而，有公开了识别骨膜蛋白的形成剪接突变体的羧基末端结构域的第17外显子的氨基酸的抗体在心疾患和其他癌种的诊断和治疗中有效的专利申请(专利文献1、2)。但是，关于骨膜蛋白的表达和在血中的存在、与间皮瘤的关系到目前为止未知。
[0008] 现有技术文献[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:国际公开第WO2007/077934号小册子[0011] 专利文献2:国际公开第WO2009/001940号小册子[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献1:Fujimoto N.等、J Cancer Res Clin Oncol.、136：1755、2010[0014] 非专利文献2:Husain等、Arch.Pathol.Lab.Med.、133：1317、2009[0015] 非专利文献3:Takeshita S.等、Biochem J、294：271、1993[0016] 非专利文献4:Sasaki H.等、Jpn J Cancer Res.、92：869、2001[0017] 非专利文献5:Sasaki H.等、Cancer.、92：843、2001[0018] 非专利文献6:Shao R.等、Mol Cell Biol.、24：3992、2004[0019] 非专利文献7:Sasaki H.等、Cancer Lett.、72：37、2001[0020] 非专利文献8:Baril P.等、Oncogene、26：2082、2007发明内容
发明要解决的课题
[0022] 需要开发简便且廉价、可信度高的间皮瘤的检查方法，和该检查方法中使用的试剂盒。
[0021]
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用于解决课题的方法
[0024] 本发明提供间皮瘤的检查方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白(Periostin)蛋白质的浓度的测定步骤。[0025] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0026] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。[0027] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时使用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。
[0028] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤。[0029] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述间皮瘤是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。
[0030] 本发明的间皮瘤的检查方法中，有时所述血液样品是受试者的血浆或血清的样品。
[0031] 本发明提供用于间皮瘤的诊断的试剂盒，包含针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。[0032] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。有时所述试剂盒通过ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0033] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。[0034] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时包含固定化了能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体中的一种的固体支持体、和针对所述2种抗体中的另一种的特异性结合配偶体(partner)。有时所述试剂盒通过夹心ELISA法来测定人骨膜蛋白蛋白质的浓度。
[0035] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
[0036] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。[0037] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0038] 本发明的用于间皮瘤的诊断的试剂盒中，有时所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤的患者。
[0039] 本发明提供间皮瘤的诊断方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤。[0040] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使用针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体。
[0041] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述针对人骨膜蛋白蛋白质的抗体是与包含序列号2所记载的氨基酸序列的多肽结合的抗体。[0042] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤使
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用能同时与所述人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗体。[0043] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是否是间皮瘤的患者。
[0044] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的诊断是判断可能患间皮瘤的受试者是间皮瘤的患者还是除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者。
[0045]
本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的患者是恶性胸膜间皮瘤的患
者。
本发明的间皮瘤的诊断方法中，有时所述间皮瘤的患者是肉瘤型或双相型的恶性
胸膜间皮瘤的患者。[0047] 本发明中，间皮瘤是来源于间皮细胞的肿瘤，根据基于原发组织的分类，也指胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心膜间皮瘤中的任一种。另外，根据基于构成肿瘤组织的细胞型的分类，恶性间皮瘤也指上皮型、肉瘤型、和它们的混合型(双相型)的任一种。本发明的间皮瘤有时是胸膜间皮瘤，有时是肉瘤型恶性胸膜间皮瘤。间皮瘤的检查对于石棉曝露者的健康是重要的，因此本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法优选应用于胸膜恶性胸膜间皮瘤。在利用现有的生物化学标志物的间皮瘤的检查方法中，不能检测出肉瘤型和双相型的恶性胸膜间皮瘤，与此相对，本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法能够检测出肉瘤型和双相型的恶性胸膜间皮瘤。因此，本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法优选应用于肉瘤型或双相型的恶性胸膜间皮瘤。本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法有时用于从健常者中判别间皮瘤的患者。本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法有时用于从除了恶性胸膜间皮瘤以外的呼吸器官疾患的患者中判别恶性胸膜间皮瘤的患者。这里，除了恶性胸膜间皮瘤以外的呼吸器官疾患是指肺癌、和除了癌以外的呼吸器官疾患。除了癌以外的呼吸器官疾患包含COPD和良性的胸膜间皮瘤，但不限于此。
[0048] 本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的受试者是指需要接受间皮瘤的检查的所有人。有时本发明的间皮瘤的检查方法的受试者表现咳、痰、胸痛、呼吸困难等症状。有时所述受试者是可能患间皮瘤的受试者。所述可能患间皮瘤的受试者包含有所述症状的人、和/或经历了石棉吸引或曝露或者怀疑经历了石棉吸引或曝露的人，但不限于此。
[0049] 本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的血液样品可以是全血、血浆、血清的任一种。所述血液样品优选为采血后分离的血浆或血清。用于本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法的采血、以及必要时的血浆或血清的调制使用本领域技术人员公知任一技术来实施。简洁地，在血浆的调制中，将包含EDTA、其他螯合剂、但不限于此的血液凝固抑制剂添加到采取的全血样品中后，通过离心除去细胞成分。在血清的调制中，在采取的全血样品中引起血液凝固反应，通过离心分离而从血沉分离血清。用于本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法的胸水的采取、和必要时的胸水样本
[0046]
的调制使用本领域技术人员公知的任一技术来实施(例如，请参照Porcel J.M.和Light R.W.(Am.Fam.Physician.、73：1211、2006))。[0050] 本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的人骨膜蛋白蛋白质，是指包含序列号2所列举的由630个氨基酸组成的氨基酸序列的任一人骨膜蛋白基因产物、
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以及与识别包含序列号2的氨基酸序列的多肽的抗体结合的人骨膜蛋白基因座的任一突变体的基因产物。
[0051] 本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度，可以通过任何方法测定。一般地，人骨膜蛋白蛋白质的浓度，使用能与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的任一分子来测定。人骨膜蛋白蛋白质的浓度优选使用与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的抗体来测定。这里，与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的抗体有时选自多克隆抗体或单克隆抗体、该抗体的抗原结合片段、以及包含该抗原结合片段的重组抗体或嵌合抗体中。
[0052] 与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的多克隆抗体或单克隆抗体使用本领域技术人员公知的任一技术来制作。本说明书的实施例中公开了与人骨膜蛋白蛋白质特异性地结合的单克隆抗体的制作技术，但本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法可以不限于所述实施例中记载的单克隆抗体地实施。[0053] 本说明书中的“抗体的抗原结合片段”，是指参加抗原结合的抗体的部分。所述抗原结合部位由重(H)链和轻(L)链的N末端的可变(V)区的氨基酸残基形成。所述抗原结合片段除了包含将完整的多克隆抗体或单克隆抗体分别用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分解而得的Fab片段或F(ab’)2片段之外，还包含Fv片段，该Fv片段包含非共价结合的、包含较多地保持天然抗体分子的抗原识别能力和结合能力的抗原结合部位的VH和VL区的杂2聚体。
[0054] 本发明的抗体中，有时重组抗体通过包括转化适当的细菌宿主、或者转染适当的哺乳类细胞宿主的抗体基因的表达克隆化来调制。本发明的抗体中，有时嵌合抗体是以所述本发明的重组抗体的抗原结合部位能与所述多肽结合的方式通过同种或异种的抗体的恒定结构域来支持的融合蛋白质。所述嵌合抗体包含：包含与抗体轻链可变区(VL)可操作地连接的抗体重链可变区(VH)的单链可变部抗体(scFv)，和由骆驼科(Camelidae，包含骆驼、单峰骆驼、羊驼)的动物产生的没有轻链的IgG类的骆驼重链抗体(HCAb)或其重链可变部结构域(VHD)。所述重组抗体可以使用来源于原核生物和真核生物的基因表达系统大量地调制。
[0055] 本发明的间皮瘤的检查方法、有时试剂盒和/或诊断方法中的“受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤”，通过与受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的骨膜蛋白结合的抗骨膜蛋白抗体、该抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体等标记来检测或定量。有时所述抗骨膜蛋白抗体直接地或介由接头(linker)而被生物素那样的低分子配基、酶、放射性同位素、色素、荧光色素、化学发光性化合物等标记。针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体包含能与抗骨膜蛋白抗体特异性地结合的本领域技术人员所知的所有物质。所述针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体以受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定没有障碍为条件，可以是能与抗骨膜蛋白抗体结合的任何受体或配基。所述受体或配基有时是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、其他生物体高分子。本发明中使用的针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体有时选自多克隆抗体或单克隆抗体、该抗体的抗原结合片段、和包含该抗原结合片段的嵌合抗体或重组抗体中。抗体的抗原结合片段是指参加抗原结合的抗体的部分。所述抗原结合部位由重(H)链和轻(L)链的N末端的可变(V)区的氨基酸残基形成。
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有时所述针对抗骨膜蛋白抗体的特异性结合配偶体被酶、放射性同位素、色素、荧光色素等标记。所述酶是过氧化物酶(POD)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、碱性磷酸酶(ALP)等。所述酶一般与适当的底物组合使用。检测的步骤有时包括用分光光度计测定吸光度的步骤、和/或用发光计测装置测定发光或荧光的强度的步骤。进而有时与胶乳颗粒等其他微粒结合。此时，有时检测的步骤包括用比浊计测定浊度的步骤。有时定量的步骤包括：将与已知浓度或量的人骨膜蛋白蛋白质结合的抗骨膜蛋白抗体的量数值化而作图制成标准曲线的步骤；和使用所述标准曲线，从与未知浓度或量的受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质结合的所述抗骨膜蛋白抗体的量，计算出该受试者的所述血液样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度或量的步骤。为了制成标准曲线，只要有浓度或量已知的人骨膜蛋白蛋白质至少2种即可，为了确保定量精度优选，为3种或4种以上。有时检测或定量的步骤包括通过洗涤而除去未与受试样品结合的抗骨膜蛋白抗体和其他抗体的步骤。这里将使用被酶标记的抗体等的测定技术称为ELISA法。并且，将为了将所述样品中的人骨膜蛋白蛋白质捕捉到固体支持体、和为了检测或定量捕捉到该固体支持体的人骨膜蛋白蛋白质，而使用能同时与人骨膜蛋白蛋白质结合的2种抗人骨膜蛋白蛋白质抗体的测定技术，称为夹心ELISA法。所述2种抗人骨膜蛋白抗体可以是表位不同的2种单克隆抗体，也可以是单克隆抗体与多克隆抗体。
[0056] 本发明的间皮瘤的诊断方法中，在确定受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度时，在所述浓度显示高于基准值的值的情况下，判断所述受试者有间皮瘤的嫌疑。所述基准值可以通过本领域技术人员公知的统计处理计算出。[0057] 有时本发明的间皮瘤的检查方法、试剂盒和/或诊断方法中的“受试者的血液和胸水中的至少任1种样品中的人骨膜蛋白蛋白质的浓度的测定步骤”通过本领域技术人员已知的各种手法实施。例如，有时所述手法除了已经说明的ELISA法和胶乳凝集法之外，还通过表面等离子体共振法来实施。
[0058] 有时用于实行本发明的免疫学的分析方法的试剂盒除了包含本发明的抗骨膜蛋白抗体之外，还包含用于制成标准曲线的已知浓度或量的对照样品。所述对照样品有时是人骨膜蛋白蛋白质，和/或其融合蛋白质。
[0059] 本发明提供以能实行本发明的间皮瘤的诊断方法的方式构成的骨膜蛋白的免疫学的分析装置。所述装置包含：CCD相机等检测单元，分光光度计、荧光分光光度计、比浊计、表面等离子体共振测定器等测定单元，用于试剂、洗涤液和/或样品的注入和/或除去的分配器单元，用于ELISA法用多孔板和/或表面等离子体共振用传感器芯片的操作的机械臂单元，用于这些单元的控制的控制单元等。
[0060] 本说明书中所提及的全部文献其全体通过引用而包含在本说明书中。附图说明
图1是显示人骨膜蛋白蛋白质的功能结构域的位置、各同种型的结构、与本发明
的骨膜蛋白抗体制作中使用的免疫原的结构之间的关系的模式图。[0062] 图2A是使用以POSTN781涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN781为免疫原而制作的单克隆抗体的反应性的结果的图。[0063] 图2B是使用以POSTN630涂布的微板，研究以人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN630为
[0061]
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免疫原而制作的单克隆抗体的反应性的结果的图。
[0064] 图3是显示间皮瘤患者和健常者的血浆样本各自的骨膜蛋白的浓度的分布的图。[0065] 图4是对于间皮瘤患者的血浆样本将同一样本的骨膜蛋白和SMRP的血浆中的浓度作图而得的相关图。
[0066] 图5是将患者样本中的血浆样本与血清样本中的骨膜蛋白浓度进行比较而得的图。
[0067] 图6是将本实施例的恶性胸膜间皮瘤、肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患(图6中表示为“呼吸器官疾患”)的患者样本中的骨膜蛋白浓度的分布进行比较而得的图。[0068] 图7是显示以骨膜蛋白浓度为标志物的、相对于合并了肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患患者的、本实施例的恶性胸膜间皮瘤患者样本的ROC曲线。
[0069] 图8是表示株化癌细胞的培养上清中的骨膜蛋白的测定结果的图。
具体实施方式
[0070] 以下说明的本发明的实施例仅是为了例示，并不限定本发明的技术的范围。本发明的技术的范围仅由专利权利要求书的记载来限定。可以以不脱离本发明的宗旨为条件，进行本发明的变更，例如，本发明的构成要件的补加、删除和置换。实施例1
[0072] 抗骨膜蛋白抗体的制作
[0073] (1)人骨膜蛋白蛋白质的结构
[0074] 图1是显示人骨膜蛋白蛋白质的功能结构域的位置、各同种型的结构、与本发明的骨膜蛋白抗体制作中使用的免疫原的结构之间的关系的模式图。在图1中，EMI和成束蛋白1分别表示EMILIN同源结构域和成束蛋白同源结构域。iso1～4分别表示人骨膜蛋白的同种型1～4。POSTN781表示在人骨膜蛋白蛋白质同种型3的781个氨基酸的多肽的羧基末端融合myc标签和his标签(表示为“mychis”)而得的重组蛋白质。POSTN630表示在包含至4个成束蛋白结构域的、人骨膜蛋白蛋白质的全部同种型中共有的630个氨基酸的多肽的羧基末端融合了myc标签和his标签的重组蛋白质。人骨膜蛋白蛋白质同种型3的781个氨基酸的氨基酸序列在序列号1中列举。人骨膜蛋白蛋白质的所有同种型中共有的包含至4个成束蛋白结构域的630个氨基酸的氨基酸序列在序列号2中列举。[0075] (2)人骨膜蛋白的cDNA获得
[0076] 基于人骨膜蛋白蛋白质的4种同种型的cDNA序列(同种型1：NM_006475、同种型2：NM_001135934、同种型3：NM_001135935、同种型4：NM_001135936)，在同种型1～4所共有的5’UTR区和3’UTR区设计引物。在第1阶段的PCR反应中使用的引物是5’-AATTCTGAGCTCTCCAAAGCCC-3’(序列号3)和5’-GGCTAACTCCACAATTTCCCTC-3’(序列号4)，第2阶段的PCR反应中使用的引物是5’-CGGAGAGACTCAAGATGATTCC-3’(序列号5)和5’-TCCTGAAGTCAACTTGGCTCTC-3’(序列号6)。以插入了人cDNA文库的混合物(mosaic cDNA(商标)、Genofi，LLC、San Clemente，CA92673)为模板，使用PCR扩增酶(KOD FX、东洋纺织株式会社)和所述引物通过巢式PCR来扩增包含骨膜蛋白的蛋白质编码区全长的cDNA。第1阶段的PCR反应在将[98℃20秒、55℃20秒、68℃2分30秒]进行25个循环
[0071]
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的条件下实施，第2阶段的PCR反应在将[98℃15秒、55℃15秒、68℃2分30秒]进行30个循环的条件下实施。第2阶段的PCR反应的扩增产物克隆化到克隆化载体pT7Blue T-Vector(Novagen、メルク株式会社)中，使用自动测序仪(Applied Biosystem)确认碱基序列。克隆化的cDNA与同种型3一致，因而命名为POSTNiso3-pT7。[0077] (3)人骨膜蛋白重组蛋白质的分泌表达系统的构建
作为用于使动物细胞表达人骨膜蛋白重组蛋白质的载体，使用由CMV启动子控
制、通过IRES序列使目的基因的产物与嘌呤霉素-EGFP融合蛋白质同时表达的pQCxmhIPG。pQCxmhIPG是由发明者们对BD Retro-X(商标)Q Vectors的pQCXIP载体进行改变而制作的。POSTN781表达载体如下构建。目的序列的PCR扩增，以POSTNiso3-pT7作为模板，使用KOD FX来进行。使用5’引物(5’-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列号7、下划线部为NotI识别序列)、和3’引物(5’-TTTTTGGACTCGAGCTGAGAACGACCTTCC-3’、序列号8、下划线部为XhoI识别序列)。反应条件是将[94℃15秒、55℃15秒、68℃2分30秒]进行30个循环。所得的PCR反应产物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhIPG的NotI-XhoI部位，从而构建表达载体pQCxmhIPG-POSTN781。POSTN630表达载体如下构建。目的序列的PCR扩增，以上述POSTNiso3-pT7为模板，使用Pfu酶(プロメガ株式会社)进行。使用5’引物(5’-CGGGCGGCCGCACCATGATTCCCTTTTTAC-3’、序列号9、下划线部为NotI识别序列)和3’引物(5’-GGTGTCTCGAGTGGATAGAGGAGTTTATC-3’、序列号10、下划线部为XhoI识别序列)。反应条件是将[98℃15秒、55℃15秒、68℃2分30秒]进行30个循环。所得的PCR反应产物用限制性酶NotI和XhoI消化，插入pQCxmhIPG的NotI-XhoI部位，从而构建表达载体pQCxmhIPG-POSTN630。
[0079] 为了建立人骨膜蛋白重组蛋白质的分泌表达细胞株，使用逆转录病毒包装细胞系统(Pantropic Retroviral Expression System、Clontech、K1063-1、タカラバイオ株式会社)。在涂布了胶原蛋白的100mm盘中准备80～90％汇合状态的GP2-293(Clontech、K1063-1、タカラバイオ株式会社)，使用Lipofectamine2000，将所述表达载体pQCxmhIPG-POSTN781或pQCxmhIPG-POSTN630、与pVSV-G(Clontech；K1063-1)一起共转染各11.2μg。48小时后，回收包含病毒颗粒的上清，通过超速离心(18,000转/分注、1.5小时、4℃)将所述病毒颗粒作为沉淀物分离。所述沉淀物用30μL的TNE(50mM Tris-HCl(pH值7.8)、130mM NaCl、1mM EDTA)悬浮，调制逆转录病毒载体浓缩液。将逆转录病毒载体浓缩液5μL用包含8μg/mL海美溴铵(H-9268、シグマアルドリッチジャパン株式会社)、和10％牛血清的DMEM(D5796、シグマアルドリッチジャパン株式会社)150μL稀释，调制含有病毒颗粒的培养基。在96孔微板中将以约40％汇合的状态准备的293T培养基转换为所述含有病毒颗粒的培养基，进行pQCxmhIPG-POSTN781或pQCxmhIPG-POSTN630的基因导入。所述基因导入后，用包含5μg/mL的嘌呤霉素(P-8833、シグマアルドリッチジャパン株式
[0078]
会社)、和10％胎牛血清的DMEM进行扩大培养，建立人骨膜蛋白重组蛋白质的表达细胞株POSTN781/st293T和POSTN630/st293T。[0080] (4)人骨膜蛋白蛋白质的纯化
[0081] 人骨膜蛋白重组蛋白质的表达细胞株POSTN781/st293T和POSTN630/st293T通过293细胞用的无血清培养基CD293(Invitrogen、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)各1L来培养。从培养上清中，使用TALON Purification Kit(Clontech、K1253-1)回
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收重组蛋白质POSTN781和POSTN630，用PBS透析。用SDS-PAGE和蛋白质印迹来确认纯化蛋白质。使用蛋白检测试剂盒II(BioRad、500-0002JA、バイオ?ラッドラボラトリーズ株式会社)确定蛋白质浓度。
[0082] (5)针对人骨膜蛋白重组蛋白质的单克隆抗体的制作
[0083] 将如(4)中说明的那样纯化的人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN781和POSTN630与等量的完全弗氏佐剂(F5881、シグマアルドリッチジャパン株式会社)混合而乳化，对每1只BALB/c小鼠(4周龄、雌性)每隔3～7天致敏5～20μg，致敏6次。在最终免疫的3天后从小鼠摘出淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞P3U1(P3-X63Ag8U1)进行细胞融合。
[0084] 细胞融合按照常规方法如下进行。全部培养基中的胎牛血清通过在56℃保温30分钟保温的处理而灭能。P3U1用添加了青霉素、链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。摘出的小鼠淋巴细胞与P3U1以1:10～1:2的比例混合而离心。一边对沉淀的细胞缓缓添加50％聚乙二醇4000(1.09727.0100、メルク株式会社)一边平稳地混合后，离心。沉淀的融合细胞用含15％FBS的HAT培养基(RPMI1640、HAT-supplement(Invitrogen、11067-030、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、青霉素和链霉素)适宜稀释，以每孔200μL接种于96孔微板。融合细胞在CO2孵育箱(5％CO2、37℃)中培养，在刚刚形成集落之后，取样培养上清，进行筛选。筛选中，选择通过免疫中使用的针对以POSTN781或POSTN630涂布的96孔板的ELISA法而显示阳性的孔的融合细胞集落。用含15％胎牛血清的HT培养基(RPMI1640、HT-supplement(Invitrogen、21060-017)、青霉素和链霉素)扩大培养后，通过有限稀释法进行克隆化。这样，以人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN781为免疫原得到了杂交瘤克隆为13个(抗体号：＃3-4-5、＃3-6-1、＃3-9-2、＃3-10-2、＃3-11-4、＃3-20-3、＃3-27-1、＃3-28-3、＃3-29-1、＃3-30-1、＃3-31-3、＃3-33-3、＃3-34-1)。以人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN630为免疫原得到了杂交瘤克隆13个(＃6-1-2、＃6-3-1、＃6-9-1、＃6-10-2、＃6-13-2、＃6-14-3、＃6-16-3、＃6-19-1、＃6-20-1、＃6-23-5、＃6-43-1、＃6-45-1、＃6-88-1)。
[0085] (6)抗人骨膜蛋白单克隆抗体的反应性
[0086] (5)中所得的抗人骨膜蛋白单克隆抗体对人骨膜蛋白的反应性如下验证。从各杂交瘤克隆的培养上清中，通过使用蛋白A-Sepharose的一般亲和性纯化法来纯化单克隆抗体。所得的纯化抗体分别以5μg/mL为最大浓度进行连续稀释，人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN781或POSTN630对各自的免疫原的反应强度通过ELISA法确认。
[0087] 图2A是使用以500ng/mL的POSTN781涂布的微板研究以人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN781为免疫原的单克隆抗体的反应性的结果的图。图2B是使用以500ng/mL的POSTN630涂布的微板研究使用人骨膜蛋白重组蛋白质POSTN630作为免疫原的单克隆抗体的反应性的结果的图。如图2A和B所示，确认了全部单克隆抗体克隆与作为免疫原的重组蛋白质之间浓度依赖性地发生反应。另一方面，对具有与所述人骨膜蛋白重组蛋白质相同的myc标签和his标签的、其他来源于人的重组蛋白质，也同样地通过ELISA法研究了反应性，结果不反应。因此，确认了(5)中得到的单克隆抗体均不是识别标签序列的寡肽的抗体。另外，以POSTN781为免疫原得到的13个单克隆抗体全部与POSTN630反应。因此，可以得到如下结论：本实施例中得到的全部抗人骨膜蛋白单克隆抗体，识别包含到4个成束蛋白结构域的人骨膜蛋白蛋白质的全部同种型所共有的630个氨基酸(序列号2)的多肽。
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CN 103842823 A[0088]
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(7)夹心ELISA法的构建
[0089] 由于作为夹心ELISA法的检测侧抗体使用，因而将本实施例中得到的全部单克隆抗体进行生物素标记。即，在抗体溶液中对每1mg抗体混合16.7μL的10mM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo、フナコシ株式会社)，在室温孵育1小时后，用PBS透析，除去未标记的生物素。从26个单克隆抗体克隆中，如下通过使用全部26×26的组合来确定适合夹心ELISA法的捕捉和检测的抗体克隆的组合。首先，将在0.1M NaHCO3、0.1M Na2CO3和0.15％Proclin150(SUPELCO、シグマアルドリッチジャパン株式会社)的溶液中以10μg/mL的浓度稀释后的26个抗体克隆，分别在96孔微板的各孔中添加各50μL，在4℃静置过夜或室温静置2小时，将抗体固定化于所述微板的孔底面。除去所述溶液后，分注封闭缓冲液(添加了1％BSA(Proliant)、0.15％Proclin150和5％蔗糖的PBS)各150μL(4℃静置过夜或室温静置2小时)。除去所述封闭缓冲液后，分注用添加了1％BSA、0.1％Tween20、0.15％Proclin150和50μg/mL MAK-33(ロシュ.ダイアグノスティックス株式会社)的PBS稀释成10ng/mL、1ng/mL或0ng/mL的浓度的POSTN781蛋白质50μL，室温静置1小时。除去所述POSTN781蛋白质溶液后，用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。分注5μg/mL的浓度的用生物素标记的26个抗体克隆，在室温静置1小时。将所述生物素标记抗体克隆的溶液除去后，分注用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。分注用1％BSA、0.135M NaCl、0.1％p-Hydroxyphenylace、0.15％Proclin150、10mg/L溴酚蓝和20mM HEPES稀释至20000倍的链霉亲和素-polyHRP40(SDT、フナコシ株式会社)各50μL，在室温静置1小时。除去所述链霉亲和素-polyHRP40溶液后，用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。分注TMB-US(Moss、コスモバイオ株式会社)各50μL，室温静置30分钟使其显色后，分注50μL的0.18M H2SO4使显色停止。用分光吸光度计测定吸光度A450/A620。选择POSTN781蛋白质10ng/mL的孔与0ng/mL的孔之间的吸光度的差为2.0以上、且抗原1ng/mL的孔与0ng/mL的孔之间吸光度的差为1.0以上的抗体组合。选择的单克隆抗体的组合如表1。[0090] 表l
[0091]
固相抗体#3-6-1#3-9-2#3-11-4#3-30-1#3-31-3#3-34-l#6-1-2
检测抗体#3-34-1#6-19-1#3-34-l#3-34-1#3-34-1#6-23-5#3-34-1
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说 明 书
#6-13-2#6+14+3#6-19-1#6-20-1#6-23-5#6-23-5#6-88-1#6-88-l#6-88-1
#6-19-1#3-34-l#3-34-1#3-34-1#3-34-1#6-19-1#3-34-1#6-3-l#6-23-5
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实施例2
[0093] 临床样本的测定
[0094] (1)对临床样本的反应性[0095] 健常者的样本，是得到了株式会社医学生物学研究所的伦理委员会组织；MBL伦理审查委员会的承认(案件号：022、承认日：2007年3月27日)，募集健常者志愿者样本，事先从提供样本的各健常者获得了书面的测定同意的。间皮瘤患者的样本是委托BMR(Bio Medical Resources(申请时刻统一为Sera Care Life Sciences Milford，MA.))而获得的(零件代码：DS-763描述：Mesothelioma Lot#BM203975～BM203986)。使用稀释至1000倍的上述血浆样本代替实施例l(7)中说明的夹心ELISA法的人骨膜蛋白纯化重组蛋白质。对于表l所示的抗体的组合，将健常者16名的血浆样本、和间皮瘤患者11名的血浆样本的测定结果示于表2。[0096] 表2
[0092]
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说 明 书
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[0097]
如表2所示，间皮瘤患者的血浆样本，与健常者的血浆样本相比，在全部组合中显
示有意义地高的测定值。另外，进行了t检验，结果p值均小于0.0005。由此显示了，骨膜蛋白蛋白质的血中浓度可以成为间皮瘤的诊断标志物。
[0099] (2)用于测定人骨膜蛋白血中浓度的夹心ELISA法的确立
[0100] 使用各种临床样本更详细地研究人骨膜蛋白血中浓度作为间皮瘤的诊断标志物的有效性之前，从表1的列表中选择固相抗体与检测抗体的最适组合。对于与作为标准物质将POSTN781的浓度从2ng/mL开始以2倍稀释进行7阶段稀释而得的稀释系列、以及完全不添加POSTN781的稀释液的反应性进行评价，作为对标准物质的反应性高且空白的吸光度低的组合的代表例，选择了固相抗体为＃6-14-3、检测抗体为＃3-34-1的组合。以下实验中均使用该抗体的组合。
[0098]
实施例3
[0102] 临床样本的测定
[0103] (1)间皮瘤患者和健常者的血浆样品中的骨膜蛋白浓度的测定[0104] 将用包含0.1M NaHCO3、0.1M Na2CO3和0.15％Proclin150(SUPELCO)的溶液稀释至10μg/mL的抗人骨膜蛋白单克隆抗体＃6-14-3，在MaxiSorp96孔板(NUNC、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)中各涂布50μL，4℃静置过夜或室温静置2小时，从而进行抗体的固相化。除去所述抗体的溶液后，分注封闭缓冲液(添加了1％BSA(Proliant、株式会社ベリタス)、0.15％Proclin150和5％蔗糖的PBS)各150μL，4℃静置过夜或室温静置2小时。除去所述封闭缓冲液溶液后，将添加了1％BSA、0.1％Tween20、0.15％Proclin150和50μg/mLMAK-33的PBS作为稀释液，调制骨膜蛋白标准物
[0101]
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质(将POSTN781从2μg/mL开始以2倍稀释进行7阶段稀释而得的稀释系列)与血浆样本(间皮瘤患者11名(BMR)、健常者16名)的500倍稀释液、和POSTN781和血浆样本均完全不添加的仅稀释液，分别在各孔中分注各50μL。室温静置1小时后，除去所述血浆样本稀释液等溶液，用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。将1μg/mL的浓度的生物素化的＃3-34-1分注50μL。室温静置1小时后，除去所述生物素化的＃3-34-1溶液，用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。将用包含1％BSA、0.135M NaCl、0.1％p-Hydroxyphenylace、0.15％Proclin150、10mg/L溴酚蓝和20mM HEPES的稀释液稀释至20000倍的链霉亲和素-poly40HRP(SDT)分注各50μL，室温静置1小时。除去所述链霉亲和素-poly40HRP溶液后，用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。分注TMB-US(Moss，INC.)各50μL，在室温静置30分钟使其显色后，分注50μL的0.18M H2SO4使显色停止。用分光吸光度计测定吸光度A450/A620，从该吸光度定量样本中所含的骨膜蛋白的浓度。图3是显示间皮瘤患者和健常者的样本各自的骨膜蛋白的浓度的分布的图。对于间皮瘤患者和健常者的样本计算t检验的p值，结果p＝0.00000066，认定了显著性差异。
[0105] (2)与可溶型间皮素相关蛋白(SMRP)测定值的相关
[0106] 对于所述(1)中测定了骨膜蛋白的浓度的血浆样本(间皮瘤患者11名(BMR)、健常者16名)，按照SMRP的浓度测定试剂盒(MESOMARK、Fujirebio Diagnostic)的制造商的说明书测定作为现有的间皮瘤的血清诊断标志物的可溶型间皮素相关蛋白(SMRP)的浓度。图4是对于间皮瘤患者的样本将同一样本的骨膜蛋白和SMRP的血浆浓度作图而得的相关图。如图4所示，骨膜蛋白和SMRP的血浆浓度的测定值没有发现相关。将骨膜蛋白的截止(cut off)值暂定为100ng/mL，则全11例确认为阳性，另一方面，SMRP采用基准的截止值1.5nM，则仅7例(64％)判定为阳性。SMRP阴性的4例(36％)也全部显示变为骨膜蛋白阳性。
[0107] 实施例4
[0108] 名古屋大学医学部呼吸器官科组所收集的患者样本的分析
[0109] 本实施例的实验获得名古屋大学医学部生命伦理审查委员会的承认(承认号：546-4、承认日：2011年7月29日)而实施。从提供样本的患者获得了书面同意。
[0110] 测定名古屋大学医学部呼吸器官科组所收集的患者样本(血浆和血清)的骨膜蛋白浓度。得到了样本的恶性胸膜间皮瘤患者中，上皮型、双相型和肉瘤型分别为14名、5名和2名。上皮型、双相型或肉瘤型的诊断按照Husain等的报告(Arch.Pathol.Lab.Med.、133：1317、2009)以苏木精-曙红染色法进行。肺癌患者为118名，除了癌以外的呼吸器官疾患、例如COPD等的患者为53名。首先，通过与实施例3相同的夹心ELISA法来测定按照常规方法从同一患者调制的血浆样本和血清样本的骨膜蛋白浓度。图5是将血浆样本与血清样本中的骨膜蛋白浓度进行比较而得的图。如图5所示，血清中的骨膜蛋白浓度与血浆中的骨膜蛋白浓度在相同患者之间显示基本相同的测定值。因此，确认了同一患者的血浆样本与血清样本之间骨膜蛋白浓度无差异。因此，以下的实施例中将血清样本用于骨膜蛋白浓度的测定。[0112] 图6是将本实施例的恶性胸膜间皮瘤、肺癌和除了癌以外的呼吸器官疾患(在图6表示为“呼吸器官疾患”)的患者样本之间的骨膜蛋白浓度的分布进行比较而得的图。如由图6可明确的那样，恶性胸膜间皮瘤患者的样本的骨膜蛋白浓度高。
[0111]
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说 明 书
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图7是显示以骨膜蛋白浓度为标志物的、相对于合并了肺癌和除了癌以外的呼吸
器官疾患的除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患患者的、本实施例的恶性胸膜间皮瘤患者样本的ROC曲线。本实施例的ROC分析的结果是，AUC为0.927。计算骨膜蛋白浓度的暂定截止值为133ng/mL时的诊断精度，结果针对恶性胸膜间皮瘤患者的灵敏度为0.810。另外，相对于除了恶性胸膜除了间皮瘤以外的呼吸器官疾患患者的特异度为0.936。因此也显示，骨膜蛋白在区别恶性胸膜间皮瘤患者与除了恶性胸膜间皮瘤以外的呼吸器官疾患患者上，是非常有效的标志物。
[0114] 将骨膜蛋白浓度的暂定截止值设为133ng/mL，按照组织型分析恶性胸膜间皮瘤患者样本，结果对于双相型，5样本中的4样本(80％)检测为阳性，对于肉瘤型，2样本中2样本(100％)检测为阳性。另一方面，SMRP对于双相型，5样本中仅1样本(25％)为阳性，对于肉瘤型，2样本中仅0样本(0％)为阳性。因此显示，即使在这些恶性度的高的组织型的患者中，检测血中骨膜蛋白的浓度上升作为诊断标志物也是有用的。[0115] 实施例5
[0116] 株化癌细胞所分泌的骨膜蛋白
[0117] 为了通过本发明的夹心ELISA法，研究各种细胞型的株化癌细胞向培养基分泌多少骨膜蛋白，准备了表3所示的株化癌细胞。
[0118] [0119]
癌种类肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌
株化癌细胞株名A431A549ChaGo-K-1DMS114NCI-H358NCI-H441NCI-H460NCI-H522NCI-H596NCI-H1299NCI-H1373NCI-H1395
编码号ATCC;CRL-1555ATCC;CCL-185ATCC;HTB-168ATCC;CRL-2066ATCC;CRL-5807ATCC;HTB-174ATCC;HTB-177ATCC;CRL-5810ATCC;HTB-178ATCC;CRL-5803ATCC;CRL-5866ATCC;CRL-5868
表3
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肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌肺癌间皮瘤间皮瘤间皮瘤间皮瘤间皮瘤大肠癌大肠癌大肠癌大肠癌肾癌肾癌肾癌
[0120]
癌种类胃癌胃癌胃癌胃癌
说 明 书
NCI-H1793NCI-H1975NCI-H2170PC-14SK-LU-1SK-MES-lNCI-H28NCI-H226NCI-H2052NCI-H2452MSTOHT-29LoVoSW480SW620ACHNCaki-1G401
ATCC;CRL-5896ATCC;CRL-5908ATCC;CRL-5928ECACC;EC90071810ATCC;HTB-57ATCC;HTB-58ATCC;CRL-5820ATCC;CRL-5826ATCC;CRL-5915ATCC;CRL-5946ATCC;CRL-2081ATCC;HTB-38ATCC;CCL-229ATCC;CCL-228ATCC;CCL-227ATCC;CRL-1611ATCC;HTB-46ATCC;CRL-1441
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株化癌细胞株名GCIYKATO IIIMKN1MKN45
编码号BRC;RCBO555ATCC;HTB-103BRC;RCB1003BRC;RCB1OO1
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胃癌胃癌胰癌胰癌胰癌胰癌胰癌胰癌肝癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌乳癌前列腺前列腺癌膀胱癌子宫颈癌子宫颈癌
说 明 书
MKN74SCHKLM-1MIAPaCa-2PANC-1PK-1PK-45PPK-59HepG2BT-20BT-474HT-549HCC-1395HCC-1937MCF7MDA-MB-231SK-BR-3T-47DZR-75-122Rv1PC-3T24HelaSiHa
BRC;RCB1OO2HSRRB;JCRBO251BRC;RCB2138ATCC;CRL-1420ATCC;CRL-1469BRC;RCB1972BRC;RCB2141BRC;RCB1901BRC;RCB1886ATCC;HTB-19ATCC;HTB-20ATCC;HTB-122ATCC;CRL-2324ATCC;CRL-2336ATCC;HTB-22ATCC;HTB-26ATCC;HTB-30ATCC;HTB-133ATCC;CRL-1500ATCC;CRL-2505ATCC;CRL-1435ATCC;HTB-4ATCC;CCL-2ATCC;HTB-35
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卵巢腺瘤神经胶质瘤伯基特淋巴瘤伯基特淋巴瘤
白血病，急性T淋巴母细胞性T细胞性白血病
[0121] 癌种类T细胞性白血病T细胞性白血病前骨髓性白血病单核细胞性白血病
来源子淋巴瘤的成单核细胞样细胞红细胞性白血病原巨核细胞性白血病
来源子脐带的正常血管内皮细胞[0122]
说 明 书
SK-OV-3T98GDaudiRajiCCRF-CEMJurkat
ATCC;HTB-77ATCC;CRL-1690ATCC;CCL-213ATCC;CCL-86ATCC;CCL-119ATCC;TIB-152
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株化癌细胞名MOLT-4PEERHL-60THP-1U-937HELMEG-01HUVEC
编码号BRC;RCBO206BRC;RCB1879ATCC;CCL-240ATCC;TIB-202ATCC;CRL-1593.2ATCC;TIB-180ATCC;CRL-2021ATCC;CRL-2873
表中的编码号简称的说明如下。
[0123] ATCC：American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)BRC：RIKEN BioResource Center(日本理化研究所种质资源中心)HSRRB：Health Science Research Resources Bank(HS研究资源库)
[0124] 图8是显示将表2所示的株化癌细胞的培养上清中的骨膜蛋白在固相抗体＃6-14-3/检测抗体＃3-34-1的测定体系中进行测定的结果的图。在来源于间皮瘤的癌细胞株中，5种中的3种(60％)检测到高浓度的骨膜蛋白(图9)。另一方面，除此之外，虽然在肺癌、部分乳癌中确认了若干表达，但其表达量不足4分之1，在大肠癌、肾癌、胃癌、胰癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、B细胞系和/或T细胞系、单核细胞系、巨核细胞系的血液癌、来源于脐带血的血管内皮细胞中确认了不表达。因此，确认了骨膜蛋白的表达和培养液中的存在，在来源于间皮瘤的癌细胞株中是相当特异的。[0125] 实施例6
[0126] 胸水样本的测定
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为了研究作为临床样本，除了血浆样品和血清样品之外，是否还可以利用胸水样
品，测定了间皮瘤患者1名、和作为对照的肺腺癌患者1名的胸水样品中的骨膜蛋白浓度。本实施例的实验也获得名古屋大学医学部生命伦理审查委员会的承认(承认号：546-5、承认日：2012年3月27日)而实施。从提供样本的患者获得了书面同意。
[0128] 得到了样本的恶性胸膜间皮瘤患者是双相型。通过与实施例3和4相同的夹心ELISA法来测定按照常规方法从同一患者调制的血浆样本、血清样本和胸水样本的骨膜蛋白浓度。采取的胸水样本用与血浆样本和血清样本相同的方法调制。因为胸水样本中的骨膜蛋白浓度高于血清样本和血浆样本，所以将16000倍稀释液供于与固相抗体的结合。[0129] 其结果是，该间皮瘤患者的血浆样本、血清样本和胸水样本的骨膜蛋白浓度分别为247.9ng/mL、279.2ng/mL和6928.7ng/mL。同时测定的所述肺腺癌患者的血浆样本、血清样本和胸水样本的骨膜蛋白浓度分别为47.4ng/mL、53.6ng/mL和1938.4ng/mL。所述间皮瘤患者的血清样本的骨膜蛋白浓度超过实施例4中设定的血清样本中的骨膜蛋白浓度的暂定截止值133ng/mL，在利用血清样本中的骨膜蛋白浓度的诊断中为阳性。胸水样本中的骨膜蛋白浓度在所述间皮瘤患者中、所述肺腺癌患者中均比血浆样本和血清样本的骨膜蛋白浓度高了数十倍。并且对于胸水样本，所述间皮瘤患者的骨膜蛋白浓度与所述肺腺癌患者相比也高了3倍以上。因此显示，对于胸水样本，也可以实施使用本发明的骨膜蛋白浓度的间皮瘤的检查方法。[0130] 产业可利用性
[0131] 如本说明书中说明的那样，根据本发明的间皮瘤的检查方法，对于上皮型、双相型和肉瘤型的任一种恶性胸膜间皮瘤都能够检测。由此，能够不强加活检等对患者大的负担地，早期诊断间皮瘤，从而可以较大贡献于间皮瘤患者的早期治疗。另外，在对高达数百万人的石棉曝露者筛选间皮瘤方面，能够提供可靠性高、简便且廉价的检查法，因此，石棉曝露者可以轻松地接受重复检查，能够进行间皮瘤患者的早期发现治疗，较大贡献于治愈率的提高。进而，还能够由从显示胸积水症状的患者采取的胸水来诊断间皮瘤。
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图2A
图2B
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