维普资讯 http://www.cqvip.com 第２１卷第４期 ２００２年７月 无锡轻工大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｕｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＶＯ１．２１ ＮＯ．４ Ｊｕ１． ２００２ 文章编号：１００９—０３８Ｘ（２００２）０４—０４２０—０４ 发酵液中辅酶Ｑｌ０的分离纯化和定量分析 吴祖芳１，２， 堵国 成 ， 陈坚 （１．江南大学生物工程学院，江苏无锡２１４０３６；２ 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁 波，３１５２１１） 摘 要：在辅酶Ｑ１０发酵菌体提取方法筛选的基础上，用薄层色谱（ＴＩ Ｃ）、紫外光谱（ｕＶ）结合高效 液相色谱（ＨＰＬＣ）方法对提纯样品进行定性和定量分析．试验结果表明：采用丙酮悬液超声处理， 有机溶剂革取５ ｈ，由薄层色谱结合紫外光谱法定量分析辅酶Ｑｌ０’得到较精确的结果，为发酵法生 产辅酶Ｑ１０的分离和测定提供了一种较有效的方法． 关键词：辅酶Ｑ１０；定量分析；鉴定 中图分类号：Ｑ ５５２ 文献标识码：Ａ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ１０ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＷＵ Ｚｕ—ｆａｎｇ 一，ＤＵ Ｇｕｏ—ｃｈｅｎｇ ， ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｅｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４０３６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ，Ｎｉｎｇｂｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｂｏ ３１５２１１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑｌ０ ｗａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａ１．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａ— ｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣｏＱｌ０ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＴＬＣ，ＵＶ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｅｒ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓ：ａｄｏｐｔｉｎｇ ａｃｅｔｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ５ ｈｏｕｒｓ， ｔｈｅｎ ａｎ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＴＬＣ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＵＶ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ．Ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｏｅｎｚｙｍｅＱ１０． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ１０；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 辅酶Ｑｌ０又叫泛醌、癸烯醌，是一类脂溶性醌类 溶解，熔点为４８．０～５０．０℃，相对分子质量８６３．４； 在动植物、微生物等细胞体内与线粒体内膜相结 合，是生物体呼吸链中重要递氢体．辅酶Ｑｌ０作为一 种多功能性的生化药物，在临床中有着广泛的用 化合物，化学名称为２，３ 二甲氧基一５一甲基一６一癸异戊 烯基苯醌．辅酶Ｑｌ０为黄色或橙黄色结晶性粉末， 无臭无味，不溶于水，在氯仿、苯、丙酮或石油醚中 收稿日期：２００２—０３—０５；修订日期：２００２—０５—２０． 作者简介：吴祖芳（１９６３一），男，浙江奉化人，发酵工程博士研究生，副教授 维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 吴祖芳等：发酵液中辅酶Ｑｌ０的分离纯化和定量分析４２１ 途ｕ’２ ；辅酶Ｑｌ０的生产方法主要有动植物组织提取 法，化学合成法和微生物发酵法；与其它制备方法 相比，微生物发酵法生产具有原料成本低、易控制 及可实现大规模生产的特点，能满足该药物在临床 上的需要． ２结果与讨论 ２．１辅酶Ｑｌｏ提取制备方法的确定 、 由于辅酶Ｑｌ０为细胞内物质，主要存在于细胞 内线粒体内膜上，其提取效果的好坏直接影响到产 品的纯度和得率．提取胞内醌类物质最常用的萃取 剂是有机溶剂 ，引．对菌体细胞采用１）甲醇与乙醚 体积比为２：１；２）异辛烷与异丙醇体积比为３：１；３） 甲醇与氯仿体积比为１：２；４）丙酮直接萃取；５）丙 酮悬液超声破碎等方法，结果见图１．试验结果表 明，甲醇与氯仿混合法抽提后易分多层，后续处理 困难，最后确定采用丙酮悬液超声处理法． 辅酶Ｑｌ。是微生物发酵的胞内产物，因此，发酵 产物辅酶Ｑｌ。必须经分离纯化．高效液相色谱分析 方法对样品要求较高，分析仪器昂贵且分析费时． 因此，需找到一种简便、准确且相对快速的测定发 酵液中辅酶Ｑ１。的方法．实验利用有机溶剂萃取、薄 层色谱分离及紫外分光光度法等方法分离和测定 辅酶Ｑ．。，为进一步大规模的发酵生产控制和成分 分析提供参考． １材料与方法 １．１仪器 摹 料 层析硅胶ＧＦ２５４．薄板（１０ ｃｍ×２０ ｃｍ）； ＥＺ５８５Ｑ冷冻干燥机：美国ＦＴＳ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ制造； 高速离心机；超声波细胞破碎仪；ＴＵ．１８００自动扫 描可见紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公 司制造；高效液相色谱仪：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｍｏｄｅｌ ＬＣ．６ＡＤ 型液相色谱仪． １．２主要试剂 无水乙醇，甲醇，丙酮，石油醚，氯仿，苯，乙醚， 莨 有机溶剂种类 图１不同溶剂处理方法对辅酶Ｑｌ。提取率的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｖｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ 己烷，异辛烷，异丙醇等均为分析纯． １．３样品 ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ＣＯ￣ｌＯ ２．１．１溶剂搅拌革取时间的确定冷冻干燥细胞 进１２１辅酶Ｑ１０标准品：Ｓｉｇｍａ公司产品，舟山海 力生制药公司惠赠． 经丙酮悬液超声处理后，在０．５，１，３，５，８ ｈ内进行 连续搅拌，比较提取效果，结果见图２．最后确定有 机萃取时间为５ ｈ． １．４辅酶Ｑｌｏ的制备 制备流程：发酵液（实验室制备，菌种Ｒｈｉｚｏｂｉ． ｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＷＳＨ２０６１） ６ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心分离 １５ ｍｉｎ一冷冻干燥一有机溶剂搅拌抽提一离心去除 菌体一减压蒸发干燥一残渣用少量石油醚萃取，收 集石油醚层减压浓缩再用水洗涤一无水硫酸钠干 料 莨 燥一定量无水乙醇溶解一薄层层析分离一刮下与 标准品同样Ｒ，值的斑点一石油醚抽提一蒸发干燥 一残余物用约０．５ ｍＬ乙醇溶解一低温保存待用． １．５辅酶Ｑｌｏ的分析方法 紫外分析法：在波长１９０～３００ ｎｍ下对待测定 样品进行紫外扫描，测定其最大紫外吸收波长，同 时在２７５ ｎｍ下进行定量测定． 图２有机溶剂萃取时间对辅酶Ｑｌ。提取率的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ＣｏＱ１ｏ ２．１．２ 提取温度对提取效果的影响采用常温、 高效液相色谱法：色谱柱为ＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂＣ１８（１０ ｃｍ×４．６ ｍｍ ＩＤ），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 ４０，６０℃进行提取，结果见图３．考虑连续保温处理 对有机溶剂挥发及目的组成可能造成的影响，最后 剂．以甲醇／无水乙醇（体积比为１：１）为流动相，柱 温３５℃，检测波长２７５ ａｍ，进样量２０ Ｌ． 确定有机萃取温度为常温（２５℃）结合间歇加热的 方法提取． 维普资讯 http://www.cqvip.com ４２２ 无锡轻工大 学 学报 第２１卷 以无水乙醇作空白，在１９０～３００ ｎｍ下紫外扫描， 爵 其紫外吸收曲线见图４． 餐 图３有机溶剂萃取温度对辅酶Ｑ】０提取效果的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆＣｏＱ１０ ２．２ ＴＬＣ．ｕｖ法测定辅酶Ｑｌｏ含量 ２．２．１ 薄层色谱法分离辅酶Ｑ１ｏ展开剂的选择 以氯仿与苯（体积比为ｌ：１）或石油醚与乙醚（体积 比为８：２）等为展开剂，以碘蒸汽为显色剂或直接在 遗 紫外光下显色，对辅酶Ｑ１ｏ样品粗提液进行薄层色 谱分离 ５，点样量５ Ｌ，标样参考质量浓度１００ ｇ／ｍＬ，将显示的斑点与标准品Ｒ ｒ值对照；同时， 配制质量浓度为１０～１５０ ｇ／ｍＬ的标准品系列溶 液，分别确定其最小检测质量浓度，结果见表１． 表１薄层色谱法展开剂的选择及最小检测质量浓度 波ｔ￣．．／ｎｍ Ｔａｂ．１ Ａ ｓｅｌｃｅｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ＴＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ 图４标准品（上图）及样品（下图）的紫外扫描吸收曲 ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 线图 已烷／－－乙醚氯仿／苯石油醚／乙醚苯／丙酮 Ｆ．喀．４ Ａ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｃａｒｖｅ ｏｆ ＵＶ ｓｃａｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ 展开剂 （体积比为 （体积比为 （体积比为（体积比为 ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ８５：１５） １：１）８：２） ９３：７） 从图４可以看出，经有机溶剂萃取和石油醚提 取得到的粗提液和辅酶Ｑ１。标样扫描峰形基本一 致，在（２０７±２）ｎｍ和（２７５±１）ｎｍ处有最大吸收， 且试样液在２７５ ｎｍ处峰位置发生偏离，还有一些 苯／丙酮经碘蒸汽和紫外光显色，无斑点；其它 小的杂质峰．这是由于试样经多种有机溶剂提取及 展开剂显色斑点大小与质量浓度高低并不相关，只 细胞内杂质的溶出，这些杂质在（２０７±２）ａｍ和 是色泽深浅与样品质量浓度有关，因此，需结合ＵＶ （２７５±１）ｎｍ附近有较大吸收的缘故．因此对粗提 法进行测定．根据Ｒ，值适宜取值范围和检测灵敏 品直接紫外定量测定会带来一定的误差，于是，通 度大小，选取氯仿和苯作为展开剂，进行ＴＬＣ分离 过薄层层析分离进一步提纯处理并结合紫外检测 分析． 来定量测定辅酶Ｑ１。的含量．方法如下：粗提品一点 ２．２．２紫外分光光度法标准曲线的制作精确称 样，在硅胶薄板上展开一刮下与标准品同样Ｒ，值 取辅酶Ｑｌ０标准品２０ ｍｇ，溶于无水乙醇并定容至 的斑点一目标物用少量石油醚洗提一旋转蒸发仪 ５０ ｍＬ，然后将此溶液分别稀释至一定体积，得到８， 干燥一残余物用约０．３ ｍＬ．乙醇溶解一样品，根据 ２０，４０，８０，１２０，１６０，２００ ｔＬｇ／ｍＬ等系列质量浓度， 收集样品质量浓度大小用酒精溶剂作适当稀释，在 在２７５ ｎｍ波长下测定吸光度，结果表明，辅酶Ｑ１０ ２７５ ｎｍ处测定吸光值． 在８０～１２０ ｇ／ｍＬ范围内线性关系较好，其回归曲 ２．３ ＴＬＣ．ｕｖ法与ＨＰＬＣ法测定结果比较 线方程为Ｙ＝５９．１１１ｚ一１．５７７ ５，相关系数Ｒ ＝ 对有机溶剂萃取、石油醚洗提和ＴＬＣ分离得到 ０．９９９ ６． 的提取物用一定量无水乙醇溶解后，进行ＨＰＬＣ法 ２．２．３ 辅酶Ｑｌｏ的紫外吸收曲线比较及定量方法 测定，并与上述实验结果比较，见表２． 的确立 由ＴＬＣＵｖ法测得的辅酶Ｑｌｏ质量浓度为 经上述方法制备的辅酶Ｑ１。样品，对照标准品， ＨＰＬＣ法的９２％，可能是由于用ＴＬＣ法展开得到 维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 吴祖芳等：发酵液中辅酶Ｑ１０的分离纯化和定量分析４２３ 的斑点在再洗提过程中部分损失的缘故． 表２辅酶Ｑｌ。两种测定方法比较 Ｔａｂ．２ Ｒｅｓｕｌｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ 进一步对测定样品加０．０１ ｍＬ硼氢化钠溶液还原 处理，在同样色谱条件及波长下检测，在原保留时 间处目的物吸收峰消失，证实为辅酶Ｑ１０． ２５ ＼∞ ａ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑｌｏ 方法 辅酶Ｑｌ０的质量浓度／（ｔ￣ｇ／ｍＬ） ８０．１ ２０ ａ ＿ ● ＴＬＣＵＶ法 ＨＰＬＣ法 ｏｏ 恒１ ５ ＿ 一 Ｉｎ ８７．３ 磐 １０ ＿● Ｊ ｙｎ ，、 Ｉ １０ １ ５ ２０ ２５ 保留时间／ｍｉｎ 图６试样（粗提品）高效液相色谱分析色谱图 Ｆｉｇ．６ Ａ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ３ 小 结 １）通过比较辅酶Ｑｌ０的提取分离方法，确定在 ６ ０００ ｒ／ｒａｉｎ的条件下转１５ ｒａｉｎ的方法收集对数生 长期的菌体；采用丙酮悬液超声处理法，萃取时间 为５ ｈ． ２）分离提取过程中要避免辅酶Ｑｌ０的氧化破 图５标样（２００ ＩＷ，／ｍＬ）高效液相色谱分析色谱图（检 测波长２７５ｎｍ） Ｆｉｇ．５ Ａ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ 坏。尤其在碱性条件下，必要时应加抗氧化剂，如焦 性没食子酸；待测样品要新鲜或经适当低温保存处 理．通过比较不同有机溶剂对浸提收率的影响，选 择毒害相对小、成本低、提取率较高的浸提方法；通 过ＨＰＬＣ分析方法鉴定证实，确定了较理想的发酵 产品辅酶Ｑｌ０的分离提取方法． ３）ＴＩ ＧＵｖ法与ＨＰＩ Ｃ定量分析法相比，具有 方法较简便，操作时间短，成本低，相对误差较小， 由图５，６可看出，辅酶Ｑｌ０标样和样品色谱峰 图中保留时间均为２０．６ ｒａｉｎ．用该辅酶Ｑｌ０的提取 方法分离的样品液经层析后，采用ＨＰＬＣ检测发现 杂质种类很少，对辅酶Ｑｌ０的测定没有干扰．另外， 通过改变检测波长，在２０６ ｎｍ下对标准样及试制 样品进行ＨＰＬＣ检测，结果得到在保留时间２０．６ 样品处理简单，是一种较实用的辅酶Ｑｌ０定量测定 方法． ｍｉｎ处标样和试样有一个主峰，证明为同一种物质． 参考文献： ［１］吴祖芳，翁佩芳，陈坚．辅酶Ｑｌ０的功能研究进展［Ｊ］．宁波大学学报，２００１，２：８５—８８． ［２］ＭＯＲＴＥＮＳＥＮ Ｓ Ａ，ＶＡＤＨＡＮＡＶＩＫＩＴ Ｓ，ＦＯＬＫＥＲＳ Ｋ．Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑｌ０ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆａｉｌｕｒｅ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐｔｌ Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ，１９８４，（７）：４９７—５０２． ［３］ＫＲＩＶＡＮＫＯＶＡ Ｌ，ＤＡＤＡＫ Ｖ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，１９８０． ［４］王春林．中国大豆辅酶Ｑｌ０的提取、分离与鉴定［Ｊ］．中国医药工业杂志，１９９６，２７（３）：１０２—１０４． ［５］庄晓雷，于树宏．ＴＬｃ紫外分光光度法定量测定紫杉醇［Ｊ］．生物技术，２００１，１１（１）：４５—４７． ［６］ＭＩＫＡＴＡ Ｋ，ＹＡＭＡＤＡ．Ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈａｓｅｇａｗａｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｙｕｋａｗ ｅｔ Ｍａｋｉ）Ｙａｍａｄａ ｅｔ Ｂａｎｎｏ：Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＩＦＯ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ，１９９９，１９：４ １—４６． （责任编辑：李春丽）
