水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

张󰀁恭1,刘立峰1,周󰀁维2,王海光2,马峙英1

(1.河北农业大学农学院,河北保定󰀁071001;2.中国农业大学,农业部作物基因组学与遗传

改良重点实验室,北京󰀁100094)

󰀁󰀁摘要:利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNATargetFinder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BLAST(Basiclocalalignmentsearchtool),最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列。选择其中的2条,通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIA1301质粒构建了RNA干扰载体pASV1301󰀁1,pASV1301󰀁2,并成功地转化EHA105农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。

关键词:水稻;RNA干扰;载体构建;抗病毒

中图分类号:S432.4+1󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁文章编号:1000-7091(2008)04-0010-04

ConstructionofExpressionVectorforAntiStripe

VirusofRicebyRNAInterference

ZHANGGong1,LIULi󰀁feng1,ZHOUWei2,WANGHai󰀁guang2,MAZhi󰀁ying1

(1.CollegeofAgronomy,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding󰀁071001,China;2.KeyLaboratoryofCropGenomicsandGeneticImprovementofMinistryofAgriculture,

ChinaAgriculturalUniversity,Beijing󰀁100094,China)

Abstract:ByusingthesequenceofstripeviruspublishedonlineandthesoftwareofsiRNATargetFinder,weob󰀁tained168siRNAsegments󰀂AfterBLASTScanofricegenome,6segmentswereselectedand2werechemicallysynthe󰀁sizedandusedtoconstructofexpressionvector(pASV1301󰀁1,pASV1301󰀁2)intergratedwithpCAMBIA1301plasmid󰀂TherecombinedplasmidwassuccessfullytransformedintoagrobacteriumofEHA105,whichlayafoundationforthetransfor󰀁mationofriceandthepreventionofstripevirusdiseaseofricebyRNAinterference.

Keywords:Rice;RNAinterference;Constructionofexpressionvector;Anti󰀁virus󰀁󰀁RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指RNA导入细胞后被切割成21~23个核苷酸长度的短核苷酸双链,在其他作用因子的参与下能够特异的与其同源的mRNA结合并导致其降解,从而使内源基因不能表达,导致内源基因的沉默[1,2]。RNAi所具有的特异性、稳定性、高效性以及不改变基因组的遗传组成等特性为人们研究基因组学和植物的遗传改良提供了强有力的手段[3]。

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的一种病毒病,对水稻的危害极大,被称为水稻的癌症。近年来,水稻条纹叶枯病在很多稻区大面积发生,给水稻生产造成重大损失

[4]

费大量人力、物力,造成环境污染,并且防治效果不

理想。鉴于水稻条纹叶枯病毒序列和水稻基因组的测序工作已完成,本研究针对水稻条纹叶枯病毒基因序列设计了RNA干扰序列,构建了RNAi载体,并成功地转化农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。

1󰀁材料和方法

1󰀂1󰀁质粒和菌株

pCAMBIA1301质粒由中国农业大学农业部作物基因组学与遗传改良重点实验室惠赠;EHA105农杆菌由本实验室保存。

。水稻条纹叶枯病的防治要耗

收稿日期:2008-04-11

基金项目:河北省自然科学基金资助项目(C2006000447)

作者简介:张󰀁恭(1972-),男,河北廊坊人,副研究员,在读硕士,主要从事作物遗传育种研究。通讯作者:刘立峰(1966-),男,河北宁晋人,研究员,农学博士,主要从事作物分子育种研究。

4期张󰀁恭等:水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

11󰀁

1󰀂2󰀁培养基

LB培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl5g/L,pH7󰀂0,固体培养基加15g/L琼脂。

YEB培养基:牛肉浸膏5g/L,酵母提取物1g/L,胰蛋白胨5g/L,蔗糖5g/L,MgSO4󰀂H2O0󰀂5g/L,pH7󰀂0,固体培养基加15g/L琼脂。

诱导培养基:NB+2,4󰀁D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L,pH5󰀂8。

共培养基:NB+2,4󰀁D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+乙酰丁香酮100mg/L+葡萄糖10g/L,pH5󰀂8。

筛选培养基:NB+2,4󰀁D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+G418150mg/L+头孢霉素250mg/L,pH5󰀂8。

1󰀂3󰀁RNA干扰片断的获得及化学合成

根据http://www󰀂ncbi󰀂nlm󰀂nih󰀂gov网站公布的水稻条纹叶枯病毒基因的开放阅读框,利用siRNATargetFinder软件预测siRNA干扰片段,利用这些片段在水稻基因组中BLAST,获得与水稻基因组完全不匹配的干扰序列。干扰序列的化学合成在北京华大基因研究中心,其中包括第一链、第二链及预先设计好的含有Bgl 和BstE 酶切位点的粘性末端及中间的发卡结构(loop)。

1󰀂4󰀁pCAMBIA1301质粒线性载体的获得

将保存在大肠杆菌中的pCAMBIA1301质粒接种于LB液体培养基中,摇菌过夜。次日用质粒小提试剂盒(购于天为时代)提取质粒,然后用Bgl 和BstE 酶切,50󰀁L的酶切体系,加质粒43󰀁L,BSA0󰀂5󰀁L,buffer5󰀁L,Bgl 1󰀂25󰀁L,加样后3000r/min离心30s。37!酶切2h,之后加BstE 1󰀂25󰀁L,60!酶切2h。往酶切体系中加入10󰀁Lloadingbuffer电泳1h。看到清晰的2条带,用胶回收试剂盒回收大片段,回收后的溶液即为pCAMBIA1301的线性质粒载体。1.5󰀁退火连接

取24󰀁L等量正反义链混合物,加1󰀁LDMSO,0󰀂9󰀁LPCR缓冲液。94!10min,然后关掉PCR仪使其自然冷却,10󰀁L体系加0󰀂37󰀁LPCR缓冲液。往退火双链中加入线性载体,T4连接酶和buffer放冰箱中4!,连接14~16h(过夜)。

1.6󰀁转化DH5󰀂感受态细胞并对其进行酶切检测

将DH5󰀂感受态细胞从冰箱(-70!)取出,冰上溶化每10󰀁L连接产物加入50~100󰀁LDH5󰀂冰浴30min42!热激90s,置于冰上2min,再加800󰀁LLB液体培养基,振荡培养1h。3500r/min离心5min,吸取800󰀁L上清,重悬菌体涂布于加了卡那的LB固体培养基中,倒置培养过夜。挑取单菌落,

接种于加了卡那的LB液体培养基37!振荡培养过夜。用质粒小提试剂盒提取转化后的质粒并对质粒进行酶切电泳检测,分别用Nhe∀和Nco∀两种酶(购于上海生物工程技术服务有限公司)。20󰀁L体系加Nhe∀1󰀁L,10mol/Lbuffer2󰀁L,质粒10󰀁L,水7󰀁L。酶切1h后加NcoI、buffer和BSA,继续酶切1h,然后进行电泳检测。1󰀂7󰀁转化农杆菌

采用EHA105农杆菌,用CaCl2法制备农杆菌感受态细胞。用冻融法[5,6]将重组质粒转化到农杆菌EHA105中。

将EHA105农杆菌接种于3mLYEB液体培养基(含有利福平)中,摇菌过夜。再按1#100的比例将菌液接种于YEB液体培养基中,28!摇菌至OD值为0󰀂4,将菌液冰浴30min、4!、5000r/min离心5min,弃上清,用20mmol/LCaCl2重悬,4!、5000r/min离心5min,再用20mmol/LCaCl2重悬,冰浴备用。

将重组质粒分别加入农杆菌感受态细胞中,冰浴30min,液氮速冻5min,37!水浴5min,加YEB液体培养基1mL,28!震荡培养3~5h,然后将菌液涂布于YEB平板(含有利福平和卡那),28!培养48h,菌落长出。挑取单菌落接种于YEB液体培养基(含有利福平和卡那)中,振荡培养过夜,将培养好的菌液放于冰箱中备用。

2󰀁结果与分析

2󰀂1󰀁RNA干扰片段和hairpinRNA序列的获得

利用http://www󰀂ncbi󰀂nlm󰀂nih󰀂gov查得水稻条纹叶枯病毒的4条RNA序列,分别为RNA1和RNA3链中的外壳蛋白(Coatprotein)基因及RNA酶(RNAPolymerase)基因的开放阅读框为目标链,利用siRNATargetFinder在线软件预测siRNA干扰片段,共获得168条。把这些片段在水稻基因组中BLAST,获得与水稻基因组完全不匹配的干扰片段6条。依据干扰序列中碱基的GC含量在40%~50%活性较高的原则,最后确定2条干扰序列,其序列分别为Targetsequence128:CATGTCGGAACAGACCAAGAA,Targetsequence139:CCTCGACAAAGTGAGAGGTAA。对照(CK)干扰片段由Targetsequence139的碱基顺序打乱,经过与水稻基因组的BLAST后获得AGTCAGCCATGTATCTGTGCT。HairpinRNA由Targetsequence128,139翻译成反向互补的2段DNA片段󰀁12

华󰀁北󰀁农󰀁学󰀁报23卷

后,一端加上Bgl酶切位点残基GATCT,另一端加上BstE酶切位点残基GTAACC,中间加上一段7个

碱基或9个碱基的茎环(loop)获得。最终合成的3条链为:

Sequence1Sense:5∃󰀁GATCCATGTCGGAACAGACCAAGAATCAAGAGCTTGGTCTGTTCCGACATGAA󰀁3∃

Antisense:5∃󰀁GTAACTTCATGTCGGAACAGACCAAGCTCTTGATTCTTGGTCTGTTCCGACATG󰀁3∃Sequence2

Sense:5∃󰀁GATCCCTCGACAAAGTGAGAGGTAATTGCTTGAAACCTCTCACTTTGTCGAGGAA󰀁3∃

Antisense:5∃󰀁GTAACTTCCTCGACAAAGTGAGAGGTTTCAAGCAATTACCTCTCACTTTGTCGAGG󰀁3∃对照CK

Sense:5∃󰀁GATCCCCAAGATCGATGGTAGAGAATTGCTTGAACGATCTAAGTCTCTGACTCAG󰀁3∃

Antisense:5∃GTAACCTGAGTCAGAGACTTAGATCGTTCAAGCAATTCTCTACCATCGATCTTGGG󰀁3∃

左边下划线标注的是酶切位点残基,中间下划线标注为茎环序列。

2󰀂2󰀁重组质粒的获得及检测

上述3条hairpinRNA序列与pCAMBIA1301质粒经过Bgl 、BstE 酶切切去了GUS的线性载体退火连接,即可得到重组质粒载体pASV1301󰀁1pASV1301󰀁2及对照pASV1301󰀁3(图1)。用含有卡那霉素的培养基能筛选出重组的质粒,但不能排除假阳性克隆。再对重组质粒进行NcoI和NheI双酶切检测,由于pCAMBIA1301有2个NheI酶切位点,经过Bgl 、BstE 酶切后,BstE 酶切附近的NheI酶切位点被切除,即重组质粒为2条带;而非重组质粒经过NcoI和NheI酶切后电泳检测为3条带,这样可排除假阳性克隆,获得带有目的序列的重组质粒(图2)。

图1󰀁干扰载体pASV1301󰀁1的RNAi结构单元示意图Fig.1󰀁SchematicdiagramofRNAiconstructsofpASV1301󰀁1

3󰀁讨论

3󰀂1󰀁RNA干扰片断的获得

RNA干扰片断的获取主要有2条途径:一是体外转录法,即利用PCR扩增目的基因的cDNA片段的方法;另一个是利用目的基因的靶序列设计siRNA序列,然后化学合成。第一种方法比较经济,主要用

白箭头所指2条带为重组质粒,黑箭头所指3条带为假阳性克隆

TwobandsplasmidsweretherecombinedplasmidpCAMBIA1301andthe3bandswerethenegativeones

于植物功能基因的干扰,但通过这种方法合成的siRNA反应规模始终有一定的限制;使用化学合成法可以省去大量繁琐的工作,主要用于动物功能基因的干扰但高昂的价格限制了其广泛的应用[7]。本研究综合了上述2种方法,利用靶序列设计siRNA化学合成、内源转录的方法,从而实现了siRNA的持续扩增,为RNAi的持续、高效表达奠定基础。3󰀂2󰀁RNA干扰片断的大小

目前,在植物上RNA干扰一般采用如下体系:PCR扩增目的基因的cDNA片段,分别以正向和反向插入双元表达载体,由强启动子驱动转录,正反片段之间由一段内含子序列隔开。该系统在植物细胞中转录产生发卡结构,引发RNA干扰[8]。经过PCR图2󰀁重组质粒NcoI/NheI酶切电泳检测Fig.2󰀁Restrictionanalysisoftherecombined

plasmidpCAMBIA1301

2󰀂3󰀁转化农杆菌的获得

EHA105农杆菌抗利福平。重组质粒pASV1301󰀁1,pASV1301󰀁2,pASV1301󰀁3转化农杆菌后,用含有卡那霉素和利福平培养基进行筛选。在含有卡那霉素和利福平培养基平板上长出的菌斑即为阳性克隆,表明重组质粒已转化农杆菌。

4期张󰀁恭等:水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

13󰀁

扩增目的基因的cDNA片段一般都在几百bp。李小平等以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基

因,在rlpk2󰀁cDNA序列3∃选择312bp作为构建RNAi的序列。彭昊等[10]以水稻一个编码RLK的基因为目标基因,通过PCR扩增得到452bp的RNAi片段,并构建了RNAi载体。但也有利用小片断(21~25bp)成功进行植物RNA干扰的报道

[11]

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。本

试验采用21bp的短片段加7~9个bp茎环再加酶切位点,体外化学合成了50几个bp的RNA干扰片

断,构建了RNA干扰载体并成功转化农杆菌。3󰀂3󰀁RNAi在植物抗病毒中的应用

利用RNAi赋予植物对病毒抗性的原理,人们可以人为地将与病毒同源的dsRNA导入植物体内,使其引发植物体内的RNAi机制,对病毒致病基因进行特异的切割降解,阻止病毒的复制扩散,从而保护植物不受病毒的侵害。Wang等利用大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)pav株系的复制酶基因片断的反向重复序列载体(hpBYDVpol)转化大麦,获得pav免疫植株,ELISA检测和田间接种均未监测到病毒。美国加州大学戴维斯分校的Escobar等[14]利用RNAi技术有效地抑制了土壤农杆菌引起的冠瘿的发生。本实验室正在利用已构建的RNA干扰载体、农杆菌介导转化水稻愈伤组织,以期为利用RNAi防治水稻条纹叶枯病提供技术支持。参考文献:

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