绿茶多酚诱导肝癌细胞凋亡时Caspase-3蛋白活性与mRNA的变化

维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽农业科学。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａｇｒｉ、Ｓｅｉ、２００８，３６（２３）：９９０７—９９０９，９９９７　责任编辑孙红忠责任校对傅真治　绿茶多酚诱导肝癌细胞凋亡时Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白活性与ｍＲＮＡ的变化　梁清清　，石英　，李卫国　（１．河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７；２．新乡医学院免疫细胞实验室，河南新乡４５３００７）　摘要［目的］研究绿茶多酚（ＥＧＣＧ）诱导肝癌细胞Ｈｅｐ—Ｇ　凋亡过程中半胱天冬酶一３（Ｃａｓｐａｓｅ一３）蛋白活性与ｍＲＮＡ的变化。［方法］　１００　ｒａｇ／Ｌ的ＥＧＣＧ处理Ｈｅｐ—Ｇ，细胞４８　ｈ，ＤＡＰＩ染色观察细胞形态学，用Ｍ　ｒｒ检测ＥＧＣＧ对Ｈｅｐ—Ｇ，细胞生长的影响，流式细胞技术　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ　ＰＩ法检测不同浓度ＥＧＣＧ诱导细胞的凋亡率，分光光度法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性，用半定量ＲＴ—ＰＣＲ法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３的　ｍＲＮＡ变化。［结果ｌ１００　ｍｇ／Ｌ的ＥＧＣＧ作用Ｈｅｐ—Ｇ，细胞４８　ｈ后，荧光显微镜观察到细胞出现核碎裂和凋亡小体；ＭＴＩ＂法检测到　ＥＧＣＧ对肝癌细胞Ｈｅｐ—Ｇ，的生长均有显著抑制作用，呈浓度依赖性；Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ　ＰＩ法检测到不同浓度的ＥＧＣＧ作用与肝癌细胞　Ｈｅｐ—Ｇ，后，凋亡率较对照组明显升高，并随诱导浓度的增加而增加；不同浓度的ＥＧＣＧ处理组和不同时间ＥＧＣＧ处理组的Ｃａｓｐａｓｅ一３活　性和ｍＲＮＡ表达量均比对照组明显升高。［结论］Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白活性与ｍＲＮＡ上调是ＥＧＣＧ诱导肝癌细胞凋亡的的重要原因和机制。　关键词绿茶多酚；肝癌细胞Ｈｅｐ—Ｇ，；细胞凋亡；半胱天冬酶；蛋白活性　中图分类号Ｑ９５４　文献标识码Ａ　文章编号０５１７—６６１１（２００８）２３—０９９０７—０３　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＥＧＣＧ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｈｅｐ—Ｇ　ｃｅＨｓ　ＬＩＡＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｑｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ，Ｈｅｎａｎ　４５３００７）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｌ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｌ　Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＥＧＣＧ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ．　　１Ｍｅｔｈｏｄ　Ｊ　Ｈｅｐ—Ｇ，ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＧＣＧ　１００　ｍｇ／Ｌ　ｆｏｒ　４８　ｈ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ＤＡＰＩ　ｐｉｇｍｅｎｔａ—　ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＣＧ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｅｐ—Ｇ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｖ　Ｍ１ｒｒ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅ　ｂｙ　ａ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ　ＰＩ）．Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　１ｅｖｅ１　ｗａｓ　ｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ａ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．１　Ｒｅｓｕｈ　ｌ　Ａｔｉｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＧＣＧ　１００　ｍ　Ｌ　ｆｏｒ　４８　ｈ，ｔｈｅ　Ｈｅｐ　Ｇ。ｃｅｌｌｓ　ｄｅｃｌｉｎｅｄ　ｉｔｓ　ｓｈａｐｅ　ｗｉｔｈ　ｒｅｇａｒｄ　ｔｏ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｏｄｙ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＥＧＣＧ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐ—Ｇ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｄｏｓｅ　ｂｙ　ＭＴＩ＂ａｓｓａｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏ１．ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｈｅｐ—Ｇ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＧＣＧ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｄｏｓｅ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　１ｅｖｅ１　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＧＣＧ—ｔｒｅａｔｅｄ　Ｈｅｐ—Ｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏ１（Ｐ＜０．Ｏ１）．１　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｌ　ＥＧＣＧ　１ｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ—Ｇ，ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　１ｅｖｅ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ＥＧＣＧ；Ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　Ｈｅｐ—Ｇ，；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃａｓｐａｓｅ一３：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　绿茶多酚（ＥＧＣＧ）是绿茶中含量最高的一种儿茶素，约　占绿茶儿茶素总量的５０％，具有很强的防癌抗癌作用，具体　机制可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关…。资料显示半胱天　冬酶一３（Ｃａｓｐａｓｅ一３）与细胞凋亡密切相关　，它的激活可导　养基（Ｓｉｇｍａ），在３７℃、５％ＣＯ，条件的培养箱中培养，２～３　ｄ　换液传代。　１．２．２　ＤＡＰＩ染色细胞形态观察。收集对数生长期的Ｈｅｐ—　Ｇ：细胞１　ｘ　１０　个／ｒｎｌ，２４　ｈ贴壁后，设对照和加入ＥＧＣＧ培　致细胞发生不可逆的凋亡。该研究采用分光光度法测定不　同浓度ＥＧＣＧ诱导肝癌细胞Ｈｅｐ—Ｇ　凋亡过程中Ｃａｓｐａｓｅ一３　蛋白活性和ＲＴ—ＰＣＲ检测基因表达的改变，以探讨其凋亡机　制和通路。　１材料与方法　１．１材料　养液１００　ｍｇ／Ｌ培养４８　ｈ，按照ＤＡＰＩ试剂盒说明进行染　色　，荧光显微镜下观察拍照。　１．２．３　ＭＴＹ比色法。将常规培养的Ｈｅｐ—Ｇ：细胞用胰蛋白　酶消化后制成１　ｘ　１０。个／ｒｎｌ的单细胞悬液，加入９６孔细胞　培养板中，每孔０．２　ｒｎｌ　Ｊ，培养２４　ｈ后，换不同浓度的ＥＧＣＧ　培养液，每浓度设６复孔，培养４８　ｈ。实验终止前４　ｈ每孔加　１．１．１细胞株。人肝癌Ｈｅｐ—Ｇ，细胞由河南省新乡医学院　免疫细胞实验室提供。　１．１．２主要试剂与仪器。ＥＧＣＧ（成都普瑞法生物公司提　入１０　ｌ浓度５　ｍｇ／ｍｌ的ＭＩＴ液继续培养４　ｈ。小心吸去上　清液后每孔加入ＤＭＳＯ　１５０　ｌ，避光在振荡器上轻轻振荡５　ｍｉｎ后，酶标仪测定各孔的吸光度值（　：），按下式计算各用　药组的生长抑制率　（％）：　供），用双蒸水配制成贮存液，０．２２　ｍ微孔滤膜过滤除菌分　装后于一２（】℃保存备用；ＤＡＰＩ试剂盒，ＭＴＹ（Ｓｉｇｍａ）溶于　ＰＢＳ中，浓度为５　ｍｇ／ｍｌ，过滤除菌后４℃避光保存；Ａｎｎｅｘｉｎ　（％）＝（１一用药组平均Ａ　：／对照组　）ｘ　１００％　１．２．４　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ．ＦＩＴＣ　ＰＩ检测细胞凋亡。按Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—　Ｖ—ＦＩＴＣ　ＰＩ凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物）；Ｃａｓｐａｓｅ一３分光　光度法检测试剂盒（凯基生物）；ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒（ＡＭＶ）（凯　基生物）。荧光思微镜，流式细胞仪，ＣＯ：恒温培养箱，酶标　仪，ＰＣＲ仪。　１．２方法　Ｆ１ＴＣ　ＰＩ凋亡检测试剂盒说明书所述步骤操作　：将对数生　长期的Ｈｅｐ—Ｇ：细胞１　ｘ１０。个／ｒｎｌ接种于２５　ｃｍ　培养瓶中，　２４　ｈ后加入新鲜配置的浓度分别为２５、５０、１００、２００　ｍｇ／Ｌ的　ＥＧＣＧ培养液，加药４８　ｈ后用胰酶消化细胞，移人试管中，　１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ沉淀细胞，弃上清液后用冷的ＰＢＳ　１．２．１细胞培养Ｈｅｐ—Ｇ，细胞用含１０％小牛血清（杭州四　洗涤２次。将收集的细胞重悬于２００　ｌ的结合缓冲液中，加　入１０　ｌ　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ和５　１的ＰＩ，轻轻混匀后避光室温　反应１５　ｍｉｎ。反应结束后再加入２００　ｌ结合缓冲液，流式细　胞仪上样检测。　１．２．５　Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白活性检测。收集对数生长期细胞，调　季青）、１０　Ｕ／ｎｉｌ青霉素和１００　Ｕ／ｎｉｌ链霉素的ＲＰＭＩ　１　６４０培　基金项目　河南省自然科学基金项目（０６２４４１００２９）。　作者简介梁清清（１９８ｌ一），女，广西兴安人，硕士研究生，研究方向：　动物生理及病理。＊通讯作者，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｗｇ０６１８＠ｈｅ—　ｎａｏｏｕ．ｅｄｕ．ｃｒｌ。　收稿日期２００８￣５—１６　整细胞浓度为１　ｘ　１０。个／ｒｎｌ，培养２４　ｈ待细胞贴壁后分别于　维普资讯 http://www.cqvip.com

安徽农业科学　２００８盎　ＥＧＣＧ培养液０、２５、５０、１００、２００　ｍｇ／Ｌ培养４８　ｈ，另外收集对　明进行，体系体积为２０．０　ｌ。４２℃保温１　ｈ，然后７０℃保温　１５　ｍｉｎ，一２０℃保存。　（４）ＰＣＲ扩增目的基因。各基因特异的上、下游引物设　数生长期细胞培养于ＥＧＣＧ　１００　ｍｇ／Ｌ，分别在０、１２、２４、４８、　７２　ｈ后收集细胞于１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤细胞　２次。在收集的沉淀样本细胞中加入５０　ｌ冰冷Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　计用ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件，Ｃａｓｐａｓｅ一３引物序列（上游引物：５　一　ＧＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴ　ｒｒＧＴ一３　，下游引物：５　一ＴＧ，ＩＴｌ＿ｒＣＣＣＴ—　（注意：使用前每５０　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ加入０．５　ｌ　ＤＴＹ），吹打均　匀；置冰上裂解２０～６０　ｍｉｎ，其间涡旋振荡３～４次，每次１０　Ｓ，１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１　ｍｉｎ，小心吸取上清液（含裂解的蛋白　ＧＡＧＧＴ１ＴＧＣ一３，２８０　ｂｐ），分别以对照组和ＥＧＣＧ诱导组的　逆转录产物ｃＤＮＡ为模板，１３一ａｃｔｉｎ（３５９　ｂｐ）为内参进行ＰＣＲ　质）转移至新的管中，并放置冰上待用，取少量上清液（１～２　），常规方法（Ｂｒａｆｏｒｄ法）测定其中的蛋白浓度；吸取５０　ｌ　扩增，琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ产物，并照相。ＰＣＲ反应体　系组成：ｃＤＮＡ模板２．０　ｌ，上、下游引物各１．０　ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５　ｌ，ｄＮＴＰｓ（１０　ｍｍｏ￣Ｌ）１．０　ｌ，ＭｇＣ１２　４．０　ｌ，　含１００～２００　ｇ蛋白的细胞裂解上清液，加人５０　ｌ的２×　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ和５　ＬＬｌ　Ｃａｓｐａｓｅ－３　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，于３７℃避光孵育　灭菌双蒸水３６＞５　ｌ，１０×Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５．０　ｌ。总体积５０．０　ｌ，　４　ｈ；用酶标仪在Ａ＝４０５　ｎｍ测定其吸光值。通过计算得出　混匀，２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２０　Ｓ后进行ＰＣＲ扩增。扩增条件：９４　Ｃａｓｐａｓｅ一３的活性，Ｃａｓｐａｓｅ一３活性＝０Ｄ４ｏ５　／ＯＤ５‰　。　℃预变性５　ｍｉｎ；９４℃变性３０　Ｓ，６１℃退火４５　Ｓ，７２℃延伸３０　１．２．６逆转录ＰＣＲ（ＲＴ—ＰＣＲ）检测Ｃａｓｐａｓｅ一３。　Ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。　（１）细胞处理。①１个时间点（２４　ｈ），设５个ＥＧＣＧ浓　（５）统计学处理。以上实验均重复３次，所有数据以均　度：０、２５、５０、１００、２００　ｍｇ／Ｌ。②同一浓度（１００　ｍｇ／Ｌ），设５个　数±标准差表示，采用ＳＰＳＳ　１１．０统计学软件分析，组间均　不同的时间点：０、６、１２、４２、４８　ｈ。　数比较采用单因素方差分析。　（２）总ＲＮＡ提取。收集５×１０。个／ｍｌ细胞于离心管中，　２结果与分析　离心去上清液；加人ＴＲＩｚｏｌ试剂，按说明书操作步骤提取　２．１细胞形态学改变１００　ｍｇ／Ｌ　ＥＧＣＧ作用Ｈｅｐ—Ｇ２细胞　ＲＮＡ，使用分光光度仪检测，要求Ａ　：　比值在２．０　４８　ｈ后，ＤＡＰＩ染色，荧光显微镜下可见典型的凋亡形态学改　左右。　变，表现为核染色质收缩、碎裂成块状弥散在胞浆中，并可见　（３）逆转录合成。逆转录聚合酶链（ＲＴ—ＰＣＲ）反应：采　凋亡小体（图１）。　用凯基公司的ＲＴ—ＰＣＲ反应体系　。逆转录反应严格按说　２．２　ＥＧＣＧ对人肝癌细胞Ｈｅｐ－Ｇ：生长的抑制作用　表１　４８　ｈ对照组（×２０）４８　ｈ　ＥＧＣＧ组（×２０）　Ｇ：ｎｔｒｏＬ　ｇｒｏｕｐ　ａｔ　４８　ｈ　ＥＧＣＧ　ｇｒｏｕｐ　ａｔ　４８　ｈ　图１　１００　ｍｗ＇Ｌ　ＥＧＣＧ处理Ｈｅｐ—Ｇ：细胞４８　ｈ的形态学改变　Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｈｅｐ－Ｇ２　ｃｅｌｌ　ａｔ　４８　ｈ　ｕｎｄｅｒ　１００　ｍｇ／Ｌ　ＥＧＣＧ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　显示，不同浓度ＥＧＣＧ作用于Ｈｅｐ—Ｇ：细胞４８　ｈ后，对Ｈｅｐ—　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣＰＩ双染色法检测细胞凋亡，结果：ＥＧＣＧ浓度　Ｇ：细胞生长有不同程度的抑制作用，且有明显的浓度依赖　为０、２５、５０、１００、２００　ｍｇ／Ｌ时的早期细胞凋亡率分别为　性。当浓度大于５０　ｍｇ／Ｌ以上时，对细胞生长均有显著的抑　３．２９％、１３．０６％、１６．６５％、３０．１６％、４２．３０％，显示随ＥＧＣＧ　制作用。　浓度的增加细胞凋亡率显著增高，且都高于对照组。　表１不同浓度ＥＧＣＧ处理对Ｈｅｐ—Ｇ：生长的抑制作用　２．４　Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白活性检测０、２５、５０、１００、２００　ｍｌ／Ｌ的　Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＥＧＣＧ　ＥＧＣＧ作用Ｈｅｐ—Ｇ：细胞，４８　ｈ后Ｃａｓｐａｓｅ－３活性分别为１４２．０　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｏｎｔｈｅＨｅｐ－Ｇ２　ｇｒｏｗｔｈ　±４．０、２２９．０±４．０、２９４．５±７．５、４８９．０±７．０、５６８．５±５．５，与　对照组相比均明显升高（Ｐ＜０．Ｏ１）。　表２显示，ＥＧＣＧ作用Ｈｅｐ—Ｇ：细胞后，不同时间Ｃａｓｐａｓｅ　３活性与对照组相比均明显升高（Ｐ＜０．０１）。　２．５　Ｃａｓｐａｓｅ一３的ｍＲＮＡ检测　不同浓度ＥＧＣＧ作用的　Ｃａｓｐａｓｅ－３　ｍＲＮＡ和对照组相比均出现了明显上调，具有统计　注：％表示Ｐ＜０．０１。　学意义（Ｐ＜０．０１），Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｍＲＮＡ的表达量随着浓度的升　Ｎｏｔｅ：　ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　Ｐ＜０．０１．　高而增高，结果见图２。　２．３　ＥＧＣＧ诱导Ｈｅｐ—Ｇ：细胞凋亡情况用流式细胞仪　不同时间点的Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｍＲＮＡ和对照组相比均出现了　维普资讯 http://www.cqvip.com

３６卷２３期　梁清清等绿茶多酚诱导肝癌细胞凋亡时Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白活性与ｍＲＮＡ的变化　明显上调，Ｃａｓｐａｓｅ．３　ｍＲＮＡ的表达量随着时间的延长而增　高，结果见图３。　，　细胞仪证实ＥＧＣＧ能诱导Ｈｅｐ．Ｇ２细胞凋亡，随药物作用浓　度的增大细胞凋亡率逐渐增加，具有明显的浓度依赖性。另　外还对ＥＧＣＧ诱导Ｈｅｐ．Ｇ，细胞凋亡的机制作了探讨。通过　对凋亡的执行者Ｃａｓｐａｓｅ．３活性蛋白与ｍＲＮＡ的表达进行检　测，结果显示经药物处理的Ｈｅｐ．Ｇ　细胞Ｃａｓｐａｓｅ．３蛋白活性　表２不同时间ＥＧＣＧ（１００　ｍｇ／Ｌ）诱导Ｈｅｐ—Ｇ２细胞凋亡时　Ｃａｓｐａｓｅ－３活性变化　Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｈｅｐ—Ｇ２　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＥＧＣＧ（１００　ｍｇ／Ｌ）ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｉｔｍｅ　００Ｏ　ｂｐ　２５Ｏ　ｂｐ　１００　ｂｐ　注：Ｍ为ｍａｒｋｅｒ；１为内参；２为对照（２４　ｈ未加药）；３为２５　ｍｇ／Ｌ；４　为５０　ｍｇ／Ｌ；５为１００　ｍｇ／Ｌ；６为２００　ｍｇ／Ｌ。　Ｎｏｔｅ：Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｉｎｔｅｍａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ；２．Ｃｏｎｔｍｌ（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｄｍｇ　ｆｏｒ　２４　ｈ）；３．２５　ｍｇ／Ｌ；４．５０　ｍｇ／Ｌ；５．１００　ｍｇ／Ｌ；６．２００　ｍｇ／Ｌ．　臣２不同浓度ＥＧＣＧ诱导Ｈｅｐ—Ｇ２细胞时Ｃａｓｐａｓｅ－３　ｍＲＮＡ的　扩增结果　Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３　ｍＲＮＡ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｈｅｐ－Ｇ２　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕ￣ｉｏｎ　ｂｙ　ＥＧＣＧ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－　ｔｉｏｎｓ　Ｍ　】　２　３　４　５　６　２　０００　ｂｐ　注：Ｍ为ｍａｒｋｅｒ；１为内参；２为对照（２４　ｈ未加药）；３为６　ｈ；４为　１２　ｈ：５为２４　ｈ；６为４８　ｈ。　Ｎｏｔｅ：Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ；２．Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｄｒｕｇ　ｆｏｒ　２４　ｈ）；３．６　ｈ；４．１２　ｈ；５．２４　ｈ；６．４８　ｈ．　图３不同时间ＥＧＣＧ（１００　ｍｇ／Ｌ）诱导Ｈｅｐ—Ｇ２时Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｍＲＮＡ的扩增结果　Ｆｉｇ．３　Ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３　ｍＲＮＡ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｈｅｐ—Ｇ２　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＥＧＣＧ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　３讨论　实验用ＥＧＣＧ处理Ｈｅｐ—Ｇ　细胞，通过细胞形态学，流式　显著增加，其相应基因出现上调，这些凋亡通路关键酶的激　活可能是ＥＧＣＧ诱导Ｈｅｐ．Ｇ２细胞凋亡的重要原因。细胞凋　亡是基因介导的并具有新的蛋白质合成的程序性死亡，该研　究应用分子生物学技术发现不同浓度ＥＧＣＧ作用肝癌细胞　Ｈｅｐ．Ｇ，４８　ｈ后，同一浓度（１００　ｍｇ／Ｌ）的ＥＧＣＧ不同时间点　作用肝癌细胞Ｈｅｐ．Ｇ２后，Ｃａｓｐａｓｅ．３　ｍＲＮＡ表达水平明显增　强。Ｃａｓｐａｓｅ是一个含有半胱氨酸活性的胞浆蛋白酶家族，　与线虫细胞ｃｅｄ一３高度同源，迄今至少发现１４个成员。　Ｃａｓｐａｓｅ．３是目前发现的Ｃａｓｐａｓｅ成员中与ｃｅｄ．３同源性最高　的，是细胞凋亡过程中激活的关键酶，也是细胞凋亡的主要　效应分子　。Ｃａｓｐａｓｅ．３处于细胞凋亡的下游，经典的细胞　凋亡途径有２条，分别是细胞外途径（细胞表面死亡受体途　径）和细胞内途径（线粒体引发途径）。在细胞外途径中，死　亡信号的传导依赖于死亡配体与受体（如ＴＮＦ一和ＴＮＦＲ，　ＦａｓＬ和Ｆａｓ）的结合，接着死亡受体的死亡结构域（ＤＤ）与信　号传导分子（如ＦＡＤＤ）结合，而ＦＡＤＤ又可与Ｃａｓｐａｓｅ．８酶　原的ＤＥＤ相连接，形成死亡诱导信号复合物（ＤＩＳＣ），随之　Ｃａｓｐａｓｅ一８被激活。它通过裂解ＢＩＤ使线粒体释放细胞色素　Ｃ，或直接作用Ｃａｓｐａｓｅ　３及其他下游的Ｃａｓｐａｓｅ。Ｈａｓｃｇａｗａ　等研究发现，在Ｆａｓ介导肝癌细胞系凋亡过程中，Ｃａｓｐａｓｅ．３　活性增高，使用Ｃａｓｐａｓｅ一３抑制剂ＤＥＶＤ—ＣＨＯ能显著抑制　Ｃａｓｐａｓｅ　３的活化，藉此抑制Ｆａｓ介导的细胞凋亡　…。而ＩＣＥ　抑制剂ＹＶＡＤ－ＣＨＯ则不能抑制Ｆａｓ介导的细胞凋亡。提示　在Ｆａｓ介导肝癌细胞系凋亡过程中，主要起作用的是Ｃａｓｐａｓｅ　一３，而不是ＩＣＥ。在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，如　ＤＮＡ损伤素和ＡＴＰ耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素　Ｃ。细胞色素Ｃ、Ａｐａｆ　２１、ｄＡＴＰ和Ｃａｓｐａｓｅ一９酶原结合形成凋　亡复合体，Ｃａｓｐａｓｅ－９被释放并激活，接着下游的Ｃａｓｐａｓｅ－３等　激活降解底物使细胞凋亡。马朋等研究发现，合成花茄皂甙　通过上调细胞内细胞色素Ｃ的表达水平可激活Ｃａｓｐａｓｅ一３，　从而导致细胞凋亡　。以往的研究表明，Ｃａｓｐａｓｅ．３在多凋　亡诱导剂诱导肝癌细胞凋亡过程中活性增高。综上所述，　Ｃａｓｐａｓｅ一３是细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”蛋白酶，　起着非常重要的作用　。Ｃａｓｐａｓｅ．３在多因素诱导的肝癌　细胞凋亡中激活，抑制Ｃａｓｐａｓｅ一３活化和活性，能够抑制肝癌　细胞凋亡。然而，目前其活化分子机制尚不清楚，有待于进　一步研究，从而为以Ｃａｓｐａｓｅ一３为靶点的药物治疗提供坚实　的理论基础。　参考文献　［１］周薇，罗招阳，周秀田，等．表没食于儿茶素没食子酸酯诱导人胃癌　ＭＧＣ８０３细胞凋亡及机ｉ￣ｌＪ［Ｊ］．中国肿瘤，２００５，１４（１２）：８１１—８１４．　［２］ＫＩＭ　Ｙ　Ｃ，ＳＯＮＧ　Ｓ　Ｂ，ＬＥＥ　Ｍ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｃａｓｐａｓｅ．Ｉｎｄｅ—　ｐｅｎｄｅｎｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＬＰＳ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＲＡＷ２６４．７　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ—　ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２ＯＯ６，３３９（３）：１００７—１０１４．　［３］ＭＡＲＴＩＮ　Ｗ，ＪＵＬＩＡＳ，ＭＡＲＴＩＮ　Ｈ．Ｍｕｔｕａｌ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｓｔａｔｉｎ．ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｆｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｄｏｘｏｍｂｉｅｉｎ　ｌｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ１．Ｂｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏ１．２００４，１４３（６）：７１５—７２４．　（下转第９９９７页）　维普资讯 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３６卷２３期　李任峰等除草剂烟嘧磺隆对大鼠的肝脏毒性初步研究　９９９７　会效益；而另一方面，南除草剂所带来的环境污染和影响人　用，各项试验结果均为阴性，表明炯嘧磺隆无致突变作用。　类健康等问题也引起了世界各国的高度重视。因此，对除草　（５）肝脏是动物机体内的重要代谢器官，除草剂作为外　剂的残留分析及毒性研究显得尤为重要。　源性药物，在动物体内达到某种剂量后，将引起肝脏和其他　（２）磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的一类除　器官的损伤，肝脏独特的血管布局和分泌、合成、代谢功能决　草剂，它是由美国杜邦公司于２０世纪７０年代研究成功，８０　定其作为毒物作用的靶点　’。试验首次对烟嘧磺隆的亚慢　年发出来的高效、广谱、低毒、高选择性除草剂。其问世　性毒性进行研究。结果表明，中、低剂量烟嘧磺隆对大鼠肝　标志着除草剂进入超高效时代　。岳霞丽等报道，磺酰脲类　脏及血液常规均无明显影响，高剂量时动物肝脏表现出轻度　除草剂中大部分品种毒性较低，对人畜安全，而且在土壤中　病理性损伤。其更多的毒性机制尚需开展进一步毒理学　易通过化学方法和微生物而降解，不会在环境中长期滞　研究。　留　。　参考文献　（３）烟嘧磺隆系ｔ３本石原产业公司发现，１９８７～１９８８年　［１］ＭＵＲＡｌ　Ｓ，ＳＡＫＡＳＨＩＴＡ　Ｎ，ＨＯＮＤＡ　Ｃ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ，　与杜邦公司联合开发的磺酰脲类除草剂品种，在我国市场上　ｎｉｃｏｓｕｌｆｕｒｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，２５：３３２—３４２．　［２］刘永霞，张振玲，史岩，等烟嘧磺隆原药致突变实验研究［Ｊ］．中国职　流通已有１０余年　，因其活性高，田间使用量低，除草效果　业医学，２００３，３ｏ（１）：２３—２５，　好，对玉米生长安全，尤其是针对目前国内玉米田苗后除草　［３］刘祥英，柏连阳，磺酰脲类除草剂及其安全剂研究进展［Ｊ］，杂草科学，　２００５（１）：１—４，　剂种类缺乏，作为新产品的开发，具有良好的市场前景和经　［４］岳霞丽，张新薄，胡先文，等．磺酰Ｈ岛ｉ类除草剂在土壤中的环境行为　济效益，而愈来愈被许多农药生产企业及销售商所关注。　［Ｊ］，湖北农业科学，２００５（２）：６３—６５．　［５］苏少泉．烟嘧磺隆在我国的开发［Ｊ］，农药，２００３，４２（７）：５—８．　（４）烟嘧磺隆是一种弱酸，水中溶解度因ｐＨ不同而异，　［６］ＧＲＥＥＮ　Ｊ　Ｍ，ＨＡＩ　Ｅ　Ｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｐＨ　ｔｏ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏ—　与土壤中有机质亲和性低，易被黏土矿物严重吸附　。王全　ｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｎｉｃｏｓｕｌｆｕｌｏｎ［Ｊ］．Ｗｅｅｄ　Ｆｅｃｈ，２０Ｏ５，１９：４６８—４７５．　［７］王全凯　午建宁，李忠生，等．烟嘧磺隆的致突变性研究［Ｊ］．农药，２０Ｏ４，　凯等　采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ａｍｅｓ试验）、小　４３（７）：３０４—３０５．　鼠骨髓多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变　［８］袁伯俊，廖明阳，李波．药物毒理学实验方法与技术［Ｍ］．北京：化学工　业出版社，２００７：５１６．　试验、Ｖ７９细胞基因突变试验来检测烟嘧磺隆有无致突变作　（上接第９９０９页）　［Ｊ］．第四军医大学学报，２００６，２７（２２）：２０２３—２０２５　［４　ｌ　ＨＡＥ　ＪＥＯＮＧ　ＰＡＲＫ，ＤＯＮＧ—ＨＯＯＮ　ＳＨＩＮ．Ｅｐｉｇａ１ｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ　ｇａｌｌａｔｅ　ｒｅ－　【９　Ｉ　ＥＡＭＳＨＡＷ　Ｗ　Ｃ．ＭＡＲＴ１ＮＳ【　Ｍ，ＫＡＮＦＭＡＮＮ　Ｓ　Ｈ．ＭａｌＴｌｍａｌｉａ　ｃａｓｐａｓ—　ｄｕｃｅ　ｓｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ－　ｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．　ｅｎｃｅｓ，２００６，７８：２８２６　２８３２．・－　Ａｍｎｕ　Ｂｅｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９．６８：３８３—４２４．　［５］吕青，呈中，襄淑兰．ＭＴＩ＂法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的研　１　１Ｏ　ＨＡＳＣＧＡＷＡ　Ｊ，ＫＡＭＡＤＡ　Ｓ，ＫＡＮＦＵＫＥ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　究［Ｊ］．四川医学，２００１，２２（３）：２６９．　ＣＰＰ３２／Ｙａｎ＇Ｉａ（．１ｉｋｅ）ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎ　Ｆａｓ．ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　　ＩＪ　１．Ｃａｎｃｅ．　［６］ＨＡＮ　Ｈ，ＰＡＮ　Ｑ，ＺＨＡＮＧ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．４－ＮＱＯ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｖｉａ　ｐ５３－ｄｅ－　Ｒｅｓ，１９９６．５６（８）：１７１３—１７１８．　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｌａ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００６，１５：１５　１　［１１］马朋，曹同涛，顾国峰，等．合成紫仡茄皂甙诱导人肝癌细胞株Ｂｅ１．　１６３．　７４０２凋亡的作用机制［Ｊ］．癌症，２００６，２５（４）：４３８—４４２．　［７］吕军，杨连粤，杨建青．５一氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中　　１１２　ｌ　ＳＵＮ　Ｂ　Ｈ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ＇ｗＡＮＧ　Ｂ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓｉｓ　ｏｆｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ一３活性变化的研究［Ｊ］．中华实验外科杂志，２０００，１７（５）：　Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　４０１—４Ｏ２．　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ｐ２ｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ａｐｅｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，　［８］王新艳，李玉华，朱韫春，等．卵巢癌组织ＫＬ　Ｋ１１基因的表达意义　２Ｏｏｏ．６（３）：３５６—３６ｏ．